“IDENTIFICACION DE BACTERIAS CON PRUEBAS BIOQUIMICAS”

I. INTRODUCCIÓN:

Para que una célula viva, crezca y se reproduzca, debe ser capaz de
incorporar y transformar (mediante el metabolismo) los compuestos
químicos que necesita para obtener energía (catabolismo), así como las
moléculas que pasarán a formar parte de su material celular
(anabolismo). Todas las reacciones químicas que se llevan a cabo son
catalizadas por enzimas (catalizadores biológicos de naturaleza proteica
y actividad específica), las cuales se clasifican, de acuerdo al lugar del
ambiente celular donde actúan, en exoenzimas y endoenzimas. Las
pruebas bioquímicas se emplean para identificar de forma clara y
precisa, la presencia o ausencia de una enzima, de un grupo de
enzimas, o de una vía metabólica completa en uno o más
microorganismos.
La capacidad de utilizar y transformar la energía es una de las
propiedades fundamentales de los sistemas vivientes. La energía puede
hallarse en muchas formas, pero aprovechables a los organismos vivos
solo muy pocas. La energía mecánica se libera, por ejemplo, durante
movimiento celular, agitación de cilios y flagelos, y las alteraciones de la
forma celular; la energía electromagnética se encuentra en forma de
radiaciones (la luz es la fuente de energía primaria para los organismos
sintéticos como las algas y las plantas), la energía térmica es producida
por la agitación molecular y, la energía química que es la contenida en
los enlaces de sustancias y puede ser liberada de los compuestos
orgánicos e inorgánicos a través de ciertas reacciones. Las reacciones
químicas son acompañadas por cambios en el nivel energético. La
energía requerida para que una reacción inicie se llama energía de
activación.
Otros aspectos importantes a considerar es la necesidad de la célula de
poseer, además de catalizadores, una reserva de energía, esta servirá
para los procesos de síntesis celular y en la conversión de sustratos a
formar actividades. En la célula ocurre dos importantes y opuestos
procesos, y la generación de energía y utilización de ella en los procesos
de síntesis celular, los cuales constituyen el metabolismo, este es la
suma de transformaciones de la materia que ocurre en el interior de las
células y que da lugar a la síntesis de material celular a partir de
sustancias nutritivas.

 OBJETIVO:
 Aprender e interpretar algunas de las pruebas bioquímicas
de identificación bacteriana de mayor utilidad.

II. MATERIALES Y MÉTODOS:

 a. Agar TSI:
En tres tubos de ensayo que contenía agar TSI se sembró por
picadura y por estría, las siguientes bacterias: Enterobacter,
Echerichia coli Y Proteus, y lo llevamos a incubar a 37ºC por 24
horas.
b. Agar citrato:
En tres tubos de ensayo que contenían agar citrato se realizó una
siembra por estría de las bacterias: Enterobacter, Echerichia coli
Y Proteus, y lo llevamos a incubar a 37ºC por 24 horas.
c. Medio nitrato:
En tres tubos que contenían medio de nitrato se sembró por
suspensión las bacterias: Enterobacter, Echerichia coli Y Proteus,
y lo llevamos a incubar a 37ºC por 24 horas.
d. Medio movilidad (MIO):
En tres tubos que contenian medio movilidad indol ornitina, medio
semisólido se realizó una siembra por picadura de las bacterias:
Enterobacter, Echerichia coli Y Proteus, y lo llevamos a incubar a
37ºC por 24 horas.
e. Caldo peptonado:
En tres tubos que contenían caldo peptonado se realizó siembras
de las bacterias: Enterobacter, Echerichia coli Y Proteus, y lo
llevamos a incubar a 37ºC por 24 horas.
f. Medio gelatina:
En tres tubos que contenían caldo peptonado se realizo siembras
de las bacterias: Enterobacter, Echerichia coli Y Proteus, y lo
llevamos a incubar a 37ºC por 24 horas.
g. Ox-fer:
En tres tubos que contenían medio de cultivo semi solido de
medio basal O.F. se sembró las bacterias: Enterobacter,
Echerichia coli Y Proteus, y lo llevamos a incubar a 37ºC por 24
horas. Y en otros tres no se sembró nada, pues se dejó como
control

III. RESULTADOS:

a. Agar TSI:

C (-) Enterobacter E.coli Proteus

Color Pico Pico rojo/fondo rojo Pico rojo/fondo Pico rojo/fondo
inicial rojo/fondo rojo rojo rojo
Color Pico pico amarillo/fondo Pico rojo/fondo Pico rojo/fondo
final rojo/fondo rojo amarillo amarillo rojo
resultado No es Fermenta glucosa, Fermenta la No es
fermentador lactosa y/o glucosa fermentador de
C (-) 1 2 6
de azucares
El ennegrecimiento del sacarosa azucares.
b. Agar
medio indicacitrato:
que el
microorganismo produce
ácido sulfhídrico

Produce H2S
 tubos resultad
o
C (-) -
1 Enterobacte
r
+
2 E.coli crecimiento
-
6 Proteus
+

 Positivo (+): crecimiento y color azul en el

pico, alcalinidad.
 Negativo (-): el medio permanece de color
verde debido a que no hay desarrollo
bacteriano y no hay cambio de color.
c. Medio nitrato:

C (-) Enterobacte E.coli Proteus

r 2 6
1
Reacción
- - - -
En el medio de nitrato la reacción es negativa porque no se
formó una coloración roja.
 d. Medio movilidad:

C (-) Enterobacte E.coli Proteus

r 2 6
1
Reacción
- + - -
Movilidad:
-Positiva (+): presencia de turbidez que se extiende más
allá de la línea de siembra.
-Negativa (-): solo se observa turbidez en la línea de
siembra.

e. Caldo peptonado:

C (-) Enterobacte E.coli Proteus

r 2 6
1
Reacción
- - - -
-Reducción de nitratos:

-Positiva (+): desarrollo de color rosado-rojo en la

superficie de la muestra luego del agregado del reactivo
Kovac.
- Negativa (-): ausencia de color rosado rojo en la
superficie de la muestra luego del agregado del reactivo
Kovac.

f. Medio gelatina:

C (-) Enterobacte E.coli Proteus -

r 2 6
1
Reacción
- - - -
positiva: hidrolizan la gelatina
-negativa: no hidroliza la gelatina, cuaja la muestra.

g. Ox-fer:

1 2 1 2 1 2
 E.coli Pseudomona Bacillu
2 s s
3 4
Tubo I A (-) A

Tubo II AG A/(-) A

Se debe informar: producción de ácido (A), ácido con

gas (AG), alcalino (K) o sin cambio (-).
También, puede informarse si el organismo es móvil,
cuando crece lejos de la línea de inoculación.

IV. DISCUSIONES:

El TSI: Medio universalmente empleado para la diferenciación de

bacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la
producción de ácido sulfhídrico. Por fermentación de azúcares, se
producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,
el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se
reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de
hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro (Joklik
WK,1994). Este fundamento explica que en la practica el tubo que
contenía Enterobacteria salga A/A (acido, acido) y la línea negra en el
centro del tubo es porque produce ácido sulfhídrico.

Según (Prescott, Harley,1999): El agar citrato: Medio utilizado para la

diferenciación de bacterias, en base a la capacidad de usar citrato como
única fuente de carbono y energía. El metabolismo del citrato se realiza,
en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo
del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da
progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un
medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como
fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El
medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de
citrato permeasa. Por lo tanto, en los tubos con Enterobacter y Proteus
al cambiar de color indican que producen citrato permeasa lo que da
origen a ácidos orgánicos por lo que cambia el color, y cuando cambia el
color es indicador que hay crecimiento bacteriano.

Medio nitrato: Medio desarrollado por Casellas, para estudiar

simultáneamente la reacción de oxidación o fermentación de glucosa y
la reducción de nitratos a nitritos, por bacilos Gram negativos de fácil
desarrollo. La hidrólisis de la glucosa acidifica el medio, haciendo virar el
azul de bromotimol de verde a amarillo. Si este viraje ocurre solo en la
parte superior del tubo, indica oxidación de la glucosa; si todo el medio
vira al amarillo, hay reacción fermentativa, y si no vira o adquiere un
color azulado, se presume que el germen no utiliza glucosa.
En este medio, además, puede detectarse la movilidad observando si el
crecimiento se aleja de la línea de punción, enturbiando el medio.
La reducción del nitrato a nitrito o gas nitrógeno por medio de la enzima
nitrato reductasa, es un proceso de oxidación por el cual el nitrato
proporciona oxígeno para ser usado como aceptor de electrones ( Bartra
E,2000), pero En la práctica no se observó ningún cambio con el medio
de nitrato,puesto que no cambia el color a rojo, pues esto indicaría la
degradación del nitrato y crecimiento bacteriano.

Según S. Hernandez, 1999: Medio movilidad: Es un medio semisólido

destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de
hidrógeno en un mismo tubo. Las cepas móviles pueden apreciarse en
este medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de
siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se
distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro
a partir del tiosulfato. En la práctica realizada se observó la presencia de
turbidez en todo el tubo que contenía Enterobacter, pero también en el
Proteus, pero eso no se podría decir que es una reacción positiva pues
solo crece en el espacio en el que sembró, no en todo el tubo.

La prueba de licuefacción de gelatina se utiliza como medio de cultivo

gelatina nutritiva, en esta prueba se pretende determinar la capacidad de
un microorganismo de producir enzimas de tipo proteolíticas
(gelatinasas) que licuan/hidrolizan la gelatina o muestran cambios
característicos debido a los productos de degradación. La gelatina como
proteína derivada del colágeno animal es hidrolizada por la gelatinasa en
sus aminoácidos constituidos, con pérdida de sus características
gelificantes. Al comparar con las muestras en la práctica, ninguna de las
bacterias licua o hidroliza la gelatina. Todas las muestras actúan
cuajando.

Según Joklik WK, 1994: La oxido-fermentación: Es una prueba que

indica del tipo de metabolismo energético: Respiratorio (O) o
Fermentador (F). Se suele utilizar glucosa como sustrato. Se detecta la
acumulación de ácidos con un indicador ácido-base (azul de
bromotimol). La bacteria se inocula con el hilo recto (por picadura ) y se
incuba en condiciones de aerobiosis (sin parafina) y de anaerobiosis
(con parafina, tubo cerrado), simultáneamente.
Las bacterias que respiran aerobiamente crecen en la superficie del
medio del tubo abierto. Transforman la glucosa en CO2, la superficie del
medio se verá ligeramente amarilla (por la formación de ácido carbónico
originado al reaccionar el CO2 con el agua del medio). En el tubo
cerrado el cultivo se mantiene azul-verdoso. Las bacterias
fermentadoras producen ácidos a partir de la glucosa. Viran el cultivo del
tubo cerrado a amarillo; en el tubo abierto se inicia el viraje en el fondo,
 pero transcurridas 24 horas los ácidos pueden difundir por todo el medio
virándolo a amarillo.
Producción de ácido en la parte alta del tubo de cultivoque contiene
azúcar; el agar blando se utiliza paradisminuir la mezcla durantela
incubación.
Esta prueba se basa en determinar el metabolismo osicativo o
fermentativo de un hidrato de carbono.
En la práctica se determinó que en los tubos que contenían E.coli y
Bacillus si cambian sus pH de verde a amarillo esto indica el nivel de
acides que producen.

V. CONCLUSIÓN:

En la práctica se logró realizar las pruebas bioquímicas necesarias para

la identificación de bacterias, para medir su pH, observar cuales son
fermentadores, ver si realizan movilidad, si tienen la capacidad de
producir H2S o si degradan azucares, y si pueden crecer en distintos
medios y gracias a esto se logra la identificar las bacterias.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

 Cardella Rosales. Sierra Figuereo S. Hernandez Fernandez R. Et al

Metabolismo de los compuestos nitrogenados de bajo peso
molecular. Editorial de ciencias medicas 1990

 Grupo oceano . Diccionariode medicina. Barcelona. Editorial oceano

p1.150

 Escalante-Minakata, Ibarra-Junquera: Los cultivos mixtos y las

fermentaciones alcohólicas. BioTecnología 2007

 Bartra E: Genética de levaduras. Estación de Viticultura y Enología

de Vilafranca del Penedès, INCAVI 2000

 Prescott, Harley, Klein. Microbiología. Mc Graw-Hill Interamericana

de España. 4ª ed. 1999

 Joklik WK, Willett HP, Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser
Microbiología. 20ª ed. BsAs. Panamericana;1994