MANUAL DE PRÁCTICAS

(Cultivo de células y tejidos)

[Dra. Areli del Carmen Ortega Martínez, Dra. Patricia
Pavón Orozco
(1a. EDICION)

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CAMPUS COATZACOALCOS
(INGENIERIA EN BIOTECNOLOGÍA )
(2017)
 ÍNDICE

INTRODUCCIÓN........................................................................................................................................................ 3

COMPETENCIAS A DESARROLLAR………………………………………………………...3

MEDIDAS DE SEGURIDAD ....................................................................................................... 3

INSTRUCTIVO PARA ELABORAR REPORTES .................................................................... 4

PRÁCTICA NO. 1 Inmovilización de células

……………………………………………………………………………………………………...5

PRÁCTICA 2 Organización de laboratorio de cultivo de células y

NO.
tejidos…………….………………………………………………………………………………10

PRÁCTICA NO. 3 Germinación de semillas de diversas especies en condiciones de

asepsia …………………………………..…………………………………………………....12

PRÁCTICA NO. 4 Inducción de callos …………………………………………………...16

.
.
Anexos.- Formulación de medios…………………………………………………………… 19
.
.
.

2
INTRODUCCIÓN

El cultivo de células y tejidos es un área de especialidad metodológica que surge en el

siglo XIX como una estrategia para el estudio del comportamiento de las células libres
de las variaciones que ocurren en el organismo. Se ha convertido en una herramienta
útil tanto en investigación como en producción de sistemas biotecnológicos.

Es un área de continua expansión y aplicación en la ingeniería en biotecnología por lo

que forma parte del área de especialidad del programa de la ingenería en
biotecnología.

El presente manual de prácticas tiene como objetivo guiar al estudiante de IBT en la

revisión de aspectos prácticos de laboratorio del programa de Cultivo de Células y
Tejidos. Con este fin, aborda la revisión práctica de temas abordados en el aula para
que mediante un desarrollo metodológico, el estudiante sea capaz de revisar los
conceptos teóricos de forma analítica y crítica.

COMPETENCIAS A DESARROLLAR
“El estudiante de forma analítica, con compromiso y responsabilidad:
• Inmoviliza células a partir de un cultivo celular
• Implementa condiciones para el desarrollo de callos y diferenciación
• Propaga y germina semillas in vitro
• Prepara medios de cultivo para propagación vegetal

MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

En todo momento el estudiante seguirá el reglamento general del laboratorio, seguirá
las instrucciones del profesor y del responsable del laboratorio.
Se deberá presentar con bata en todas las prácticas así como guantes y cubrebocas en
las prácticas que así lo especifiquen. De tener cabello largo, deberá recogerlo y
contenerlo antes de entrar al laboratorio. No se permite el uso de dispositivos
electrónicos en las cercanías del área de trabajo ni en las bolsas de las batas.
Leer instrucciones de uso y manejo de los reactivos a usar.

3
INSTRUCTIVO PARA LA ELABORACIÓN DE REPORTES
Los reportes se elaboraran como reporte científico bajo la siguiente rúbrica
CONTENIDO SUFICIENTE DEFICIENTE INSUFICIENTE VALOR
MÁXIMO
Introducción Contiene revisión de Contiene revisión de Contiene revisión de 10%
conceptos teóricos conceptos teóricos conceptos teóricos de
que refuerzan los de forma general, no forma general, no
aspectos de la refuerzan los refuerzan los
práctica. Además, aspectos de la aspectos de la
usa una redacción práctica. O bien, usa práctica. Presenta
clara concisa y redacción deficiente. usa redacción
sintetizada sin caer Evita el plagio. deficiente. Cae en
en plagio. Además Además Usa plagio. Uso de
Usa adecuadamente adecuadamente las referencias
las referencias. referencias. Omite el inadecuado. Omite el
Declara el objetivo objetivo de la objetivo de la práctica
de la práctica práctica
Metodología Metodología Metodología copiada Enumeración de la 10%
adecuada a las de la práctica sin metodología de la
modificaciones que incluir práctica dada.
se hacen en la modificaciones o
práctica de acuerdo anotaciones que se
a los cambios que realizaron durante la
se dan. Bien práctica. Bien
redactada a forma redactada a forma
de metodología sin de metodología sin
usar enumeración. enumeración
Resultados Usa apoyos gráficos Se presentan Se presentan 30%
para la presentación resultados de forma resultados de forma
de resultados o bien desordenada, sin desordenada, sin
tablas. Todos los coherencia. coherencia y con
apoyos están Presenta redacción mala redacción .No
debidamente deficiente. Incluye incluye uso de
rotulados. Todos los uso de gráficos o gráficos o tablas bien
cálculos se incluyen tablas bien rotulados o comete
de forma clara y rotulados. Son abuso de su uso. Son
concisa. Son objetivos subjetivos
objetivos
Discusión Se discuten los Se discuten los No se discuten los 30%
resultados obtenidos resultados obtenidos resultados obtenidos
con fundamentos con fundamentos con fundamentos
teóricos actuales. teóricos actuales. S teóricos actuales.
Además, se hace e hace una revisión Carece de una
una revisión insuficiente de la revisión bibliografía
suficiente de la bibliografía para para respaldar los
bibliografía para respaldar los resultados
respaldar los resultados reportados. Repite
resultados reportados. Repite resultados y además
reportados. Solo se resultados pero de es subjetiva carece
limita a discutir forma objetiva y de buena redacción.
resultados de forma clara.
objetiva y clara.
conclusiones Son de acuerdo al Repite resultados. Es subjetiva, repite 20%
objetivo de la Carece de redacción resultados. Carece de
práctica. Correcta adecuada para una redacción adecuada
redacción de una conclusión pero es para una conclusión
conclusión sin objetiva
repetir resultados.
Referencias La falta de
referencias se
penalizará con
10%
Cuestionario La falta de la
contestación
del
cuestionario
se penalizará
con 10%

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 UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CULTIVO DE
CÉLULAS Y
TEJIDOS

PRÁCTICA No. 1

INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS

SUSTENTO TEÓRICO

Las células inmovilizadas se encuentran localizados en cierta región definida del espacio,
su característica es que son capaces de retener su actividad metabólica y catalítica así como
en lo posible, su viabilidad. Una de las ventajas es que pueden ser usados de modo repetido
y continuo.

La inmovilización de células o enzimas tiene numerosas aplicaciones en biotecnología,

biomedicina, farmacología (producción de antibióticos), producción de bebidas y alimentos
(producción de cerveza, exopolisacárido), agricultura y ganadería (producción de esperma
para mejoramiento animal), biorremediación (decoloración de colorantes textiles,
remoción de metales pesados), etc.

Existen distintos métodos de inmovilización:

a)Adsorción: No daña las células, pero como la fuerza de unión es baja, se produce elusión

de las células, lo cual produce pérdidas importantes de células en los procesos continuos.

b) Uniones iónicas: los soportes son intercambiadores iónicos, es una metodología sencilla,

pero cambios en el pH o la concentración de sales, puede separar las células del soporte.

c)Uniones covalentes: uniones son más fuertes, hay que modificar proteínas de las células
o regiones de la enzima. Hay que verificar que no haya pérdida de la actividad catalítica.
Es más costoso.

d) Entrecruzamiento: entre aminoácidos de la proteína y agentes polimerizantes como el

glutaraldehído.

f) Encapsulación Microencapsulación en polímeros: se rodean células o enzimas

físicamente en geles microcápsulas o polímeros fibrosos como la celulosa. Los geles son
polímeros entrecruzados insolubles en agua, como la poliacrilamida. En el caso de las
microcápsulas, las células o enzimas se rodean de una membrana semipermeable del
polímero.
OBJETIVO

5
Obtener esferas con levadura inmovilizadas en alginato y/o agar.

COMPETENCIAS A DESARROLLAR

El estudiante cultiva e inmoviliza células eucariotas en dos soportes. Además,

de forma analítica y objetiva, justifica el uso de soportes evaluados.

DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA

MATERIAL
Jeringa estéril.
2 cajas petri
4 vasos de precipitados 250ml
1 vaso de 100ml
1 matraz de 500ml
Imanes para agitación
Tubos para centrifuga

EQUIPO
Campana de flujo laminar
Incubadora con agitación orbital
Incubadora
Centrifuga
Parrillas de calentamiento y agitación

REACTIVOS
Medio de cultivo de activación de levadura: Extracto de levadura, peptona, glucosa
50ml Solución acuosoa de NaCl al 0.85% (p/v)
50 ml Solución acuosa CaCl2 1M (p/V)
100ml amortiguador de fosfatos 0.1N, pH 5.5
50 ml solución de agar 1.2% (p/v) (Será preparada por el equipo)

Aceite vegetal

6
Alginato de sodio

Agar

PROCEDIMIENTO
ANTES DE INMOVILIZACIÓN:

A) PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

1. Preparar medio para crecimiento de levadura 150 ml
Medio para levadura: Extracto de levadura 10g/L, peptona 20g/L, glucosa 20g/L
2. Preparar 50 ml solución de agar 1.2% (p/v) Al usar mantener a 50°C
Esterilizar y mantener estéril.

B) OBTENCIÓN DE BIOMASA A PARTIR DE LEVADURA SECA (DIA 1)

NOTA: Todo trabajo con la levadura se realizará en la campana de flujo laminar

Disolver la levadura 3g en 20 ml de medio de cultivo estéril para activación en condiciones

asépticas, transferir la disolución al matraz de cultivo conteniendo medio de cultivo de
activación.

Colocar en agitación rotacional a 200rpm 30°C por 36 horas

Evaluar por resiembra en caja y al microscopio posibilidad de contaminación

En caso de existir contaminación, aislar la levadura en repeticiones y diluciones.

Seguir cinética de crecimiento cada 6-8 horas por D.O.600nm para detener crecimiento en
fase estacionaria (idealmente entrando a fase estacionaria)

Centrifugar el medio de cultivo 8000 rpm a 4°C por 5 minutos, para obtener el pellet a
inmovilizar. Obtener 2 porciones de 100 g de células en pastilla húmeda para realizar las 2
inmovilizaciones.

Preparación de 2 cajas medio sólido para preservación de levadura seca

INMOVILIZACIÓN (DIA 2)

Preparación alginato:

1. Disolver 3 g de alginato de sodio en 100ml de medio. Agitar hasta que el alginato se

haya disuelto completamente. La solución final contiene 3% de alginato en peso.

7
 2. NOTA: La solución de alginato de sodio se prepara mejor agregando el polvo al
líquido en agitación para evitar la formación de aglomerados. Puede requerir
agitación prolongada para lograr una disolución completa. Después de que se ha
disuelto, dejar la solución sin agitación por 30 minutos para eliminar burbujas de aire
que hayan quedado atrapadas.

Resuspender las células en la solución de alginato preparada previamente. Permitir

escapar las burbujas de aire.

Medir D.O. 600nm

NOTA: Debido a que el crecimiento celular puede romper el lecho, las células
deberían idealmente haber entrado en fase estacionaria. La relación de peso seco a
peso húmedo es aproximadamente de 4 para la mayoría de las células, en caso de
usar células secas.

3. Gotear la mezcla de alginato-levadura desde una altura de 20 cm en una solución

entrecruzadora de 300ml ( añadiendo CaCl2 a una concentración 0.05M de en el
medio de crecimiento). La solución entrecruzadora debe mantenerse en agitación
continua con agitador magnético. La formación de gel puede realizarse a
temperatura ambiente tan pronto como las gotas entran en contacto con la solución
de calcio. Se desean pequeñas esferas de alginato para minimizar la resistencia a
transferencia de masa. Se pueden lograr 2mm de diámetro con ayuda de una jeringa
y aguja. Las esferas se endurecen preferencialmente entre 1 y 2 horas.
(Alternativamente se pueden enfriar en baño de y hielo 30 minutos)
4. Medir D.O. 600nm en la solución sobrante.
5. Lavar las esferas con solución de entrecruzamiento de calcio.
6. Construcción de reactor de células inmovilizadas con un matraz de 500 ml
(Práctica de E.E. ingeniería de reactores bioquímicos)

Inmovilización agar
1. Mezclar la otra mitad de levaduras en 50ml de NaCl2 con 50ml de una solución
estéril de agar al 1.2% manteniendo a 50°C
2. Medir D.O. 600nm
3. Mezclar con 50ml de aceite vegetal en una mezcla 25% (p/p)
4. Agitar para la obtención de esferas
5. Enfriar en un baño de hielo a 0°C
6. Filtrar las esferas y lavar con amortiguador de acetatos 0.1N pH= 5.5
7. Medir D.O. 600nm en filtrado.
8. Almacenar esferas en el mismo buffer.

8
CUESTIONARIO

BIBLIOGRAFÍA
Nagashima, M., Azuma, M., and Noguchi, S., Technology developments in biomass alcohol production in Japan: continuous alcohol
production with immobilized microbial cells, Ann. N.Y. Acad. Sci.,413, 457, 1983.

Nam Sun Wang. Department of Chemical & Biomolecular Engineering

University of Maryland.

POTTER, Norman N. La ciencia de los alimentos. Ed. Harla, México. (1978). Pág.

359-376.

JAGNOW, G. Y David W.Biotecnología: inducción con experimentos modelos. Ed.

Acribia, Zaragoza-España (1991).

NOTA AL EQUIPO: Es altamente recomendable iniciar la preparación

de auxinas y citoquininas como descrito en ANEXO II. Se puede realizar
fuera del laboratorio.

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 UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CULTIVO DE
CÉLULAS Y
TEJIDOS

PRÁCTICA No. 2

ORGANIZACION DE LABORATORIO DE CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS

SUSTENTO TEÓRICO

El cultivo celular es una herramienta útil tanto en investigación como en producción de

sistemas biotecnológicos ya que facilita el análisis de propiedades y procesos biológicos
que no están accesibles a nivel de un organismo intacto. El éxito en el mantenimiento de
células en cultivo, sea primaria o inmortalizada, requiere del conocimiento y prácticas de
consideraciones técnicas esenciales. Existen cuatro requerimientos básicos para el éxito del
cultivo de células. La primera necesidad es un equipo que facilite el cultivo de forma propia
y establecida. El nivel de bicontención requerida es dependiente del tipo de cultivo de
células y el riesgo de contaminación de estas así como la transmisión de agentes
infecciosos. Por ejemplo, las células de primates, líneas celulares humanas, líneas celulares
contaminadas con mycoplasma y células humanas no probadas, requieren un nivel de
contención mínimo de 2.

El Segundo requerimiento es la práctica de la técnica de esterilidad. Antes de iniciar

cualquier trabajo, una cabina de seguridad debería encenderse al menos 15 minutos para
purgar el aire contaminado. Todas las superficies deben estar sin contaminación y se debe
poner especial atención en que todo que entre en contacto con las células haya sido
esterilizado.

Una tercer necesidad es el uso de suplementos y reactivos controlados de calidad y

apropiados; para la mayoría de los protocolos y usos, es aceptable el grado reactivo así
como plásticos para uso de cultivo de célula apropiado. Esto asegura tanto la adherencia
como el crecimiento y el mantenimiento del grado de esterilidad requerido. Por último se
requiere conocimiento y prácica en las técnicas de cultivo de las células de interés.

OBJETIVOS

1. Conocer los requerimientos de un laboratorio, instalaciones, áreas, equipos, materiales y

suministros necesarios o indispensables para la realización de actividades del cultivo in

vitro de

tejidos vegetales.

10
2. Conocer los requerimientos de un laboratorio, instalaciones, áreas, equipos, materiales y

suministros necesarios o indispensables para la realización de actividades del cultivo in

vitro de

tejidos animales.

3. Diseñar las áreas necesarias para los procedimientos que permitan la elaboración de
medios de cultivo, el aislamiento y cultivo in vitro de células, tejidos y órganos vegetales,
así como su incubación.

4. Conocer como ejemplo las normas de cada área de trabajo de un laboratorio de cultivo
de células y tejidos

COMPETENCIAS A DESARROLLAR

El estudiante diseñará un laboratorio de cultivos de células y tejidos en tres

niveles: enseñanza, uno de investigación y un laboratorio comercial.
DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA

MATERIAL

A los alumnos investigaran en medios electrónicos, libros revistas científicas, las

necesidades y requerimientos de laboratorios de enseñanza, investigación y de tipo
comercial.

PROCEDIMIENTO
Los alumnos realizarán investigación bibliográfica sobre las áreas de un laboratorio de
cultivo de células y tejidos, necesidades, requerimientos, equipos básicos e instalaciones.

Los alumnos justificarán su uso y aplicación, así como el manejo y precauciones dentro del
laboratorio

En base a lo investigado, diseñarán un laboratorio de cultivo de células y tejidos.

CUESTIONARIO

BIBLIOGRAFÍA
Helgason C.D., and Miller C.L. Basic Cell Culture protocols 3rd Edition. Methods in molecular biology volume 290

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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

(EXPERIENCIA EDUCATIVA)
PRÁCTICA No. 3
Germinación de semillas de diversas especies en condiciones de asepsia

SUSTENTO TEÓRICO

INTRODUCCION

Las semillas proceden de los primordios o rudimentos seminales de la flor, una vez
fecundadas y maduras. Su función es la de dar lugar a un nuevo individuo, perpetuando y
multiplicando la especies a la que pertenece. La semilla consta esencialmente de
un embrión (formado por un eje embrionario y uno, dos o varios cotiledones), una provisión
de reservas nutritivas, que pueden almacenarse en un tejido especializado
(albumen o endospermo) o en el propio embrión, y una cubierta seminal que recubre y
protege a ambos.

Las semillas son la unidad de reproducción sexual de las plantas y tienen la función de
multiplicar y perpetuar la especie a la que pertenecen. Además, es uno de los elementos más
eficaces para que la especie se disperse, tanto en el tiempo como en el espacio. Para que la
semilla cumpla con su objetivo es necesario que el embrión se transforme en una plántula,
que sea capaz de valerse por si misma y, finalmente convertirse en una planta adulta. Todo
ello comprende una serie de procesos metabólicos y morfogenéticos cuyo resultado final es
la germinación de las semillas (Pére Garcia et al, 1998).

Se conocen identificados 4 requerimientos abióticos básicos necesarios para la

germinación:
1. Agua, que contribuye con el potencial hídrico del ambiente y de la semilla. Se considera
el factor determinante para la germinación.
2. Oxígeno, en forma gaseosa o disuelto en agua.
3. Temperatura, específica para cada especie.
4. Luz, se considera un promotor de la germinación.

Existen factores que afectan la germinación los cuales, se pueden dividir en dos grupos:
Factores internos o intrínsecos: son aquellos propios de la semilla como madurez y
viabilidad
Factores externos o extrínsecos: son aquellos que dependen del ambiente como agua,
temperatura y gases.

En el proceso de germinación, se pueden distinguir tres fases como son (Azcón-Bieto y

Talón 1993):

a) Fase de hidratación
Se refiere a la absorción de agua por parte de los tejidos que conforman a la semilla.
Este incremento va ligado a un incremento proporcional en la actividad respiratoria
b) Fase de germinación

12
 Se producen transformaciones metabólicas necesarias para el desarrollo de la
plántula. La absorción de agua se reduce al máximo.
c) Fase de crecimiento
Última fase que se asocia con la emergencia de radícula la cual es visible. La
absorción de agua vuelve a aumentar así como la actividad respiratoria.

OBJETIVO

• Inducir la germinación de semillas de diferentes especies vegetales para la obtención

de plántulas libres de hongos y bacterias.

COMPETENCIAS A DESARROLLAR

El estudiante inducirá la germinación de semillas de diferentes especies

vegetales.

MATERIAL

BIOLÓGICO
Semillas de jitomate, lechuga, zanahoria

MATERIAL DE LABORATORIO

2 matraz Erlenmeyer de 500 mL

2 vaso de precipitados de 100 o
250 ml
1 piseta de 250 mL
1 agitador de vidrio
rollo de papel aluminio
4 cajas de Petri
rollo de algodón
1esponja
10 Frascos tipo “Gerber” con tapa de polietileno o Tubos de ensaye 2.5 x 30 cm
Masking-tape
2 Espátulas o cucharas de acero
inoxidable

EQUIPO
Campana de flujo laminar
Autoclave
Potenciómetro
Balanza analítica

REACTIVOS
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Etanol al 70%
HCl 1.0 N
NaOH 1.0 N
H2SO4 3.0 M

NaClO 1%
Extran 2%

PROCEDIMIENTO
DESARROLLO EXPERIMENTAL:
Esterilizar previamente por equipo:
• 2 vasos de precipitado de 250 mL
• 1L de agua destilada
• 2 espátulas

Medios de cultivo

PROCEDIMIENTO:

Preparación del medio de cultivo:

1. Según el número de equipos y las especies vegetales a utilizar, preparar medio de
cultivo semisólido de Knop o MS según la formulación indicada en el Anexo 1. El
pH deberá ajustarse con NaOH 1.0 N antes de adicionar el agar a los medios (Medio
Knop a pH de 5.5 y Medio MS a pH. Preparar medio de cultivo en cantidad
suficiente para 10 frascos o 10 tubos.
2. Fundir el agar en calor y verter 20 mL en cada frasco (tipo “Gerber”) o 15 mL en
cada tubo, cubrir con tapa de plástico o doble tapa de papel aluminio y sujetar con
ligas o Masking-tape, esterilizar en autoclave a 121°C y 15 psi de presión durante
15 min.

Desinfección de semillas:
El siguiente protocolo puede ser utilizado para semillas de zanahoria, jitomate y lechuga.
a. Colocar las semillas en 10 ml agua con extrán al 2% (o detergente) durante 30-40
minutos, mantener en agitación (manual o con un agitador magnético).
b. Enjuagar tres veces con agua estéril para eliminar el detergente. A partir de este paso
trabajar en la campana de flujo laminar. Utilizar la espátula estéril para retener las semillas.
c. Sumergir las semillas en una 50 ml de solución de etanol al 70% por 30 segundos
(exactos).
d. Enjuagar tres veces con agua estéril para eliminar el etanol.
e. Transferir las semillas a un vaso estéril y sumergirlas en 50 ml de solución de hipoclorito
de sodio al 1% de cloro libre durante 10 min.

14
f. Lavar las semillas cinco veces con agua estéril para eliminar el hipoclorito de sodio y
decantar, ayudándose con la espátula estéril.

Siembra e incubación de las semillas

g. Del vaso de precipitados, tomar una a una las semillas y colocarlas en los tubos o frascos
que contengan medio de Knop o MS con la ayuda de una espátula estéril.
h. Colocar 3-5 semillas en cada tubo o frasco, procurando que queden separadas y en
contacto con el medio de cultivo.
i. Colocar los recipientes con las semillas en un cuarto de cultivo en oscuridad a una
temperatura de incubación de entre 24 a 26 ºC.
Observar cada semana las semillas. Separar los tubos o frascos contaminados y anotar si se
trata de contaminación bacteriana o fúngica. Los frascos o tubos contaminados deberán
esterilizarse a la brevedad.
k. A la aparición del coleóptilo, exponer los tubos al fotoperíodo natural hasta que la
plántula alcance una altura aproximada de 8-10 cm (dependiendo de la especie).

CUESTIONARIO

1. ¿Qué pasa si las semillas se dejan más tiempo en etanol?

2. ¿Por qué las semillas de B. hemisphaerica son tratadas con H2SO4?
3. ¿Qué es el coleóptilo?
4. ¿Por qué algunas semillas requieren de la obscuridad para germinar? ¿Qué tipo de
tratamiento luminoso requieren algunas semillas para poder germinar?

INCLUIR EN RESULTADOS Y DISCUSIÓN LOS SIGUIENTES PUNTOS:

El tiempo de germinación de las semillas
El % de germinación.
Por única ocasión, una comparación de estos resultados con los demás equipos.
Discutir a detalle el papel que juega cada una de la soluciones en el proceso de
desinfección.

BIBLIOGRAFÍA

Pérez García, F. y Martínez-Laborde, J.B.(1994). "Introducción a la Fisiología Vegetal". Ediciones Mundi-Prensa

Azcón-Bieto J. y Talón M.,1993. Fisiología y Bioquímica Vegetal Interamericana/McGrawHill

Kieran, P.M., Mac Loughlin P.F., Malone D.M. (1997). Plant cell suspension
cultures: some engineering considerations. Journal of Biotechnology. 59, 39-52.

Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3):
473-497.

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 UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

(EXPERIENCIA EDUCATIVA)
PRÁCTICA No. 4

INDUCCIÓN DE CALLOS

SUSTENTO TEÓRICO

Una de las características centrales de las células vegetales es su alta plasticidad para
realizar diferenciación celular. Las plantas generan masas celulares desorganizadas, como
tumores o callos, en respuesta a algún estrés como heridas o infecciones patógenas. La
formación de callos en árboles caídos se ha estudiado desde hace más de 200 años,
acuñándose el término “callus” para la formación de acumulaciones celulares asociadas con
heridas.
Actualmente, se usa la misma palabra para la asociación de masas celulares que de forma
colectiva se le conoce como callos. Estos pueden ser producidos a partir de una célula
diferenciada que tenga la capacidad de regenerar a una planta completa; muchos de las
células de los callos son totipotenciales. Bajo ciertas condiciones, las células de los callos
también sufren embriogénesis somática, un proceso en el cual los embriones son generados
a partir de células somáticas adultas.
Es debido a esto que al menos algunas formas de formación de callos, involucran
desdiferenciación celular. Sin embargo, se sabe que los callos son muy diversos y pueden
existir varios subgrupos basados en sus características macroscópicas.

OBJETIVO:

Conocer e implementar técnicas de desinfección en inducción de callos

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Inducir desdiferenciación tisular en explantos provenientes de tejidos vegetales

Acelerar el crecimiento de plantas usando medios suplementados con fitohormonas

COMPETENCIAS A DESARROLLAR

El estudiante inducirá desdiferenciación tisular de explantes de tejidos

vegetales.

MATERIAL
bisturí, pinzas, mecheros, frascos, placas de vidrio, gasa, algodón, papel alumnio, papel
craft, vinilpel, cinta de enmascarar, probetas, matraces, pipetas, guantes, tapabocas, gorro,
material vegetal (frijol verde, zanahoria, planta aromática a elección).

16
EQUIPO
balanza, potenciómetro, agitador magnético, cámara de flujo laminar, incubadora

REACTIVOS

Auxinas o Ácido 2-4-diclorofenoxiacético (2,4-D),

citoquininas: kinetina o 6-benzilaminopurina (BA) (stock: 1mg/ml en HCl 0.5N; se usa a
1mg/L),
hipoclorito de sodio 2%,
alcohol industrial,
etanol 70%,
agar, sacarosa, medios de cultivo, Medio MS
Tween 80 (Esterilizar 1ml por grupo)
Agua destilada estéril (Suficiente para lavados

PROCEDIMIENTO

1. Preparación del medio de cultivo

Preparar medio en condiciones estériles 15psi 121°C 20 minutos
a) Medio para Inducción de callos
Preparar 60ml de MS suplementado con sacarosa 3%, vitaminas, agar
(0.8%) y sin reguladores de crecimiento
Control: 60ml de MS enriquecido con las condiciones auxina:
citoquinina 2:1
b) Medio de crecimiento
Preparar 60ml de MS enriquecido con sacarosa 3%, vitaminas, agar
(0.8%) y sin reguladores de crecimiento (medio control) y 60 ml de
medio control enriquecido con relación auxina:citoquinina 1:2

2.- Desinfección

Lavar el material vegetal con agua y jabón, sumergir en 50 ml de etanol al 70%, 2 min.
Sumergir posteriormente en 50ml de hipoclorito de sodio (2%, 15 min) con 2 gotas de
Tween 80. Posteriormente, eliminar el desinfectante mediante 3 lavados consecutivos con
agua destilada estéril (5min cada uno). Transferir a cada medio en condiciones estériles de
temperatura 25°C y fotoperiodos de 16h.

3.- Práctica

Revisar los cultivos una vez por semana, anotar los avances que presenten, callos,
contaminaciones, organogénesis, aumento en longitud o tamaño.

Justificar los procesos que se llevan a cabo en comparación con los controles

17
BIBLIOGRAFÍA

Momoko Ikeuchi, Keiko Sugimoto, and Akira Iwas The Plant Cell, Vol. 25: 3159–3173, September 2013

Neely, D. (1979). Tree wounds and wound closure. J. Arboriculture 5:135–140.

18
 ANEXO I FORMULACIÓN DE MEDIOS

Medio de Knop

Reactivo mg/L

MgSO4.7H2O 200

KNO3 200

KH2PO4 200

Ca(NO3)2*4H2O 800

Agar 8000

pH 5.5

Medio de Murashige y Skoog (1962)

Macronutrientes Concentración Volumen del

mg/L solución stock por L de
medio

NH4NO3 1650 100 ml

KNO3 1900

CaCl2.H2O 440

MgSO4.2H2O 370

KH2PO4 170

NaH2PO4.H2O 85

Micronutrientes Concentración
final mg/L

KI 0.83

H3BO3 6.20

MnSO4.4H2O 22.3

19
ZnSO4.4H2O 8.6

Na2MoO4.*2H2O 0.25

CuSO4 5H2O 0.025

CoCl2.6H20 0.025

Na2EDTA.2H2O 37.2

FeSO4.7H2O 27.8

Vitaminas (mg/L) volumen de la solución stock por L de medio

Inositol 100 10 ml
Nicotínico 0,5
HCl-Piridoxina 0,5
Glicina 2
HCl-Tiamina 0.1

Sacarosa 30g/L

Agar 8 g/L

pH 5.8

Elaboración de soluciones stock del medio Murashige y Skoog

Stock de macronutrientes: 10X

Macronutriente g/L stock volumen a usar

NH4NO3 16.5 100 ml

KNO3 19

CaCl2.H2O 440

MgSO4.2H2O 3.70

KH2PO4 1.70

NaH2PO4.H2O 0.85

Micronutrientes

Micronutrientes mg/100 mlL stock 10 ml

20
KI 83

H3BO3 620

MnSO4.4H2O 2230

ZnSO4.4H2O 860

Na2MoO4.*2H2O 25

CuSO4 5H2O 2.5

CoCl2.6H20 2.5

Laboratorio preparar: stock

Stock de Fe-EDTA:

El hierro se añade quelado en el siguiente stock:

Disolver 3.7g de EDTA disódico en 900ml de agua destilada. Se obtendrá una solución
clara a 15 min a Tamb

Añadir 2.8g de sulfato ferroso heptahidratado. Se obtendrá un color amarillo claro

Aforar a 1L y almacen en una botella ambar para proteger de la luz

Usar 10ml de la solución para cada L de medio

Stock de vitaminas: usar 10ml de la solución stock para 1L de medio

Vitamina (mg/100ml)
Inositol o mioinositol 1000
Nicotínico 5
HCl-Piridoxina 5
Glicina 20
HCl-Tiamina 1

El stock de vitaminas se esterilizará por filtración y se añadirá en condiciones asépticas al

medio estéril.

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 ANEXO II PREPARACIÓN DE EXTRACTO DE AUXINAS y CITOQUININAS

Material:
100g lentejas
500ml de agua destilada
1 vaso de precipitados 1L
Mortero

Procedimiento
1.-Desinfectar las semillas con extran.
2.-Colocar los 100g de lenteja en un vaso de precipitados y agregar 500ml de agua destilada
3.- Tapar con papel aluminio e incubar a temperatura ambiente una noche (16h minimo)
4.- Escurrir el agua y almacenar (1ª peparación de auxinas)
5.- Colocar las lentejas en papel filtro y almacenar hasta que desarrollen aproximadamente
3 cm. De raíz.
6.- Cortar las raíces desechando el resto.
7.- Triturar las raíces e incubar en agua durante 1 día en un lugar oscuro.
8.- Escurrir el agua y mezclar con la 1ª preparación de auxinas.

Stock de reguladores de crecimiento

El stock se puede hacer a 1mg/ml . Las auxinas se pueden disolver en una cantidad de
etanol al 95%, KOH o NaOH 1M. Una vez disueltas se añade agua destilada lentamente
para evitar precipitación.

Ácido abcisico se puede disolver en NaOH 1N y las giberelinas en etanol al 95%

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HOJA FINAL DEL MANUAL

Este manual de prácticas de laboratorio fue recopilado y elaborado por Dra.

Patricia Pavón Orozco, para la Experiencia Educativa de Cultivo de Células y
Tejidos que se imparte a los alumnos de la Facultad de Ciencias Químicas de
la Universidad Veracruzana, Campus Coatzacoalcos.

Coatzacoalcos, Ver., Febrero 2016.

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