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Université Ibnou Zohr Année universitaire 2012/13

Faculté des sciences


Laboratoire de Microbiologie
Agadir

Déroulement du TP N°1 : « Microbiologie du sol »


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Première séance (4 heures) :


Les manipulations se dérouleront comme suit :
1) Chaque quadrinôme prépare une suspension mère de l’échantillon du sol à étudier :
a) Utiliser la balance électronique placée sur la paillasse latérale pour peser 10 g
de sol tamisé finement,
b) Placer les 10 gr de sol dans un mortier stérile et broyer finement l’échantillon
de sol et y versant à chaque fois quelques millilitres d’eau physiologique stérile
sans dépasser 50 mL,
c) Placer dans une fiole jaugée un petit barreau aimanté, tout le contenu du
mortier en le rinçant à chaque fois et ajuster le volume à 100mL en aoutant de
l’eau physiologique stérile à petites fractions. Ne pas dépasser le trait indiquant le
volume de 100 ml,
d) Placer la fiole sur l’agitateur et laisser agiter 5 minutes. C’est la suspension
mère de sol.

2) La suite de la manipulation se portera sur l’étude de la flore microbienne de la


suspension préparée par le premier quadrinôme :
a) Le premier quadrinôme prépare deux dilutions (10-1 et 10-2) à partir de la
suspension mère,
b) Le deuxième quadrinôme prépare deux dilutions (10-3 et 10-4) à partir de la
dilution 10-2 préparée par le premier quadrinôme,
c) Le troisième quadrinôme prépare deux dilutions (10-5 et 10-6) à partir de la
dilution 10-4 préparée par le deuxième quadrinôme,
d) Le quatrième quadrinôme prépare deux dilutions (10-7 et 10-8) à partir de la
dilution 10-6 préparée par le troisième quadrinôme,
e) Le cinquième quadrinôme prépare deux dilutions (10-9 et 10-10) à partir de la
dilution 10-8 préparée par le quatrième quadrinôme,
f) Le sixième quadrinôme prépare deux dilutions (10-11 et 10-12) à partir de la
dilution 10-10 préparée par le cinquième quadrinôme,

3) Dénombrement de la flore bactérienne totale


a) Utiliser la gélose en boite de Pétri préparée pour le dénombrement des bactéries du
sol,
b) Ensemencer par étalement deux boites par dilution (0,1 mL par boite),
c) Incuber les boites à 37°C pendant 24h.

4) Dénombrement des bactéries ammonifiantes par la méthode du nombre le plus


probable (NPP)
a) Porter 0,1 mL de chaque dilution dans un tube contenant le milieu liquide
spécifique pour le dénombrement des bactéries ammonifiantes,
b) Recommencer cette opération 3 fois (3 répétions pour chaque dilution),
c) Incuber les tubes à 28°C pendant 5 à 7 jours.

5) Dénombrement des bactéries dénitrifiantes par la méthode du nombre le plus


probable
a) Porter 0,1 mL de chaque dilution dans un tube contenant le milieu liquide
spécifique pour le dénombrement des bactéries dénitrifiantes,
b) Recommencer cette opération 3 fois (3 répétions pour chaque dilution),
c) Incuber les tubes à 28°C pendant 7 à 15 jours.

6) Dénombrement des spores bactériennes


a) Chauffer les suspensions 10 minutes à 80°C,
b) Utiliser la gélose en boite de Pétri préparée pour le dénombrement des bactéries du
sol,
c) Ensemencer par étalement deux boites par dilution (0,1 mL par boite),
d) Incuber les boites à 37°C pendant 7 jours.
Deuxième séance (2 heures) : lecture des résultats et rédaction du compte rendu
1) Dénombrement de la flore bactérienne totale :
a) Compter les colonies visibles sur la surface de la gélose nutritive pour le
dénombrement des bactéries telluriques,
b) Calculer le nombre de colonies formants unités de bactéries par mL de la
suspension mère du sol (N = nombre de colonies comptées X le volume
ensemencé X le taux de la dilution qui a servi au dénombrement). Compter
uniquement les boites qui montrent un nombre de colonie compris entre 30 et 300
colonies),
c) Exprimer le résultat final en UFC par gramme de sol frais.

2) Dénombrement des bactéries dénitrifiantes par la méthode du nombre le plus


probable :
a) Pour chaque tube placer 1mL de la culture dans un tube à hémolyse stérile,
b) Ajouter 50 mg d’urée, 10 gouttes d’acide sulfurique et 10 gouttes de réactif à la
diphénylalanine,
c) Si aucune coloration n’apparait c’est que les nitrates présents dans le milieu de
culture ont été assimilés par les bactéries présentes dans l’échantillon de sol étudié,
a) Exprimer le NPP des bactéries dénitrifiantes par gramme de sol frais (utiliser la
table de Mac Grady).

3) Dénombrement des bactéries ammonifiantes par la méthode du nombre le plus


probable :
b) Ajouter 5 gouttes du réactif de Nessler dans chaque tube,
c) Si une coloration orange apparait, on déduit qu’il y a présence de bactéries
dénitrifiantes,
d) Déterminer le NPP/ mL de la suspension mère du sol,
e) Exprimer le NPP des bactéries ammonifiantes par gramme de sol frais.

4) Dénombrement des spores bactériennes


a) Compter les colonies visibles sur la surface de la gélose nutritive pour le
dénombrement des spores des bactéries,
b) Calculer le nombre de colonies formants unités des spores des bactéries par mL de
la suspension mère du sol (N = nombre de colonies comptées X le volume
ensemencé X le taux de la dilution qui a servi au dénombrement),
c) Exprimer le résultat final en UFC par gramme de sol frais.

Rédiger un compte rendu pour chaque manipulation en suivant le plan ci-dessous :

1) Titre de l’expérience
2) But de l’expérience
3) Matériel utilisé pour réaliser l’expérience
a) Echantillon étudié
b) Petit matériel
c) Gros matériel

4) Méthode utilisée pour réaliser l’expérience


a) Schématiser la technique utilisée (schéma, titre et légende)
b) Schématiser la lecture des résultats (schéma, titre et légende)

5) Résultats de l’expérience
a) Rassembler les résultats de tout le groupe,
b) Présenter ces résultats sous forme de tableau
c) Titrer et légender le ou les tableaux

6) Interprétation des résultats


Interpréter vos résultats en fonction de l’objectif fixé pour l’expérience.

7) Conclusion

Note : Un compte rendu pour chaque étudiant sera noté et


considéré pour la note finale de l’examen des TP de
microbiologie.