"Avances Significativos en Tecnologías

Analíticas Frente a los Desafíos de

Sensibilidad, Reproducibilidad, Productividad
y Los Nuevos Horizontes de Aplicación”

Espectroscopía Molecular

Dr. Leonardo Rossi

PM Molecular&Elemental 1
Espectroscopía Molecular

2
Qué es una espectrosocopía?

3
 Qué es una espectrosocopía?

Intensidad (u.a.)
10

11
20

0 5 10 15 20 25 30
2,0

0.00
0.13
1,5 0.25
0.38
0.50
0.63
Abs(u.a.)

1,0 0.76
0.88
1.01

0,5

0,0
400 600 800

(nm)

4
Técnicas de Espectroscopía
Infrarroja
FT - IR

5
Espectrosocopía Infrarroja

• Sencillas de implementar
• Permiten identificación de substancias
• Comparación contra Bibliotecas
• Compatibles con Microscopía
• Excelente sensibilidad
FT-IR

6
 Espectroscopía - Métodos
Fuente Muestra Detector Espectro
Transmisión
Difusa
ATR

7
Camino óptico de un FT IR

8
Espectrómetro FT – IR
•0.09 cm-1 de resolución
•Fuente Infrarroja de larga vida
•Accesorios Smart
•Actualizable para incluir ATR
•Expandible con GC-IR y NIR
•Compatible con microscopios
•Compatible con TGA -IR
•Rueda de Validación interna
•Sellado y Desecado con
ventanas de KBr en el
compartimiento de muestras

9
Espectrómetro FT – IR

10
Microscopio Integrado Nicolet iN10 FT-IR

• Microscopio FT - IR
integrado

• Muy sensible

• Util para medir superficies

• Poca preparación de
muestra

11
Aplicaciones FT - IR

12
Identificación de Sustancias Ilegales

• Muestra de Estupefacientes
secuestrada
• Analisis de 30 segundos por
ATR
• El software idenifica los 4
ingredientes principales
• NO DESTRUCTIVO

13
Análisis de Fibra (Micro ATR)

• Muestra de cabello de la escena del crimen

• Evidencia de tratamiento
• El espectro del Spray puro es el mismo
que en la residencia del acusado

Escena del crimen

Cabello limpio

Spray (acetato de polivinilo)

14
 Análisis de Fibras incrustadas - ATR

• Análisis Rápido de fibras incrustadas en billetes, tejidos, etc

Red Fiber embedded in money
0.18
Fibra roja en billete de 100 usd
0.16

0.14

0.12

0.10
Abs

0.08

0.06

0.04

0.02
0.00
Nylon Library match
0.8
Fibra de Nylon – match 100%
0.7

0.6

0.5
Abs

0.4

0.3

0.2

0.1
0.0
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Wavenumbers (cm-1)

15
Analisis por Reflexión – Tinta sobre papel
• Análisis de papel moneda
por reflexión

• Antiguamente era muy dificil

(alta absorción)

• Imagen Visual + IR

• Permite identificar la tinta y

el diseño

16
Envejecimiento de Telas

90
80

%T
70
Original mummy fiber
60

100
95
90

%T
85
80
Irradiated fiber
75

95
%T

90

85 Heated fiber
3000 2000 1500 1000
Wavenumbers (cm-1)

• Luz o Calor?
Mummy Displayed in Museum • Fibra tomada de la momia match con fibra
irradiada

17
Descomposición del Terciopelo

TGA-IR

• Aditivos en el Terciopelo producen especies

Mummies Displayed on Velvet gaseosas
Art Institute of Chicago
• Se encontró Acido Acetico y Amoniaco

18
Application – Investigation of Clay Excavation

• Excavation of ancient kitchen

• Clay spheres discovered, usage unknown

Clay Excavation spheres

• Color and isotropy differences due to firing conditions
used during cooking

19
Application – Bone Fossilization

Spring Bone

Non-Spring Bone

• Bone fossils found, fossilization technique unknown

• Did spring water aid or inhibit fossilization process?
• Spectral indicators:
• Formation of carbonate fluorapetite in (a) represents spring
water fossilization. Opposite trend in spectrum (b)
characteristic of hydroxylapatite
• The nucleation of carbonate fluorapatite is linked to the
Bone Fossils high fluoride content of the alkaline spring water, thus
confirming its key role in the fossilization process

20
Application – Bone Fossilization (cont.)

Nicolet iN10 MX

Bone Fossils

21
Cyprus - Late Bronze Age - Plaster Floor
• Multi-layered structure as determined by field FTIR measurements

Lime and Gypsum

1084
Finishing

1122

874
1437

1037

636
3555

521
3408

470
609
778
713
1794
2514

798

670
3000 2000 1000 500
cm-1

Lime
Preparation
22
Análisis de Artefactos

Harrick Scientific FiberMate 2

• Mid-IR fiber optic accessories

• Sample flexibility outside of sample compartment
Historical Headwear • Fast, non-destructive analysis
* VA Museum of Fine Arts

23
Azul de Prusia

• TiO2 / acrylic paint with and without Prussian Blue

• Cyano peak present at ~2080cm-1
• Provides insight into historical time period
Prussian Blue Pigment
[Fe7(CN)18] component

24
Application – Pompeii’s Red
POMPEII RED

%T
4

Magnesium sulfate, 99.999%

80

60

%T
40

Nicolet iS50 TGA-IR 20

CALCIUM CARBONATE COMPOUND

80

60
%T

40

20

3500 3000 2500 2000 1500 1000

Wavenumbers (cm-1)

• Sample found on wall in Pompeii, where Vesuvius

erupted in 79 A.D.
• TGA-IR pre-treatment and microscopy reveled several
components, including beeswax, which was likely added
Pompeii’s Red as protectant

25
Application – Paint Identification
Art work Paint Sample

0.05

Abs
0.00

1.0 Linseed Oil

Abs
0.5

1.0 Iron(III) Hexacyanoferrate

Abs 0.5

1.0 OXIDE; BORON(III)

Abs

0.5

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Wavenumbers (cm-1)

• Correct identification equals correct preservation

• Multi-component searching
• Commercial or self-made libraries
Paint Sample Through ATR

26
Cannabinoides

• Legalización con fines medicinales

• Control de calidad de derivados
• Aparicion de productos “no label”

27
Lubricant Analysis: ASTM E2412

• Oil measured directly using transmission cell

• 100 um cell - wedged ZnSe windows to
eliminate spectral fringes

28
Instrumentación Raman

29
Raman
Fuente Muestra Detector Espectro

EMISIÓN
RAMAN
LASER

INSTRUMENTACION MÁS COMPLEJA Y

SENSIBLE
30
Stokes and Anti-Stokes – Filter Off Rayleigh Scatter

Rayleigh CCl4
lex=488 nm
Stokes nex=20492 cm-1
-459
Virtual
State

Intensity
-314

-218
Anti-Stokes
Energy

218
314
459

-500 -400 -300 -200 -100 0 100 200 300 400 500
n=1 Raman Shift, cm-1
n=0
Stokes Rayleigh Anti-Stokes
Scattering Scattering Scattering Rejection Filter

Edge-filter

31
 Why the Different Laser Wavelengths?
Balance most efficient laser with avoiding severe fluorescence

Virtual State
Laser Choices: 455 nm, 532 nm,
633 nm, 785 nm
Electronic State
Virtual State

Virtual State 1
I scatter 
4ex
Energy

Longer Wavelength Shorter Wavelength Laser

Lasers (785 nm) (532 nm)
More Efficient Raman
n=1 Scatter
n=0
(lower laser power)
Stokes Scattering Fluorescence Typically Less
Different lasers Fluorescence
(sample dependent)
Better Spatial Resolution

32
Avoiding Fluorescence – Change Excitation Wavelength

Uncorrected
spectrum

Fluorescence Too extreme

Overwhelming Raman
Spectrum after
automated fluorescence Sample requires a different Laser
correction applied

If the fluorescence is not too extreme it can be compensated for using a
software correction
otherwise changing the excitation wavelength (laser) might be the best
solution.

33
Equipos viejos

34
Triplet Spectrograph
Captures 50-3500 cm-1 range at 4 cm-1 resolution at once!

Input Cylindric
Aperture al Lens
Grating

Secondary
#2

2048
pixel
Detector

Primary Secondary
Mirror #1

35
Espectrosocopía Infrarroja
FT-IR

u C=C
u CH u C=O u C-O d C-H

u C=C u C=C d C-H

u C-O
Raman

u CH
u C=O

• Ejemplo: Acetato de Transcinamilo

36
Espectrosocopía Infrarroja

• Espectroscopia sencilla de usar

• No requiere preparación

• Rápida y no-destructiva

• Apto para microscopía

37
Por qué Raman?

• En particular es muy buena para la zona del IR Lejano

• Información sobre estructura y entorno

• Identificar – Huella molecular
• Diferenciar –Materiales similares
• Evaluar – Morfología y Estado físico

• Ventajas
• Mucha información
• Rápida
• Sin preparación de muestra
• Sensible a cambios en el entorno
• Mejor resolución espacial

38
Filosofía de Diseño

 Simples de operar
 Performance Research grade
 lasers, Rayleigh filtros, and rejillas
intercambiables
 Compactos y tipo Class I laser safe
apropiados para un laboratorio sin
requerimientos especiales
 Alineación y calibración automáticas
 Software avanzado e intuitivo – para que
trabajar sea sencillo sin sacrificar
performance
 Invertir el tiempo en obtener respuestas, no
en aprender a manejar el equipo!
39
Microscopio Raman
 Resolución espacial mejor que
0.5 µm (X/Y)
 100 * 100 µm = 40 segundos
 Alineación y calibración
automática
 Corrección automática de
Fluorescencia
 Autofoco/Autoexposición
 Ideal para superficies,
micromuestras
 Compacto
 Linkam Stage, etc

40
Aplicaciones Raman

41
 Raman Solves Many Problems

Life Science
Spectroscopic evaluation of cancerous tissue
and bacterial biofilms to expand understanding
Cell Nuclei Collagen

Glass Slide

Carbon Nanomaterials
Analysis of graphene growth
mechanisms and distribution of
defects

Geology / Mineralogy
Identification of inclusions in minerals using Rapid non-destructive identification
DXR confocal analysis of minerals

42
 Ambar

• Authentic Baltic
amber
• Amber specimen
from earring
DXR2 Raman Microscope
• Library match for
Bisphenol A resin

• Melted/pressed
Baltic amber from
a pipe
• Indonesian copal

• West Africa copal

Amber samples

43
 Chinese Purple

Artifact Exterior Paint

Raman Microscope
Barium Copper Silicate

• Ancient pottery piece needed restoration

• Original paint color unknown
• Raman analysis confirms barium copper silicate
(“Chinese Purple”)
Pottery Artifact (206-24 B.C.) • Fast, accurate, non-destructive analysis

44
 Grafeno
HOPG (Graphite)
500
Int

Diamond
40000
Int

20000

Single Layer Graphen on Si Substrate

2000
Int

SWCNT (90% 1-2 nm)

100
Int

MWCNT (30-50 nm diameter)

100
Int

50

-0
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Raman shift (cm-1)

45
 Muestras de Fibras - Poliolefinas

46
 Búsqueda Espectral

47
 Nylon 6 Vs. Nylon 6,6

48
 Fibras – Efecto del pigmento

• Laser 785 nm
• 20 segundos de colección

49
 Substracción de Espectros

50
 Comparación con Pigmento extraído

51
 Búsqueda Espectral
Library Search Result – Extracted Dye

52
 Comparación de Tintas

• Laser 785 nm
• 10 segundos de medición

53
 Materiales Explosivos

TNT Specimen

• Laser 785 nm
• 10 segundos
• Contra Biblioteca

54
 Componentes Inorgánicos

55
 Componentes Inorgánicos

56
 Pinturas

57
 Pinturas – resolucion espacial

58
 Orige de Piedras Preciosas
• Identification of Gemstones

59
FT IR vs RAMAN

60
 FT – IR vs. Raman

61
 Comparación de Técnicas Infrarojas

FT - IR
• Absorción
• Emision de luz dispersada
• Generalmente requiere
preparación de muestra • No requiere preparación
• Se puede medir a través de
• Muy bueno para muestras
plástico y vidrio
no acuosas (ej: Polímeros)
• Ideal para muestras
• Permite cuantificación acuosas
• Permite distinguir
polimorfos

62
FT – IR + Raman

63
 Espectrómetro FT – IR + Raman

•Laser NIR 1064 nm

•500 mW máximo
•Fluorescencia reducida
•Camara HD para ver la
muestra
•Spot size de 60 µm
•Software para mapeos
•Plug & Play

64
 Espectrómetro
FT – IR vs. Raman
FT – IR iS50

Macro

Espectro
puntual

65
Espectroscopía de Infrarrojo
Cercano
FT - NIR

66
 Donde está el Infrarrojo cercano?

67
 Evaluación cuantitativa
Espectroscopia NIR

5.0 % CONCENTRACIÓN

1,27
2.5 % CONCENTRACIÓ
CONCENTRACIÓN
1,22

1,17
 CONCENTRACIÓN

1,12

1,07
1650 1670 1690 1710 1730

• Rango entre el Visible y el IR “tradicional”

• Usa la misma instrumentacion que IR tradicional, excepto el detecto (InGaAs)
• Datos Por Reflectancia, Transimision y Fibra Optica
• Sobretonos – “Zona limpia” de agua
• Necesidad de ALTA RESOLUCION

68
 Usos típicos

Análisis de Contenido de Humedad

Contenido de Proteinas, Grasas y
Carbohidratos en alimentos y forraje
Desarrollo de ingredientes novedosos,
como edulcorantes artificiales
Mediciones de contaminantes en
alimento para ganado
Verificacion de mezclas nutraceuticas
Caracterizacion de parametros como
gravedad especifica, grado de
fermentación, etc
Uso en desarrollo y control de calidad

69
 Analizador FT – NIR típico

Tablet Analyzer

Integrating Sphere

Transmission

Fiber Optic

70
Aplicaciones de Infrarrojo
Cercano
FT - NIR

71
 Análisis de Vinos

72
 Análisis de Vinos

73
 Análisis de Fosfatos

• Fosfatos en matriz compleja

• Distintas especies exhiben espectros suficientemente distintos

74
 Parametros en Biomasa - Levaduras

75
 Correlación de Acidos Grasos

76
 Espectro en Cervezas

77
 Análisis de Polímeros

• Espectros para Distintos grados de copolimerización (LD, MD, HD) Etileno –

Propileno
• Analisis previo de la materia prima

78
 Espectroscopía de
Resonancia Magnética
Nuclear
FT - RMN

79
Introduction
Introducciónto aNMR
RMN

NO Spatial Resolution? YES

NO
Frequency Resolution?

TD NMR, oil content in seed crops Functional MRI of the human brain
YES

Frequency resolved spectra for molecular

structure determination. MRI spectroscopy of the human brain

80
Introduction to NMRpara RMN
Instrumentación
NMR Spectrometer Options

Bruker 400 MHz AVANCE III

Bruker 1GHz (¼ Scale) Varian 900 MHz (¼ Scale)

‘High Field’ Superconducting FT-NMR

81
 picoSpin Spectrometer
Espectrómetro RMN BENCHTOP
Family Features!

36.2 cm x 25.4 cm x 43.2 cm 17.8 cm x 14.6cm x 29.2cm

19 kgs 5 kgs

82
 Espectrómetro RMN BENCHTOP

Mayor Sensibilidad ~3 a 4 veces la

resolucion

83
 Espectrómetro RMN BENCHTOP

•Únicamente 1H
•Frecuencia Larmor 82 Mhz
•Imán permanente
•Resolución mejor que 0.18
ppb FWHM
•Volumen de muestra 40 µl
•Peso 19 kg
84
 Espectrómetro RMN BENCHTOP

Diseño de una una

pieza - muy resistente
a las vibraciones

85
 Espectrómetro RMN BENCHTOP

Tx/Rx Microcoil
Capilar de 0.4 mm DI
PTFE

Mínima cantidad de
muestra

No requiere Shimming
entre muestras

Ideal para monitorear

reacciones

86
 Espectrómetro RMN BENCHTOP

•Opera a Tamb
•No requiere Tubos de Cuarzo
•Controlado desde un
WebServer
•5 años de garantía
•Sin partes móviles
•Sin mantenimiento
87
 Espectrómetro RMN BENCHTOP

•Un instrumento Benchtop no compite con el RMN

tradicional si no que lo complementa

• Qué necesito realmente

para obtener información util?
88
 Espectrómetro RMN BENCHTOP

≠
89
 Caso Real: Ligando orgánico

1) Síntesis de Williamson
2) Purificación por Columna
3) Saponificación
90
 Caso Real: Ligando orgánico

O
O
B3OC2
OH

Ácido 3,4,5 Trietoxibenzoico

91
 Caso Real: Ligando orgánico

92
 Caso Real: Ligando orgánico

93
 Caso Real: Ligando orgánico

94
 Caso Real: Ligando orgánico

95
 Conclusiones

• 90% de las veces RMN - 1H tiene la información necesaria

• Alivia la sobreocupación de turnos

• Un instrumento de Mesada complementa a uno tradicional

• Sencillo y Robusto

• Costo reducido

• Sin Mantenimiento

• USO DE RUTINA

96
Aplicaciones RMN

97
 Monitoreo de Reacciones
Bomba
peristáltica
Espectrómetro

Balón de
Reacción

98
 Screening Rápido de Estupefacientes

99
 Identificación Rápida de Estupefacientes

• Base de datos de análogos - cantidades de microgramos

• Medición en 32 scans aproximadamente 2 minutos

100
 Contenido de H en Combustibles

• HDMSO como patrón interno

• 1 minuto de medición
• ASTM D5291 / 7171

101
Preguntas?

102
Gracias por su atención!

103