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La evidencia previa ha indicado un aumento del riesgo de cáncer en personas con diabetes
mellitus (DM). El objetivo de este estudio fue investigar la relación entre la DM (glucosa alta) y
el carcinoma de células escamosas de la lengua (TSCC) y la forma en que la glucosa mediaba el
potencial metastásico del TSCC. La relación entre DM y TSCC se evaluó en un estudio
retrospectivo. El papel y su mecanismo de alta glucosa en la proliferación, el potencial
metastásico de TSCC se investigaron in vitro e in vivo. La tasa de prevalencia de DM en pacientes
con TSCC fue 12.84%, que fue significativamente más alta que eso (9.7%) en la población general
en China. Aunque no se observaron diferencias significativas en la tasa de supervivencia general
(SG), los pacientes con TSCC con DM tienen un aumento de 1,38 veces en el riesgo relativo que
afecta la SG a 5 años en comparación con los pacientes sin DM. La glucosa alta aumentó la
proliferación de células TSCC, la migración, la invasión y la expresión de PKM2 (piruvato quinasa
M2) regulada positivamente. Mientras que, este efecto fue abolido después de la caída de PKM2
en células TSCC. La alta glucosa promovió el crecimiento tumoral y la metástasis pulmonar de
TSCC en un modelo animal de DM. Nuestros resultados confirman que la DM es un factor de
riesgo para el desarrollo de TSCC. La glucosa alta mejora el potencial metastásico de TSCC a
través de la estimulación de la vía PKM2.
INTRODUCCIÓN
La diabetes mellitus (DM) es una de las enfermedades crónicas más comunes en casi todos los
países. En 2010, la tasa de prevalencia mundial de la diabetes entre los adultos (entre 20 y 79
años) fue del 6,4% [1]. Un estudio nacional entre adultos chinos reveló que la prevalencia
estandarizada por edad y sexo de diabetes y prediabetes totales (es decir, alteración de la
glucosa en ayunas o tolerancia alterada a la glucosa) fue de 9.7% y 15.5%, respectivamente [2].
Estos hallazgos indican la importancia de la diabetes como un problema de salud pública. La
evidencia epidemiológica reciente sugiere que la DM puede contribuir al inicio y la propagación
de ciertos cánceres [3]. De hecho, las personas con diabetes tienen una probabilidad
significativamente más alta de desarrollar una variedad de cánceres que incluyen cáncer de
hígado, páncreas, colorrectal y de mama [4-7]. Los estudios epidemiológicos también han
implicado a la DM como un factor de riesgo para el desarrollo del carcinoma oral de células
escamosas (OSCC) [8], pero no está claro si la DM afecta la progresión y el pronóstico del
carcinoma escamoso de la lengua (TSCC).
La DM es un estado fisiopatológico del estrés oxidativo y el daño del ADN que puede conducir a
diversos tipos de mutaciones, que luego causan aberraciones en las células y un mayor riesgo
de cáncer [9]. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares subyacentes del desarrollo
tumoral mediado por DM siguen sin estar claros. La hiperglucemia (glucosa alta), un rasgo
característico de la DM, se ha demostrado que contribuye a un mayor riesgo de cáncer [10].
Encontraron que la hiperglucemia en pacientes con cáncer contribuye a una mayor probabilidad
de recurrencia del tumor y metástasis [10]. Se han realizado muchos esfuerzos para descubrir el
mecanismo de cómo la hiperglucemia mediada proliferación y metástasis en el cáncer [11, 12].
La investigación reciente encontró que la hiperglucemia induce la expresión de la enzima
glucolítica HK2, que aumenta la metástasis del cáncer [13]. PKM2 (piruvato quinasa 2), otra
enzima glucolítica clave, se había revelado que desempeña un papel importante en el
metabolismo del cáncer, el crecimiento tumoral, la invasión y la metástasis [14, 15]. En nuestros
estudios previos, demostramos que la desregulación de PKM2 desempeña un papel importante
en pacientes con TSCC. La sobreexpresión de PKM2 se asocia con metástasis ganglionares
cervicales y un pronóstico desfavorable en pacientes con TSCC. PKM2 mejora el potencial
metastásico de TSCC a través de la vía SOD2-H2O2 [16].
Para investigar más a fondo la relación entre la DM (glucosa alta) y TSCC y su mecanismo de
cómo la glucosa alta media la metástasis de TSCC. Analizamos la relación entre DM y TSCC en un
estudio retrospectivo. Luego, investigamos el papel de la glucosa alta en el potencial metastásico
del TSCC in vitro e in vivo. Finalmente, analizamos el mecanismo de cómo la glucosa alta media
la metástasis en TSCC. Encontramos una alta tasa de prevalencia de DM en pacientes con TSCC.
La glucosa alta mejora el potencial metastásico de TSCC a través de la estimulación de la vía
PKM2.
RESULTADOS
En total, 501 pacientes con TSCC se incluyeron en este estudio retrospectivo. Como se muestra
en la Tabla 1, la tasa de prevalencia de DM fue del 13,97% y la tasa de prevalencia de IFG
(alteración de la glucosa en ayunas) fue del 20,76%. La tasa de prevalencia según la tasa de
prevalencia estandarizada (SPR) ajustada por edad y sexo de la DM en pacientes con TSCC fue
12.84%, y la SPR de IFG fue 18.88%. Los SPR de DM e IFG en TSCC fueron significativamente más
altos
(P <0.001) que aquellos en la población general china, en los que los SPR fueron 9.7% y 15.5%
para DM e IFG, respectivamente. Excepto por el sexo, no se encontraron diferencias
significativas en cuanto a la edad, el tamaño del tumor, la metástasis a los ganglios linfáticos, el
estadio clínico o el grado histológico entre los pacientes con TSCC con y sin DM
(SupplementaryTable 1). Aunque no se observaron diferencias significativas en la tasa de
supervivencia general (SG) entre los pacientes con DM y sin DM con TSCC, el grupo sin DM
mostró una mejor tendencia de supervivencia que el grupo con DM (datos no mostrados).
Además, la regresión de Cox reveló que los pacientes con TSCC con DM tienen un aumento de
1,38 veces en el riesgo relativo que afecta la SG a 5 años en comparación con los pacientes sin
DM (Tabla 2).
La glucosa alta promueve la proliferación, la migración y la invasión de TSCC a través del PKM2
Pathway.
Para investigar más a fondo si la glucosa alta mediada por el potencial metastásico de TSCC a
través de la vía PKM2 (enzima glucolítica), hemos detectado patrones de expresión génica por
microarrays. Como se muestra en la Figura 2A, el análisis de ontología génica (GO) reveló que
14/40 del gen relacionado con glicólisis (GO0006096, glucólisis) estaban regulados
positivamente en células TSCC cultivadas en glucosa 16,7 mM (glucosa alta) en comparación con
las cultivadas en glucosa 5,6 mM ( glucosa normal), incluidos PKM2, HK1 y LDHA. La expresión
de SOD2 (GO0000302, respuesta a especies de oxígeno reactivas, Figura 2B), Slug (GO0001837,
transición epitelial a mesénquima, Figura 2C) también se encontró regulada positivamente en
células de TSCC cultivadas con glucosa alta (16.7 mM) que en glucosa normal ( 5.6mM) células
TSCC cultivadas. Luego, desmontamos la expresión de PKM2 (Figura 3A) en células TSCC
cultivadas con glucosa alta (16,7 mM). Las habilidades de migración (Figura 3B) e invasión (Figura
3C), capacidad de proliferación (Figura 3D), actividad de SOD2 (Figura 3E) y producción de H2O2
(Figura 3F) se inhibieron significativamente en células TSCC cultivadas con glucosa alta después
de la PKM2 desmontable. Los niveles de expresión de proteínas relacionadas con metástasis
(pERK1 / 2, Slug y Vimentin) y SOD2 también se redujeron claramente, mientras que los niveles
de proteína E-cadherina obviamente aumentaron después de la caída de PKM2 en células TSCC
cultivadas con glucosa 16,7 mM (Figura 3A) .
Para confirmar aún más el papel de la glucosa alta en el crecimiento y la metástasis de células
TSCC in vivo, se examinaron el crecimiento y la metástasis de tumores de xenoinjerto en ratones
atímicos. Las células CAL27 se inocularon por vía subcutánea en ratones atímicos con o sin DM
(glucosa alta). Como se muestra en la Figura 4A-B, el crecimiento tumoral fue significativamente
más lento en el grupo no DM en relación con el grupo DM. Los tiempos de duplicación del tumor
fueron 1.3 días (grupo DM) y 1.9 días (grupo no DM), respectivamente. La expresión de PKM2
obviamente aumentó en xenoinjertos del grupo DM (Figura 4C) en comparación con el grupo
que no es DM (Figura 4D). También se inyectaron células UM1 en las venas de la cola de ratones
desnudos con DM y ratones sin DM, y los nódulos metastásicos en los pulmones se confirmaron
histológicamente y se contaron. Los ratones con DM exhibieron un número significativamente
mayor de nódulos metastásicos en relación con el grupo sin DM (Figura 5).
DISCUSIÓN
Más y más evidencia creciente indica un mayor riesgo de cáncer en individuos con diabetes
mellitus [17, 18]. Wang et al. informó que el riesgo general de cáncer en pacientes con diabetes
mellitus tipo 2 (DM2) se incrementó significativamente, con SIR (razones de incidencia
estandarizadas) de 1,15 y 1,25 en hombres y mujeres, respectivamente [18]. He et al [17]
también encontraron que las personas con cáncer de mama y DMT2 tenían más compromiso de
los ganglios linfáticos y que la DMT2 se asociaba con un mal pronóstico en el cáncer de mama
ER / PR-positivo o HER2-negativo. Recientemente, los estudios epidemiológicos también
mostraron que la DM puede ser un factor de riesgo para el desarrollo de carcinoma de células
escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) y se puede correlacionar con una mayor incidencia de
HNSCC [19, 20]. Un estudio de cohorte retrospectivo mostró que la tasa de prevalencia de DM
fue más alta en pacientes con COCE que en la población general de Taiwán (19.1% frente a 7.5%).
Los pacientes de OSCC con DM tienden a tener una SG más baja en comparación con los
pacientes de OSCC sin DM (HR = 2,22) [20]. Hasta ahora, ningún informe ha investigado la
relación entre DM y TSCC. En este estudio, encontramos que la tasa de prevalencia de DM en
pacientes con TSCC fue 12.84%, que es aproximadamente 1.32 veces mayor que en la población
general en China, pacientes con TSCC sin DM demostraron una tendencia de mejor
supervivencia que pacientes con TSCC con DM , ya que los pacientes con TSCC con DM tenían
un riesgo 1,38 veces mayor que afecta la SG a 5 años en comparación con los pacientes sin DM.
Dado el papel central que desempeña la glucólisis en el desarrollo tumoral, es probable que los
niveles elevados de glucosa en la circulación proporcionen abundantes recursos de glucosa y un
gradiente de concentración para el uso conveniente de las células cancerosas. De hecho,
estudios recientes han demostrado que el exceso de glucosa induce la expresión del gen
relacionado con la glicólisis HK2 y PKM2 [13, 21, 22]. Liu et al [13] encontraron que la expresión
de HK2 estimulada por glucosa alta y la migración de células de tipo silvestre (wt) y si-MiaPaCa2
en condiciones tanto normóxicas como hipóxicas. Yang y Lu [22] también informaron que la
glucosa alta promovió la desfosforilación de SP1, lo que aumentó la actividad de unión de ADN
de SP1 y mejoró la expresión de PKM2. En nuestro estudio, se encontró una fuerte correlación
entre la DM y las enzimas glucolíticas PKM2. La regulación ascendente de PKM2 inducida por la
glucosa alta también se detectó in vitro por microarrays y western blot y en el estudio de
animales con DM. La glucosa alta aumentó la proliferación, migración e invasión de células TSCC
y este efecto puede ser eliminado después de la caída de la expresión de PKM2 en células TSCC.
Por lo tanto, la glucosa alta promueve el comportamiento metastásico celular, que puede estar
relacionado con PKM2.
MATERIALES Y MÉTODOS
Pacientes y muestras
Realizamos un estudio de cohorte retrospectivo con datos del First Affiliated Hospital (abril de
1998-mayo de 2004, cohorte n.º 1 y junio de 2004-septiembre de 2014, cohorte n.º 2) y datos
de la Escuela de Estomatología de Guanghua (marzo de 2004 a septiembre de 2014, cohorte #
3) de la Universidad Sun Yat-sen. La DM se definió como: (1) niveles de glucosa en plasma en
ayunas ≥7.0 mmol / L o (2) niveles de glucosa en plasma de 2 horas ≥11.1 mmol / L. La alteración
de la glucosa en ayunas (IFG) se definió como: (1) niveles de glucosa en plasma en ayunas entre
6,1 mmol / L y 7,0 mmol / L o (2) niveles de glucosa en plasma de 2 h entre 7,8 mmol / L y 11,1
mmol / L (Xu et al. al., 2013). Todos los pacientes fueron diagnosticados con TSCC y se
sometieron a disección radical sin quimioterapia o radioterapia preoperatoria. La
caracterización clínica de los pacientes se resume en la Tabla Suplementaria 4. La supervivencia
se calculó desde el diagnóstico hasta la fecha del último seguimiento (o muerte) (2014-09-01).
Este estudio fue aprobado por el comité de ética del primer hospital afiliado de la Universidad
Sun Yat-Sen (2016074).
Se mantuvieron líneas celulares TSCC humanas (UM1, CAL27) en DMEM suplementado con 10%
de suero fetal bovino, 1000 U / ml de penicilina y 500 mg / ml de estreptomicina en una
incubadora a 37ºC y 5% de CO2. Para eliminar PKM2, las células se sembraron en placas de 6
pocillos y se transfectaron con PKM2 siRNA o control siRNA (Ribobio, Guangzhou, China)
utilizando Lipofectamine ™ RNAiMAX reactivo de transfección (Invitrogen, CA, EE. UU.) De
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron tres secuencias de PKM2 siRNA, y la
secuencia que exhibió el mejor efecto de knockdown se eligió para experimentos adicionales
(PKM2 siRNA secuencias: 5'-ccauaaucguccucaccaatdt-3 '; Control siRNA secuencias: 5'-
uucuccgaacgugucacgutt-3'). Las células se recogieron para el análisis funcional después de 48 h
de transfección.
ensayos de migración celular / invasión in vitro
La actividad de SOD2 se determinó mediante un kit de ensayo Cu / Zn-SOD y Mn-SOD con WST-
8 (Beyotime, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante [29]. Una unidad de actividad
de SOD2 se definió como la cantidad de SOD2 necesaria para exhibir una dismutación del 50%
del radical superóxido producido. La actividad enzimática final se calculó normalizando los
resultados a la concentración de proteína total del extracto proteico completo. La concentración
de H2O2 se determinó usando el kit de ensayo de peróxido cuantitativo PeroXOquant (Pierce,
IL, EE. UU.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante [29].
Se usaron células UM1 cultivadas con glucosa normal (5,6 mM) y glucosa alta (16,7 mM) para
detectar los perfiles de expresión del ARNm. El ARN total se aisló, etiquetó e hibridó a las
matrices Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip de acuerdo con los protocolos
estándar previamente informados [33]. Las matrices se escanearon con un GeneChip Scanner
3000. Las imágenes de matriz escaneadas se procesaron con el software de operación GeneChip
(GCOS). Los datos de microarrays se preprocesaron usando el análisis de matriz múltiple robusto
(RMA). Los experimentos se realizaron por duplicado. Los genes expresados diferencialmente se
definieron como aquellos con un cambio de pliegue <0,67 (regulado por disminución) o> 1,5
(regulado positivamente) y un valor de P <0,05. Los datos de microarrays se han depositado en
Gene Expression Omnibus (GEO) [número de acceso de GEO: GSE99549]. Se utilizó un análisis
GO para analizar los datos de microarrays.
Se estableció un modelo de diabetes de ratón desnudo BALB / C mediante una única inyección
intraperitoneal de STZ [disuelta en tampón de citrato sódico 0,1 M (pH 4,5), Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, EE. UU.] A una dosis de 150 mg / kg de peso corporal, mientras que los ratones de
control recibieron una inyección del mismo volumen de tampón de citrato de sodio 0,1 M [34].
Tres días después de la inyección de STZ, se consideró que los ratones con hiperglucemia (niveles
de glucosa en sangre ≥250 mg / dl) tenían DM. Para la tumorogénesis, se inocularon células
CAL27 (5 x 106 / 0,2 ml) por vía subcutánea en los flancos derechos de ratones desnudos BALB
/ c macho de 4 semanas con o sin DM, y los xenoinjertos resultantes se midieron con una pinza
comenzando 1 semana después inoculación. Los volúmenes tumorales se calcularon como
½length × width2, y se obtuvieron la curva de crecimiento tumoral (y = Aekday) y los tiempos de
duplicación del tumou (ln2 / k). Los ratones fueron sacrificados después de 4 semanas. La
inmunohistoquímica (IHC) se usó para detectar la tinción de PKM2 en xenoinjertos de TSCC
como se describe previamente [35] usando anticuerpos específicos contra PKM2 (Cell Signaling
Technology, 1: 1000). Para los ensayos de metástasis, se inyectaron células UM1 (1 x 10 ^ {6}
/0,2 ml) en las venas de la cola de ratones desnudos BALB / c con o sin DM. Los animales fueron
sacrificados después de 8 semanas, y los tumores metastásicos en el pulmón se evaluaron como
se describió anteriormente [36].
Los ratones desnudos BALB / C se compraron de Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd., Hunan,
China. Se usaron al menos 5 ratones en cada grupo. Ningún ratón mostró ningún efecto tóxico
notable o pérdida de peso corporal durante el experimento. Este estudio animal fue aprobado
por el comité de ética del primer hospital afiliado de la Universidad Sun Yat-Sen (2016047).
Análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado, y los datos se presentan como los medios ±
la desviación estándar (DE). Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete
estadístico para las ciencias sociales (SPSS, Chicago, IL), versión 19.0. La prueba χ2 se utilizó para
analizar la relación entre la DM y las características clinicopatológicas de los pacientes con TSCC.
Las curvas de supervivencia se trazaron usando el método de Kaplan-Meier y se compararon con
la prueba de log-rank. Se usaron regresiones de Cox para los análisis univariados y multivariados.
Las correlaciones entre la expresión de PKM2 y DM se probaron usando la correlación de rangos
de Spearman. Los datos se analizaron con la prueba t de Student para determinar la significación
entre dos grupos o con un análisis de varianza de una vía (ANOVA) para calcular la significación
entre más de dos grupos. En todos los casos, P <0.05 se consideró estadísticamente significativo.
CONCLUSIONES