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1. Matériels
1.1. Matériels biologiques
1.1.1. Souche étudiées
Sont inclus dans cette étude des souches d'Escherichia coli, isolées à partir de divers
prélèvements (sonde urinaire, prélèvement rectal, plaie et environnements), au nivaux de deux
services (traumatologie et médecine interne) du CHU de Tlemcen.
1.4. Antibiotiques
1.4.1. En disque
Les β-lactamines: Amoxicilline (AMX), amoxicilline/acide clavulanique (AMC),
ceftazidime (CAZ), Imipénéme (IMP), Aztréonam (ATM), céfoxitine (FOX) et
céfotaxime (CTX).
Les aminosides : amikacine (AK), Gentamicine (GN)
Les quinolones : acide nalidixique (NA), norfloxacine (NOR) et céprofloxacine(CIP)
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Matériels& méthodes
1.4.2. En poudre
Céftazidime (CAZ), céfotaxime (CTX), céprofloxacine (CIP), Aztréonam (ATM), amikacine
(AK), céfépime (FEP) et fosfomycine sont des poudres à concentration.
2. Méthodes
2.1. Prélèvements
Les prélèvements ont été réalisés par écouvillonnage sur des plaies, des sondes urinaires les
urine, des pus et environnement, puis transportés à température basse ou froid 4°C, au
laboratoire (l’écouvillon est introduit dans un tube contenant du bouillon nutritif), ensuite
incubés dans l’étuve à 37°C pendants 24 heures.
2.3. Identification
2.3.1. Test TSI (milieu tripe sucres)
Le milieu TSI est ensemencé par piqure central de culot et par stries sur la pente. Après
incubation à 37°C pendant 24 heures, ce test permet la mise en évidence de l'utilisation de
glucose, lactose et du saccharose avec ou sans dégagement de gaz. La coloration jaune est due
à l'acidification du milieu au niveau de la pente après la fermentation du glucose et ou
saccharose. La production d’hydrogène sulfuré (H2S) se révèle par une coloration noire due à
la transformation du sulfure de fer par réduction de sulfate ferreux dans le milieu.
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Matériels& méthodes
Mode opératoires
Réunir fond et couvercle d'un boite d'incubation et répartir l'eau distillé dans les
alvéoles pur créer une atmosphère humide.
Inscrire la référence ou le code de la souche sur la languette latérale de la boite.
Déposer la galerie dans la boite d'incubation.
Réaliser une suspension bactérienne par homogénéisation d'une seule colonie bien
isolée sur milieu gélosé dans de l'eau physiologique (2ml).
Remplir tubes et cupules des tests: CIT, VP, GEL, avec la suspension bactérienne et
avec la pipette ayant servi au prélèvement.
Remplir uniquement les tubes (et non les cupules) des autres tests.
Remplir d'huile de paraffines les cupules des tests soulignés: URE, H2S, ODC, LDC,
ADH afin de créer l'anaérobiose.
Fermer la boite d'incubation et la placer à 37°C pendant 24 heures.
Lecture
Après incubation, la lecture de la galerie est réalisée en se référant au tableau de
lecture (annexe 2).
Noter sur la fiche de résultats toutes réactions spontanées.
Révéler les testes nécessitant l'addition de réactifs.
Avec le tableau d'incubation, comparer les réactions notées sur la fiche de résultats
avec celles du tableau (Bio Mérieuse).
2.4. Antibiogramme
La méthode de diffusion des antibiotiques en milieu solide est basée sur l'observation de la
croissance bactérienne en présence d'un gradient de concentration d'antibiotique obtenu par
diffusion à partir des disques dans le milieu gélosé. La fiabilité des résultants d'un
antibiogramme est influencée par de nombreux paramètres qui doivent être rigoureusement
contrôlés. La technique standard utilisée est celle préconisée par les documents émanant de la
Société Française de Microbiologie (SFM) selon les normes du communiqué 2010.
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Matériels& méthodes
2.4.2. Ensemencement
Diluer la suspension d’inoculum au 1/100 dans de l’eau physiologique
Ensemencer par inondation (ou par écouvillonnage) sur milieu Muller Hinton
Rejeter l’excès puis sécher les boites 20 à 30 minutes à l’étuve.
Déposer les disques d’antibiotiques à l’aide d’une pince stérile en suivant le schéma de
VEDEL pour les entérobactéries (figure 7)
AMX NA
CAZ CTX AN CN
AMC CS
ATM FOX
2.4.4. Lecture
Après 24 heures d’incubation, mesurer les diamètres d’inhibition et se référer aux valeurs
critiques de CA-SFM (Annexe 3), ensuite interpréter les phénotypes de résistance.
2.5.2. Techniques
Réaliser un antibiogramme par diffusion sur gélose Müller-Hinton additionné de
cloxacilline à 500 μg/ml et à 1000 μg/ml.
2.5.3. Lecture
On observe une restauration de l’activité des céphalosporines de 3ème génération.
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Matériels& méthodes
2.6.2. Technique
Pour chacun d’antibiotiques, préparer une solution mère à 5120 mg/l puis réaliser des
dilutions séries de progression géométrique de raison ½ (Annexe 4).
Distribuer 2 ml de chaque dilution d’antibiotique dans une série de boite de pétri ainsi
que 2 ml d’eau distillée stérile dans une boite de pétri témoin;
Ajouter 18 ml de milieu Mueller Hinton gélosé maintenu en surfusion ;
Bien mélanger et laisser solidifier ;
Sécher les boites 30 mn à l’étuve à l’étuve à 37°C.
Préparer des suspensions de 108 UFC/ml pour chacune des souches à tester
Diluer la suspension d’inoculum au 1/10 ;
Ensemencer par spot 1 à 2 µl de la suspension bactérienne, soit un inoculum de 104
UFC/spot.
Incuber à 37°C pendants 24 H.
2.6.3. Lecture
S’assurer de la croissance des souches au niveau de la boite témoin ;
La concentration minimale inhibitrice est définie comme étant la plus faible
concentration ou il n’y a par de croissance visible. La présence d’une ou de deux
colonies ou d’un fin film n’est pas prise en considération.
2 .7.2. Technique
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Matériels& méthodes
2.7.4. Lecture
Analyser les transconjugants en réalisant des antibiogrammes.
2 .8.1. Technique
Préparation de la réaction
Chaque réaction d’amplification comprend un volume final de 50 µl incluant : 5 µl de tampon
3 µl de MgCl2 25 mM, 0.5 µl dNTPs (dATP, dGTP, dTTP et dCTP), 2 µl d’amorces, 40 µg
d’ADN et une uunité de Taq polymérase (0.25 µl). Le volume final de l’échantillon est
complété par l’ajout d’eau stérile.
Extraction d’ADN
L’extraction d’ADN se fait par l’ensemencement d’une colonie dans 200 µl d’eau ultra pure
puis mélanger bien à l’aide d’un vortex.
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Matériels& méthodes
Réaction d’amplification
La réaction d’amplification, à l’aide d’un thermocycleur débute avec une étape de
dénaturation de l’ADN, effectuée à 94°C sur une période de 10 min. suive d’une étape
d’hybridation des amorce à 40°C à 45°C.
L’étape suivante consiste à amplifier l’ADN ce qui est fait une période de 30 cycles. Chaque
cycle comprend : 1 minute de dénaturation (94°C), suite à ces cycles d’amplification, la
réaction se termine par une période additionnelle d’élongation de 10 min à 72°C.
Analyse par migration sur gel d’agarose
L’évaluation de la taille de différents fragments d’ADN est rendue possible suite à la
migration électrophorétique des échantillons sur gel d’agarose.
La technique fait appel à la préparation d’un gel composé à la fois d’agarose et tampon TBE
1X (0.09M Tris, 0.09M acide Borique, 0.002M EDTA). Une quantité précise d’agarose,
préétablie en fonction de taille estimée des fragments d’ADN à séparer, est mélangée à 100
ml de TBE 1X et chauffée jusqu’à dissolution. L’ajout de bromure d’éthidium (0.25 µd ml)
permet de visualisation l’ADN.
La solution est ensuite coulée dans un moule comprenant un nombre déterminé de puits. Une
fois le gel figé, il est déposé dans une chambre à électrophorèse comprenant du tampon de
migration (TBE). Les échantillons d’ADN, sont déposés dans les puits et soumis à un voltage
de 120V pour une période d’environ 1h. À la fin la migration, le gel est photographié et la
taille des fragments d’ADN est comparée à deux différentes échelles, de 100 pb ou de 1 kb.
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