1

pH Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS

Todos los organismos cuyas reacciones bioquímicas ocurren en medio acuoso funcionan
a valores muy restringidos de pH. A nivel molecular, la mayoría de los procesos
biológicos ocurren a pH entre 6 y 9. Ciertos grupos funcionales presentes en las
moléculas biológicas pueden comportarse como ácidos o bases débiles. Por ello su
estado de ionización dependerá de la concentración de protones del medio. Si se tiene
en cuenta que la mayoría de las enzimas van a presentar este tipo de grupos ionizables
en su centro activo, se comprenderá el importante papel que puede tener una pequeña
fluctuación del pH celular. Tanto en el medio intracelular como extracelular será por lo
tanto imprescindible una regulación del pH para que las moléculas puedan operar de
manera óptima.

jugo normal
tiobacilos gástrico 6.6 bacterias 8.2 hongos

0 1.2-1.5 7.35-7.45 11 14

exceso de H+ déficit de H+

7.3 C acidosis alcalosis C 7.45

metabólica metabólica
7.1 D
D 7.6
puede ser puede ser

7.3 C C 7.45
respiratoria respiratoria
7.1 D D 7.6

La acidosis respiratoria ocurre cuando el pH sanguíneo baja como resultado de una

disminución de la respiración. Si se restringe la respiración, la [CO 2] disuelto aumenta haciendo
más ácida la sangre. Esta condición aparece en casos de asma, neumonía, enfisema e inhalación
de humo. La acidosis metabólica ocurre por una disminución del pH sanguíneo por liberación
de excesivas cantidades de sustancias acídicas en la sangre. Se genera cuando se somete al
cuerpo a una actividad física prolongada y extenuante, cuando se es diabético o cuando se
restringe el consumo de alimentos. La respuesta normal del cuerpo ante esta condición es
aumentar la frecuencia respiratoria a fin de disminuir la cantidad de dióxido de carbono disuelto
en sangre. Si se produce más CO 2 que el que se puede eliminar, el pH disminuirá
significativamente comprometiendo la vida.
La alcalosis respiratoria resulta de una respiración excesiva que provoca un aumento en el pH
sanguíneo. La hiperventilación hace que mucho CO 2 disuelto sea removido de la sangre, que
disminuya la concentración de ácido carbónico y que, como consecuencia, el pH aumente. A
menudo, la persona hiperventilada se desmaya para desacelerar su respiración. La alcalosis
metabólica es un aumento del pH sanguíneo por la liberación de equivalentes alcalinos en la
sangre o por la pérdida de equivalentes ácidos. A veces es causada por ingesta de sustancias
alcalinas o por el abuso de diuréticos.
 2

¿Cómo se controla el pH fisiológico?

A) Eliminando o reteniendo metabolitos

Si hay El pH debe Para lograrlo

pulmón elimina CO2
ACIDOSIS Subir riñón elimina H+
riñón retiene HCO3-
pulmón retiene CO2
ALCALOSIS Bajar riñón retiene H+
riñón elimina HCO3-

B) Activando reacciones que producen (en caso de alcalosis) o consumen (en

caso de acidosis) protones.

C) Usando amortiguadores biológicos (vea al final de este material)

ácido pKa
conjugado base conjugada mmol/l sangre
6.1
CO2 + H2O HCO3- + H+ 24

7.4
HPr Pr- + H+ 15
6.2 7
HHb Hb- + H+
7.7
7.2 2
H2PO4- HPO42- + H+

en caso de alcalosis

en caso de acidosis

PREPARANDO AMORTIGUADORES
En las reacciones bioquímicas participan muchas biomoléculas (carbohidratos, lípidos,
proteínas y ácidos nucleicos) cuya estructura y función se ven afectadas por cambios
bruscos en el pH de la solución. El uso de amortiguadores permite mantener el pH de la
solución dentro de un rango que no comprometa la actividad de dichas biomoléculas.

La mayoría de los buffers usados en bioquímica son pares conjugados de ácidos y bases
débiles. La relación matemática más útil para cálculos previos es la ecuación de
Henderson y Hasselbalch:

-
pH = pKa + log A
HA
 3

Si el pH > pKa, la relación molar más conveniente es

A- pH - pKa
= 10
HA

Si pKa > pH conviene usar

HA pKa - pH
= 10
A-

en donde HA es la concentración del ácido conjugado y A- es la concentración de la

base conjugada, una vez alcanzado el equilibrio.

El valor ideal o termodinámico es el pKa que se calcula usando actividades. El valor

práctico o pKa' se calcula a partir de concentraciones molares y debe corregirse cuando
hay diferencias considerables de fuerza iónica (μ) o de temperatura de acuerdo a las
siguientes relaciones matemáticas:

´ 0.509(2n + 1)(  )1/2

pK a = pKa - - 0.1
1/2
1 + ( )

donde n es el número de cargas en el ácido conjugado. pK´a se aproxima al pKa si la

fuerza iónica se aproxima a cero.

pK´a = pKa + ( pKa/°C)(Tensayo - Testándar)

EJERCICIO 1

Describa la preparación de 50 ml de MES a pH 7.4 y 0.03 M para usarlo a 42°C

partiendo de:
a) Mezcla de MES ácido con MES básico ó
b) Neutralización de MES básico con HCl concentrado (37% , 1.18 g/ml) ó
c) Neutralización de MES ácido con NaOH 0.62 N
d) Calcule la fuerza iónica de la solución.
e) Evalúe su eficiencia si se usara en una reacción que produce 1.5 x 10-4M de H+
f) Evalúe su eficiencia si se usara en una reacción que consume 3.0 x 10-2M de H+
 4

Caso a

1. Ecuación química involucrada: mezcla de ambas especies hasta lograr el

equilibrio.

MES+ MES°
(HA) (A-)

2. Moles totales ( total) del buffer:  HA +  A-

 total = (Vt)(Mt) = (0.05 litros)(0.03 mol/l) = 1.5 x 10-3 mol

3. Corrección del pKa. Debe hacerse por dos razones: a) El buffer será usado a
una temperatura (42°C) diferente a la cual fue estandarizado (20°C) y b) MES
sufre alteración considerable en su equilibrio al cambiar la temperatura del
sistema. Busque datos de temperatura, pKa y otros en la tabla adjunta.

pK'a = pK°a + (  pKa/°C)(Tens - Tstd) = 6.15 + (-0.011)(42 - 20) = 5.908

4. Razón molar de las especies conjugadas de MES.

Dado que pH > pKa, conviene calcular la relación:

MES°
Razón molar = A -
/ HA = = 107.4 - 5.908 = 101.492 = 31.05 / 1
MES+

El total de partes en el sistema es 31.05 + 1 = 32.05.

5. Fracción molar de cada componente (xespecie). Este dato permite calcular los
moles, la molaridad y el porcentaje de cada componente:

xMES = 31.05 / 32.05 = 0.9688

xMES+ = 1 / 32.05 = 0.0312

6. Moles de cada componente ( especie). Es la fracción molar de cada componente

multiplicada por los moles totales del buffer.

 MES = xMES x  total = (0.9688)(1.5 x 10-3 mol) = 1.45 x 10-3 mol

 MES+ = (0.0312)( 1.5 x 10-3 mol) = 4.68 x 10-5 mol

 5

7. Molaridad de cada componente. Es la fracción molar de cada componente

multiplicada por la molaridad total del buffer. Se calcula sólo si se evaluará la
capacidad amortiguadora y/o la fuerza iónica de la solución.

MES° = (0.9688)(0.03 M) = 2.91 x 10-2 mol/l

MES+ = 0.0312 (0.03 M) = 9.36 x 10-4 mol/l

8. Cantidades a medir de cada componente.

a. MES° = (1.45 x 10-3 mol)(195.2 g/mol) = 0.2830 g

b. MES+ = (4.68 x 10-5 mol)(231.7 g/mol) = 0.0108 g

9. Descripción. Mezclar 0.2830 g de MES básico con 0.0108 g de MES ácido en

un frasco volumétrico de 50.00 ml. Con adiciones parciales de agua desionizada
y agitaciones para homogeneizar, aforar hasta la marca. Si el pH-metro no
muestra 7.4 ajuste a este valor adicionando cuidadosamente solución diluida de
NaOH o de HCl, según se requiera.

Caso b

1. Ecuación química involucrada. Es una neutralización de MES básico con HCl

concentrado:

MES° + HCl MES+ + Cl-

(A-) (HA)

Se repiten los cálculos realizados en los numerales del 2 al 7 del caso a.

8. Cantidades a medir.
a. MES° = ( total )(195.2 g/mol) = 0.2928 g.
Nota: Siempre que se prepare un buffer por neutralización, la especie
que sirve de punto de partida, (MES° en este caso), requiere moles
totales.

b. HCl =  MES+ = 4.68 x 10-5 mol (36.45 g/mol)(100 g/37 g)(1 ml/1.18 g)
= 3.91 x10-3 ml = 3.91 . (1 ml = 1000 )

9. Descripción. Mezclar 0.2928 g de MES básico con 3.91  de HCl concentrado.

Con adiciones parciales de agua desionizada y agitaciones para homogeneizar,
 6

aforar hasta la marca. Si el pH-metro no muestra 7.4 ajuste a este valor

adicionando cuidadosamente solución diluida de NaOH o de HCl, según se
requiera.

Desarrolle los pasos 1, 8 y 9 basándose en los datos generados en los casos anteriores.

Caso d

1.- La fuerza iónica (μ). Se calcula de acuerdo a la siguiente ecuación en donde

“C” es la concentración molar de cada especie con carga eléctrica y “Z” es la
carga eléctrica del ion respectivo. Recuérdese que sólo las especies cargadas
eléctricamente aportan a la fuerza iónica.

 = 1/2 C Z 2
= 1/2 MES+ x (+1)
2 = 1/2 9.36 x 10-4 x 1
-4
= 4.68 x 10 mol/l

Caso e

Cuando la reacción produce protones (pHinicio > pHfinal) se utiliza la capacidad

amortiguadora en la dirección ácida (a ó H+) para evaluar si el buffer amortigua o
no.
-2 -4
9 A- HA 9 (2.91 x 10 )(9.36 x 10 )
 = 10 HA + A-
=
10 (9.36 x 10-4) + (2.91 x 10-2)
= 6.36 x 10-3 mol/l

 6.36 x 10-3 mol/l

Eficiencia relativa = = = 42.4*
H +
producidos 1.5 x 10-4 mol/l

(*) Dado que la eficiencia relativa es mayor que 2, el buffer es excelente pero está
muy concentrado para esta reacción que produce protones (en la dirección ácida).
Lo recomendable es diluirlo hasta 42.4/2 ó 21.1 veces la concentración actual. La
concentración recomendada sería (0.03 mol/l)/(21.1) = 1.42 x 10-3 mol/l.

Caso f

Cuando la reacción consume protones (pHinicio < pHfinal) se utiliza la capacidad

amortiguadora en la dirección básica (b ó OH-) para evaluar si el buffer amortigua o
no.
 7

-2 -4
b =
9 A- HA
10 A- + HA
=
9 (2.91 x 10 )(9.36 x 10 )
-2) + (9.36 x 10-4)
= 8.42 x 10-4 mol/l
10 (2.91 x 10

b 8.42 x 10-4 mol/l

Eficiencia relativa = = = 0.028*
H+ consumidos 3.0 x 10-2 mol/l

(*) Dado que la eficiencia relativa es menor que 2, el buffer no funcionará porque
está muy diluido para esta reacción que consume protones (en la dirección básica).
Lo recomendable es concentrarla hasta 2/0.028 ó 71.4 veces la concentración actual.
La concentración recomendada sería (0.03 mol/l) (71.4) = 2.14 mol/l.

LOS AMORTIGUADORES BIOLÓGICOS (AB)

El pH dentro y fuera de las células se mantiene en valores muy restringidos gracias a

varios mecanismos, entre ellos:
1. La eliminación y/o retención de equivalentes ácido-básicos vía pulmón y/o
riñón.
2. Activación/desactivación de procesos bioquímicos que conducen a la producción
y/o consumo de protones (H+).
3. La intervención de amortiguadores biológicos que donan o neutralizan protones
cuando el medio así lo requiere.

A nivel molecular, la mayoría de los procesos bioquímicos ocurren a pH entre 6 y 9.

Los AB son muy utilizados en bioquímica, biotecnología, biología celular y molecular y
en muchas técnicas analíticas como cromatografía, electroforesis, espectrofotometría,
espectroscopia, polarimetría y diluciones radio isotópica.

FOSFATOS: Opera en el fluido celular de todas las células con un rango útil de pH
entre 6.2 y 8.2. Su pKa en condiciones fisiológicas es 7.21. En el fluido celular las
reacciones se dan a pH entre 6.9 y 7.4.

H2PO4- HPO42- + H+

CARBONATOS: Sistema abierto que opera en el plasma sanguíneo con un pKa de 6.1.
Los componentes de este sistema pueden eliminarse o retenerse a través del pulmón
(CO2(g)) o del riñón (H+ y HCO3-). A pH 7.4, la concentración total de carbonatos es 2.52
x 10-2, la [HCO3-] es 0.024 molar y la [CO2(ac)] es 0.0012 M. La [CO2(ac)] = k x P en
donde k es 3.01 X 10-5 (en M/mmHg) y P es la presión parcial del CO 2 (en mmHg)
disuelto en sangre. A pH fisiológico, la RM de [HCO3-] / [CO2(ac)] es de 19.95/1 ≈ 20/1.

HCO3- + H+ [H2CO3] CO2(ac) CO2(g)

 8

Cada vez que por metabolismo degradativo se producen protones, éstos son
neutralizados por el bicarbonato y el CO2 producido en exceso es eliminado hasta que
su valor es igual a [HCO3-]eq/RM. Si por metabolismo se liberara 0.006 M de H + en
sangre, al intervenir el sistema de carbonatos, el pH resultante sería 6.5 (si el sistema
fuera cerrado) o 7.4 (si el sistema es abierto).

PROTEÍNAS: Los sistemas proteicos son los amortiguadores más efectivos porque su
pKa está cercano a 7.4 como resultante del aporte de varios pKa´s asociados a
aminoácidos ionizables como Asp, Glu, Lis, His y Arg. El aporte más significativo se
atribuye al equilibrio de residuos de histidina (His) con un pKa de 6.0

La proteína más estudiada como sistema amortiguador es la hemoglobina en sus

diferentes formas (Hb, HHb+, HHbO2+ y HbO2). La forma Hb recoge protones en la
periferia del cuerpo en base al pH del medio por donde circula. Entre más bajo el pH,
más protones recoge y mayor porción de HHb+ llega al pulmón. En el pulmón, debido
a la alta presión de oxígeno presente, la HHb+ se oxigena convirtiéndose en HHbO2+,
estructura altamente inestable que rápidamente se estabiliza eliminando el protón y
convirtiéndose en HbO2. En la periferia, la baja presión de oxígeno obliga a la HbO2 a
ceder el O2 (transformándose en Hb) para la oxidación de nutrientes hasta HCO 3- y H+.
El HCO3- continúa en circulación pero el H+ es recogido por Hb y soltado en el
pulmón por la HHbO2+. En el pulmón, el H+ es neutralizado por el HCO3- circulante y
eliminado como CO2(g). Ver esquema:

O2
pKa1 = 7.71 - 8.18
pKa2 = 6.17 - 6.68
HHb+ HHbO2+

pKa1 pKa2
H+ + HCO3- CO2(ac) CO2(g)
puede eliminarse
por el pulmón
HbO2
Hb

O2
protón circula hasta el
Nutrientes
recogido por Hb pulmón para
neutralizar el H+

CO2(ac)

-
H+ + HCO3
puede eliminarse
por el riñón
La hemoglobina que ingresa al pulmón responde al equilibrio de Hb y HHb +, mientras
que la saliente del pulmón hacia la periferia es un equilibrio de HHbO 2+ y HbO2. ¿Cuál
 9

es el porcentaje de estos metabolitos al entrar y salir del pulmón en una persona con pH
fisiológico normal de 7.42, en estado de coma acidótico con pH 6.9 o con alcalosis
descompensada con pH 7.8?

GUIA DE EJERCICIOS 1

1.Una muestra de 500 mL de formiato 0.1 M pH 3.75se trata con 5 mL de KOH 1M.
Calcular el nuevo valor de pH, considere con pka de 3.75.
2.Describa la preparación de 2L de un buffer de glicina 0.1M pH 9.00 a partir de glicina
(PM 75.07) y NaOH 1M, considere un pka de 9.60.
3.Describa la preparación de un buffer de fosfato 0.1M pH 6.7 a partir de ácido
fosfórico 1M e hidróxido de sodio sólido.
4.Se preparó un buffer de MOPS disolviendo 5.7 mmol de MOPS ácido, 4.2 mmol de
MOPS base y 8.765 g de NaCl. Se aforó hasta 100 ml con ddH2O. De inmediato se hizo
una dilución de 1:25. Para la solución final, calcule:
a. La molaridad del buffer b. El pH
c. La fuerza iónica total. d. Si la μ en el organismo es 0.154 M,
¿convendría administrar este buffer a un paciente para equilibrarle un
desbalance ácido-base. ?
5.Describa la preparación de 50 ml de un amortiguador de HEPES 0.05M, pH 7.42
partiendo de HEPES ácido (238.31 g/mol) y NaOH 0.1N. El amortiguador será usado a
42°C para una reacción cuyo pH final es 7.38. Evalúe su eficiencia

6. El plasma sanguíneo contiene 0.0252M de carbonatos totales. Calcule:

a. La relación porcentual de HCO3- a CO2 disuelto.
b. pH final si 0.01 M de H+ se adicionan al medio y el CO2 formado:
i. no se libera
ii. sí se libera
c.- Concentración de CO2 liberado para equilibrar el pH.

7.Calcular la relación porcentual de HPO4-2/H2PO4-1 , pka 7.2 en las siguientes

condiciones:
a. en sangre pH 7.4
b. en orina pH 7.2
c. en orina pH 6.2

8. El análisis de una muestra de sangre a 250C indica que el pH es 7.4 y la concentración

de ácido carbónico es 0.0025M con un pka de 6.35. Calcule la concentración de su base
conjugada

ALGUNOS AMORTIGUADORES DE USO COMUN EN BIOQUIMICA

(Valores de pKa estandarizados a 20 °C)
 10

COMPUESTO PM pKa_1 pKa_2 pKa_3 RANGO ΔpKa/°C

ACES 182.2 6.9 6.2-7.4 -0.02
ADA 190.17 6.6 6.0-7.4 -0.011
AMP 9.8 9-10.5
AMPSO 9 8.3-9.8
ASCORBICO 176.12 4.1
BARBITURICO 128.09 3.98
BES 213.25 7.15 5.4-7.8 -0.027
BICINA 163.18 8.35 7.6-8.9 -0.018
BISTRIS 209.24 6.46 5.7-6.2
BISTRIS PROPANO 6.8 9 6.3-9.7
CAPS 221.32 10.4 9.8-11.1 0.032
CAPSO 9.6 8.8-9.3
CARBONICO 62 6.1 -0.009
CHES 9.3 8.5-10 -0.011
CHOLAMINE 156.69 7.1
CITRICO 192.12 3.06 4.54 5.4 -0.0016
DIPSO 7.6 7-8.4
EDTA 292.24 2.6 6.3 10.6
ENDCA 183.62 7
EPPS 252.23 8 7.2-8.8
FOSFORICO 98 2.12 7.21 12.32 -0.0028
FUMARICO 116.07 3.03 4.47
GLICEROFOSFATO 172.08 1.47 6.19
GLICINA 75.07 2.34 9.6 -0.026
GLICINAMIDA 74.04 8.4 -0.029
HEPES 238.31 7.55 6.8-8.4 -0.014
HEPPSO 7.8 7.2-8.6 -0.011
HISTIDINA 155.16 9.17
LACTICO 90.08 3.86
MALONICO 146.02 2.85
MES 195.2 6.15 5.5-6.7 -0.011
MONOTRIS 165.18 7.83
MOPS 209.27 7.2 6.5-7.9 -0.011
PIPES 302.37 6.8 -0.0085
PIRIDINA 79.1 5.23
SALICILICO 138.12 2.98
TAPS 243.3 8.4 7.7-9.2 0.018
TARTARICO 150.09 3.02 4.54
TEA 7.8 7.4-8.3
TES 229.28 7.5 6.8-8.3 -0.02
TRICINA 180.18 8.15 7.5-8.9 -0.021
TRIS 121.14 8.1 -0.031

CAPSO: Acido 3(ciclohexilamino)-2-hidroxi-1-propanosulfónico

En NEGRITA y cursiva: de uso biológico