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Matériels& méthodes

1. Matériels
1.1. Matériels biologiques
1.1.1. Souche étudiées
Sont inclus dans cette étude des souches d'Escherichia coli, isolées à partir de divers
prélèvements (sonde urinaire, prélèvement rectal, plaie et environnements), au nivaux de deux
services (traumatologie et médecine interne) du CHU de Tlemcen.

1 .1.2. Souches de références


 ATCC 27853 : Pseudomonas aeruginosa de phénotype sauvage ;
 K 12 : Escherichia coli résistance à la rifampicine ;
 Kp nasey : Klebsiella pneumoniae.

1.2. Milieux de culture


1.2.1. Milieux de culture liquides
 Bouillon nutritif (BN) (Fluka)
 Bouillon cœur cerveau (BHIB) (Fluka)

1.2.2. Milieux de culture solides


 Gélose nutritive (GN)
 Milieu Mac Conkey (MC) (Fluka)
 Milieu Muller-Hinton (MH) (Fluka)
 Milieu triple sucres (TSI)

1.3. Solutions et tampons


 Eau ultra pure
 Eau distillées stérile
 Solution de BET

1.4. Antibiotiques
1.4.1. En disque
 Les β-lactamines: Amoxicilline (AMX), amoxicilline/acide clavulanique (AMC),
ceftazidime (CAZ), Imipénéme (IMP), Aztréonam (ATM), céfoxitine (FOX) et
céfotaxime (CTX).
 Les aminosides : amikacine (AK), Gentamicine (GN)
 Les quinolones : acide nalidixique (NA), norfloxacine (NOR) et céprofloxacine(CIP)

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 Autre : colistine (CS)

1.4.2. En poudre
Céftazidime (CAZ), céfotaxime (CTX), céprofloxacine (CIP), Aztréonam (ATM), amikacine
(AK), céfépime (FEP) et fosfomycine sont des poudres à concentration.

2. Méthodes
2.1. Prélèvements
Les prélèvements ont été réalisés par écouvillonnage sur des plaies, des sondes urinaires les
urine, des pus et environnement, puis transportés à température basse ou froid 4°C, au
laboratoire (l’écouvillon est introduit dans un tube contenant du bouillon nutritif), ensuite
incubés dans l’étuve à 37°C pendants 24 heures.

2.2. Isolement et purification


L’isolement est réalisé sur gélose Mac Conkey, milieu sélectif pour les entérobactéries et on
porte à incubation pendent 24 heures à 37°C. On réalise la purification des souches par
plusieurs passages successifs sur gélose par strie Mac Conkey afin d'obtenir des souches
jeunes et pures.

2.3. Identification
2.3.1. Test TSI (milieu tripe sucres)
Le milieu TSI est ensemencé par piqure central de culot et par stries sur la pente. Après
incubation à 37°C pendant 24 heures, ce test permet la mise en évidence de l'utilisation de
glucose, lactose et du saccharose avec ou sans dégagement de gaz. La coloration jaune est due
à l'acidification du milieu au niveau de la pente après la fermentation du glucose et ou
saccharose. La production d’hydrogène sulfuré (H2S) se révèle par une coloration noire due à
la transformation du sulfure de fer par réduction de sulfate ferreux dans le milieu.

2.3.2. Galerie API 20 E (Bio Mérieux)


 Principe
La galerie API 20 E comporte 20 microtubes contenant des substrats sous forme déshydratés.
Les tests sont inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstituée les milieux. Les
réactions produites pendant la période d'incubation se traduisent par des virages colorés
spontanés ou révélés par l'addition de réactifs.

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 Mode opératoires
 Réunir fond et couvercle d'un boite d'incubation et répartir l'eau distillé dans les
alvéoles pur créer une atmosphère humide.
 Inscrire la référence ou le code de la souche sur la languette latérale de la boite.
 Déposer la galerie dans la boite d'incubation.
 Réaliser une suspension bactérienne par homogénéisation d'une seule colonie bien
isolée sur milieu gélosé dans de l'eau physiologique (2ml).
 Remplir tubes et cupules des tests: CIT, VP, GEL, avec la suspension bactérienne et
avec la pipette ayant servi au prélèvement.
 Remplir uniquement les tubes (et non les cupules) des autres tests.
 Remplir d'huile de paraffines les cupules des tests soulignés: URE, H2S, ODC, LDC,
ADH afin de créer l'anaérobiose.
 Fermer la boite d'incubation et la placer à 37°C pendant 24 heures.
 Lecture
 Après incubation, la lecture de la galerie est réalisée en se référant au tableau de
lecture (annexe 2).
 Noter sur la fiche de résultats toutes réactions spontanées.
 Révéler les testes nécessitant l'addition de réactifs.
 Avec le tableau d'incubation, comparer les réactions notées sur la fiche de résultats
avec celles du tableau (Bio Mérieuse).

2.4. Antibiogramme

La méthode de diffusion des antibiotiques en milieu solide est basée sur l'observation de la
croissance bactérienne en présence d'un gradient de concentration d'antibiotique obtenu par
diffusion à partir des disques dans le milieu gélosé. La fiabilité des résultants d'un
antibiogramme est influencée par de nombreux paramètres qui doivent être rigoureusement
contrôlés. La technique standard utilisée est celle préconisée par les documents émanant de la
Société Française de Microbiologie (SFM) selon les normes du communiqué 2010.

2.4.1. Préparation d’inoculum


Pour chacun des souches à tester, réaliser une suspension en ensemençant 2 ml d’eau
physiologique stérile par 3 à 4 colonies à partir d’une souche pure. Le culture obtenue doit
être de densité optique 0.08-0.1 à 625 nm à 108 UFC\ml.

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2.4.2. Ensemencement
 Diluer la suspension d’inoculum au 1/100 dans de l’eau physiologique
 Ensemencer par inondation (ou par écouvillonnage) sur milieu Muller Hinton
 Rejeter l’excès puis sécher les boites 20 à 30 minutes à l’étuve.

2.4.3. Application des disques

Déposer les disques d’antibiotiques à l’aide d’une pince stérile en suivant le schéma de
VEDEL pour les entérobactéries (figure 7)

AMX NA

CAZ CTX AN CN

AMC CS

ERTA IMP CIP NOR

ATM FOX

Figure 7. Disposition des disques d’antibiotique sur les boites d’antibiogrammes.

2.4.4. Lecture

Après 24 heures d’incubation, mesurer les diamètres d’inhibition et se référer aux valeurs
critiques de CA-SFM (Annexe 3), ensuite interpréter les phénotypes de résistance.

2.5. Test à la cloxacilline (Brasme et al., 2009)


2.5.1. Principe
 La cloxacilline est un antibiotique qui permit d’inhiber les β-lactamase de type
AmpC.

2.5.2. Techniques
 Réaliser un antibiogramme par diffusion sur gélose Müller-Hinton additionné de
cloxacilline à 500 μg/ml et à 1000 μg/ml.

2.5.3. Lecture
 On observe une restauration de l’activité des céphalosporines de 3ème génération.

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2.6. Détermination de Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) en milieu solide


2.6.1. Principe
La méthode de dilution successive en milieu solide est la méthode de référence pour
déterminer la sensibilité bactérienne aux antibiotiques. Elle consiste à mettre un inoculum
bactrien standardisé au contact de concentrations croissantes d’antibiotiques.

2.6.2. Technique
Pour chacun d’antibiotiques, préparer une solution mère à 5120 mg/l puis réaliser des
dilutions séries de progression géométrique de raison ½ (Annexe 4).
 Distribuer 2 ml de chaque dilution d’antibiotique dans une série de boite de pétri ainsi
que 2 ml d’eau distillée stérile dans une boite de pétri témoin;
 Ajouter 18 ml de milieu Mueller Hinton gélosé maintenu en surfusion ;
 Bien mélanger et laisser solidifier ;
 Sécher les boites 30 mn à l’étuve à l’étuve à 37°C.
 Préparer des suspensions de 108 UFC/ml pour chacune des souches à tester
 Diluer la suspension d’inoculum au 1/10 ;
 Ensemencer par spot 1 à 2 µl de la suspension bactérienne, soit un inoculum de 104
UFC/spot.
 Incuber à 37°C pendants 24 H.

2.6.3. Lecture
 S’assurer de la croissance des souches au niveau de la boite témoin ;
 La concentration minimale inhibitrice est définie comme étant la plus faible
concentration ou il n’y a par de croissance visible. La présence d’une ou de deux
colonies ou d’un fin film n’est pas prise en considération.

2.7. Transfert des plasmides par conjugaison (Touati, 2006)


2.7.1. Principe
La conjugaison représente le phénomène de contact physique par lequel les plasmides peuvent
passer d’une cellule donatrice à une autre réceptrice (K 12). La sélection des transconjugants
s’effectue en présence de 2 antibiotiques : l’un correspond à l’une des résistances transférées,
l’autre à la résistance non transférable de la souche réceptrice.

2 .7.2. Technique

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 Ensemencer la souche réceptrice la K 12 et les souches donatrices en bouillon BHIB


et incuber à 37°C pendants 24h ;
 Réaliser un mélange donatrice réceptrice dans un rapport 1 :10 ;
 Mélanger par inversion ;
 Incuber à 37°C pendants 24h ;
 Ensemencer par strie le mélange sur un milieu de sélection ;
 Vérifier la sélectivité des milieux de sélection en ensemençant la souche donatrice et
la souche réceptrice sur la même boite;
 Incuber à 37°C pendants 24h.

2.7.3. Préparation de boites de sélections


La sélection a été faite sur Mac Conkey (18 ml) additionné de 1ml de Céfotaxime et 1 ml de
Rifampicine à des concentrations finales de 16 µg/ml et de 256 µg/ml respectivement.

2.7.4. Lecture
Analyser les transconjugants en réalisant des antibiogrammes.

2.8. Amplification par réaction de la polymérisation en chaine (PCR).


En biologie moléculaire, une des techniques les plus élémentaires et la PCR. La réaction
PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d’amplifier in vitro une région spécifique d’un
acide nucléique donné afin d’en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier.
Pour se faire, une série de réactions permettant la réplication d’une matrice d’ADN double
brin est répétée en boucle. Ainsi, au cours de la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de
chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant, l’amplification est donc exponentielle
(Borde, 2006).

2 .8.1. Technique
 Préparation de la réaction
Chaque réaction d’amplification comprend un volume final de 50 µl incluant : 5 µl de tampon
3 µl de MgCl2 25 mM, 0.5 µl dNTPs (dATP, dGTP, dTTP et dCTP), 2 µl d’amorces, 40 µg
d’ADN et une uunité de Taq polymérase (0.25 µl). Le volume final de l’échantillon est
complété par l’ajout d’eau stérile.

 Extraction d’ADN
L’extraction d’ADN se fait par l’ensemencement d’une colonie dans 200 µl d’eau ultra pure
puis mélanger bien à l’aide d’un vortex.
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 Réaction d’amplification
La réaction d’amplification, à l’aide d’un thermocycleur débute avec une étape de
dénaturation de l’ADN, effectuée à 94°C sur une période de 10 min. suive d’une étape
d’hybridation des amorce à 40°C à 45°C.
L’étape suivante consiste à amplifier l’ADN ce qui est fait une période de 30 cycles. Chaque
cycle comprend : 1 minute de dénaturation (94°C), suite à ces cycles d’amplification, la
réaction se termine par une période additionnelle d’élongation de 10 min à 72°C.
 Analyse par migration sur gel d’agarose
L’évaluation de la taille de différents fragments d’ADN est rendue possible suite à la
migration électrophorétique des échantillons sur gel d’agarose.
La technique fait appel à la préparation d’un gel composé à la fois d’agarose et tampon TBE
1X (0.09M Tris, 0.09M acide Borique, 0.002M EDTA). Une quantité précise d’agarose,
préétablie en fonction de taille estimée des fragments d’ADN à séparer, est mélangée à 100
ml de TBE 1X et chauffée jusqu’à dissolution. L’ajout de bromure d’éthidium (0.25 µd ml)
permet de visualisation l’ADN.
La solution est ensuite coulée dans un moule comprenant un nombre déterminé de puits. Une
fois le gel figé, il est déposé dans une chambre à électrophorèse comprenant du tampon de
migration (TBE). Les échantillons d’ADN, sont déposés dans les puits et soumis à un voltage
de 120V pour une période d’environ 1h. À la fin la migration, le gel est photographié et la
taille des fragments d’ADN est comparée à deux différentes échelles, de 100 pb ou de 1 kb.

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