Estimulación de la Inmunidad Innata en Truchas Arco Iris

(Oncorhynchus mykiss) Infectadas con Aeromonas salmonicida
salmonicida

Ortega, C., Fernández, A.B., de Blas, I., Muzquiz, J.L., Crespo, L. y de La Rosa, A.

Patología Infecciosa y Epidemiología. Departamento de Patología Animal.

Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza.
c/ Miguel Servet 177. 50.013 Zaragoza (España)

Introducción

   El organismo de los seres vivos es capaz de responder ante cualquier agresor externo mediante la
puesta en marcha de una serie de mecanismos defensivos que se basan, en gran medida, en la
producción y/o actuación de células o productos celulares que se ocuparán de luchar frente al mismo y
destruirlo en caso de tratarse de un agente patógeno (Van Muiswinkel et al, 1985), mecanismos que
constituyen la respuesta inmune.

   Esos mecanismos defensivos pueden agruparse en dos grandes bloques, lo que se conoce como
inmunidad específica, centrada en la producción de anticuerpos, es por tanto una inmunidad
fundamentalmente de tipo humoral aunque también intervendrán algunos grupos celulares, y la
inmunidad inespecífica o innata, que se basa en la actividad de algunos grupos de células defensivas,
es básicamente inmunidad de tipo celular, si bien intervienen simultáneamente algunos mediadores
químicos producidos por las células, fundamentalmente citoquinas del tipo del interferón,
interleucinas o productos como la lisozima y la transferrina (Alexander, 1985), (Bernstein et al, 1998).

   Tal y como su nombre indica, la inmunidad específica es aquella que se produce exclusivamente
frente a un agente patógeno concreto, mientras que la inmunidad innata es la que se produce de forma
genérica ante cualquier agente patógeno (Ducha, 1995).

   En condiciones naturales ambos tipos de inmunidad actúan, más o menos simultáneamente en
presencia de un agente patógeno, sin embargo, estudios realizados en diferentes especies indican que
mientras que en mamíferos la inmunidad específica, es decir, la producción de anticuerpos, tiene
mayor peso, en peces parece ser la inmunidad innata la que tiene una especial preponderancia en la
puesta en marcha de mecanismos defensivos ante un agresor (Roitt et al, 1997), lo que no significa
que el pez sea incapaz de producir anticuerpos específicos frente a los patógenos.

   Por otro lado, se ha observado en diversas especies ícticas, tanto en animales de producción
intensiva como en animales de vida silvestre, que una buena parte de esos mecanismos pueden verse
afectados por el medio, ya que en determinadas situaciones y momentos de la vida del pez existe una
importante inmunosupresión, especialmente acusada en la inmunidad innata, donde es frecuente
detectar importantes descensos en el contenido de leucocitos tanto en tejidos como en sangre
circulante.
   La razón de la inmunosupresión ambiental radica en la existencia de situaciones de estrés, caso de la
época de freza en animales adultos o de los cambios de la calidad del agua en animales de producción
intensiva, a lo que se añade en todo momento la manipulación constante de los animales por parte del
hombre (desove, reclasificación, limpieza de estanques...) (De Kinkelin et al, 1991) (Ruglys, 1985).
   Por otro lado, la lucha frente a las infecciones, especialmente en producción intensiva, mediante la
utilización antibióticos ha llevado a una situación actual en la que existen problemas de resistencia de
las bacterias a los diferentes productos utilizados y permitidos por la legislación vigente, complicando
todavía más la aplicación de estrategias de lucha frente a las enfermedades (De Kinkelin et al, 1991),
por lo que las medidas más eficaces parecen centrarse, definitivamente, en la instauración de
protocolos de medicina preventiva.
   Estos problemas ligados al manejo han llevado a los investigadores a plantearse la necesidad de
trabajar en diversas líneas dentro del mundo de la inmunología de manera que se pueda lograr que los
peces se encuentren con una buena capacidad defensiva, es decir, inmunológicamente activos, ante
esas situaciones de estrés. Considerando además que la base inmunológica más activa en el caso de
los peces parece ser la inmunidad innata, los estudios actuales en acuicultura se centran en el uso de
potenciadores inespecíficos que traten de estimularla. Con tal fin se ha estudiado la eficacia de
compuestos como la vitamina C en la dieta (Thompson et al, 1993) o productos químicos o biológicos
como los b 1-3 glucanos administrados por diferentes vías (Nikl et al, 1993), (Verlhac et al, 1996), si
bien esto no significa que se haya dejado de lado el trabajo en la inmunidad específica,
fundamentalmente mediante el desarrollo de vacunas que estimulen la producción de anticuerpos
(Ellis, 1988).

   En esta misma línea de trabajo nos hemos planteado la realización de un estudio de la eficacia de
diversos estimulantes de la inmunidad innata, el primero de ellos un b 1-3 glucano utilizado ya con
relativa frecuencia en acuicultura, y el segundo un potenciador estrictamente biológico de la
inmunidad que hasta el momento ha sido aplicado con éxito en algunas especies de mamíferos pero no
en acuicultura. El trabajo se ha centrado en valorar el efecto de estos dos productos sobre parte de la
respuesta inmune innata: determinación de células blancas, medida de la actividad de la lisozima en
sangre y valoración de la capacidad de fagocitosis en leucocitos del riñón anterior, todo ello en
animales inoculados experimentalmente con Aeromonas salmonicida subs. salmonicida, así como
también en valorar las consecuencias de la enfermedad en función del inmunopotenciador
administrado.

Material y Métodos

   El trabajo se ha realizado sobre ejemplares de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) con un peso
de 50-60 gr, procedentes de la piscifactoría del Monasterio de Piedra (Zaragoza). Este centro de
piscicultura se controla periódicamente para confirmar la ausencia de enfermedades infecciosas y
parasitarias. A pesar de ello y previamente a la realización del estudio experimental, se llevaron a
cabo controles microbiológicos, virológicos y parasitológicos sobre parte de los animales, mediante el
uso de diferentes técnicas diagnósticas, para confirmar que se trataba de animales exentos de
cualquier agente infeccioso o parasitario que pudiera interferir en el resultado del estudio.
   Los animales se mantuvieron en acuarios de 200 litros con circuito cerrado de agua y sistemas de
refrigeración, lo que estabilizó la temperatura de toda la experiencia entorno a los 15ºC (15 ± 2ºC).
Antes de realizar la experiencia, los peces se mantuvieron en adaptación al nuevo hábitat durante 12
días, momento a partir del cual se crearon 4 grupos de 30 animales cada uno (el tamaño se decidió
mediante las fórmulas para el cálculo del tamaño de las muestras en estudios experimentales en los
que se desea realizar la comparación de grupos y mediante el uso del programa informático Win
Episcope (Ortega, 1996)), distribuyéndose los animales en los acuarios de forma aleatoria y
manteniendo una ratio tratados/testigos de 1/1. El experimento se diseño para un análisis de dos vías
(diferencias entre grupos en cualquier sentido) y utilizándose una estrategia de estudio de triple ciego
(Thrusfield, 1997).

   Una vez creados los cuatro grupos se procedió a aplicar los productos que debían actuar como
potenciadores de inmunidad, de manera que al grupo 1 (G1) se le administró el potenciador biológico
y posteriormente se inoculó con Aeromonas salmonicida. Al grupo 2 (G2) se le administró el b 1-3
glucano y se inoculó con la bacteria, mientras que al grupo 3 (G3), testigo para la actividad de los
potenciadores, se le administró suero fisiológico estéril (SFE) y se inoculó con la bacteria. El grupo 4
lo constituyeron los animales sin potenciador y sin infectar con Aeromonas salmonicida, era por tanto
el grupo testigo negativo de la infección.
   En el grupo 2 la aplicación del b 1-3 glucano se realizó adicionando el producto con el pienso
durante los 14 días previos a la inoculación de la bacteria (tal como indicó el fabricante). A los otros
dos grupos se les administró durante ese periodo de tiempo pienso sin potenciador a la misma dosis y
en los mismos momentos.
   En el grupo 1, la administración del potenciador biológico se realizó mediante inoculación
intramuscular de 0.5 ml de producto el día antes de la infección experimental con la bacteria. Ese
mismo día se inoculó a los grupos 2, 3 y 4 una dosis idéntica de SFE vía intramuscular con el fin de
mantener en todos los grupos idénticas condiciones de manejo.
   El día siguiente a la aplicación de los potenciadores, se infectaron los animales de los grupos 1, 2 y
3 con Aeromonas salmonicida salmonicida mediante inoculación intraperitoneal, durante dos días
sucesivos, de una dosis diaria de 0.5 ml de suspensión bacteriana con una concentración de 3 x 108
UFC/ml a cada pez. Para mantener las condiciones de manejo, el grupo 4 fue infectado del mismo
modo con SFE.

   Veinticuatro horas después de realizar la administración de la segunda dosis de bacteria comenzó el

muestreo, consistente en observar la morbilidad y mortalidad diaria y en el sacrificio, cada dos días,
de 4 animales por grupo, animales en los que se trató de aislar la bacteria en diferentes órganos:
branquias, riñón, bazo, hígado, músculo y sangre, estudiándose además la respuesta inmune
inespecífica en algunos órganos y en sangre:

   El potenciador biológico administrado al grupo 1 es un producto elaborado con virus de la viruela
ovina, atenuado en pases por cultivo celular e inactivado posteriormente con b -propiolactona,
mientras que el b 1-3 glucano administrado al grupo 2 es un polímero extraído de la pared celular de
levaduras.
   Los peces muestreados se sacrificaron mediante una sobredosis de anestésico (2-phenoxi-ethanol),
extrayéndose inmediatamente una muestra de sangre y realizándose posteriormente la necropsia de los
mismos.
   Los aislamientos del agente inoculado, Aeromonas salmonicida salmonicida, se realizaron en
medios de cultivo Triptic Soy Agar (TSA) a partir de los órganos anteriormente citados, incubándose
las placas a 22ºC durante 48 horas. (Austin & Austin, 1987).

   Paralelamente se tomaron fragmentos de riñón anterior que se mantuvieron en refrigeración, a partir

de los que posteriormente se realizó el estudio de la actividad fagocítica de los leucocitos según las
técnicas descritas por Sovenyi & Kusuda (1987). Para ello se realizó una suspensión de leucocitos de
riñón ajustada a 5 x 106 cel/ml que se incubó con una suspensión de eritrocitos de oveja, tras los
cuales se determino el porcentaje de células que habían ingerido eritrocitos.
   A partir de la muestra de sangre heparinizada, y tras depositar una gota sobre un medio de cultivo
TSA para aislamiento de la bacteria, se realizaron por un lado los recuentos de glóbulos rojos y
blancos así como la determinación de la fórmula leucocitaria según los protocolos descritos por
Campbell & Murru (1990), basados en la dilución de la sangre con una solución colorante para el
posterior recuento de eritrocitos y leucocitos en cámara de Neubauer mejorada, y en la realización de
un frotis sanguíneo que tras teñirlo con Panóptico rápido permitió la identificación de los tipos
leucocitarios mediante observación microscópica. Por otro lado, a partir del plasma se realizó la
determinación de la actividad de la lisozima mediante turbidimetría (Parry et al, 1965) (Grinde et al,
1988), consistente en el esclarecimiento óptico de una suspensión de Micrococcus lisodeikticus al
mezclarlo con 100 ml de plasma.
   En todos los casos, los recuentos para cada grupo y día postinfección se calcularon y expresaron
mediante la media aritmética y la desviación estándar para los cinco animales sacrificados cada día y
en cada grupo.

Resultados

   En ninguno de los grupos de peces estudiados pudo detectarse la presencia de manifestaciones
clínicas ni mortalidad que pudieran atribuirse a la infección por Aeromonas salmonicida salmonicida,
lo que posiblemente se haya debido a la corta duración del periodo de estudio, 11 días tras la
infección. Por este motivo, los resultados del trabajo analizados se centraron en conocer las
diferencias existentes en la respuesta inmune en los diferentes grupos creados.
   Los resultados observados en el estudio de la respuesta inmune han puesto de manifiesto que si bien
existe alguna diferencia entre los tres grupos de animales infectados experimentalmente con
Aeromonas salmonicida, y entre los diferentes inmunopotenciadores inespecíficos, esa diferencia es
más moderada de lo que cabría esperar en cuanto a la existencia de una respuesta inmune innata, al
menos en lo que respecta a los parámetros inmunológicos analizados.
   El recuento total de leucocitos ha presentado valores más elevados en el grupo tratado con b 1-3
glucano, especialmente durante los 5 primeros días postinfección, siendo en los demás grupos más
pequeñas las diferencias existentes (tabla 1).

   Tabla 1: Recuento de leucocitos totales en sangre (media aritmética de

los recuentos diarios)

Días
G1 G2 G3
postinfección
1 27625* 51125 25125
3 29750 39250 26250
5 25500 36500 34666
7 32000 36500 28125
9 32500 34750 26875
11 30500 37375 36375
   G1: Grupo con inmunopotenciador biológico
   G2: Grupo con glucano
   G3: grupo testigo para los potenciadores
   *: Expresado en células/mm3

   Una situación similar a la del recuento de leucocitos se aprecia en los linfocitos, si bien la mayor
proporción de los mismos en el caso del grupo con glucanos se limita a los primeros 7 días
postinfección siendo además la diferencia con respecto a los demás grupos experimentales mucho más
moderada que en el caso de los leucocitos totales (tabla 2). En el caso de los otros dos grupos
infectados experimentalmente no se observan diferencias remarcables.

   Tabla 2: Proporción de linfocitos en sangre (media aritmética de las

 proporciones diarias)

Días
G1 G2 G3
postinfección
1 81* 85 84.2
3 88.3 92.5 90.1
5 88.6 88.8 82
7 90 94.2 91.3
9 93.6 88.1 93.5
11 89 84.2 92.5
   G1: Grupo con inmunopotenciador biológico
   G2: Grupo con glucano
   G3: grupo testigo para los potenciadores
   *: Expresado en %

   Por el contrario, en el caso de los neutrófilos se observa que estos aumentan considerablemente en el
grupo con glucanos en torno al día 5 postinfección, descendiendo posteriormente y volviendo a
aumentar en la fase final del periodo de estudio, a partir de 9º día postinfección. En cambio, en el caso
del potenciador biológico la proporción de neutrófilos había aumentado considerablemente con
respecto a los otros dos grupos durante los primeros días del estudio, 3-4 primeros días postinfección,
descendiendo moderadamente en los días posteriores (tabla 3).

   Tabla 3: Proporción de neutrófilos en sangre (media aritmética de las

proporciones diarias)

Días
G1 G2 G3
postinfección
1 15.7* 14.8 15
3 11.5 5.5 8.2
5 11 19.9 17
7 9.7 5.1 7.7
9 5.9 11.5 5.6
11 9.1 13.2 6
   G1: Grupo con inmunopotenciador biológico
   G2: Grupo con glucano
   G3: grupo testigo para los potenciadores
   *: Expresado en %

   Para el caso de los macrófagos no se han observado diferencias entre los tres grupos que se
mantengan a lo largo una parte del periodo de tiempo estudiado, es decir, en un momento del periodo
de estudio las proporciones más elevadas de macrófagos se presentan en un grupo y en el periodo
siguiente es otro grupo diferente el que posee proporciones de macrófagos más elevadas (las
variaciones se producen de un día para otro entre los distintos grupos) (tabla 4), lo que parece sugerir
que el posible efecto de este tipo de potenciadores de la inmunidad es nulo o muy limitado en este
grupo de células defensivas, al menos durante los primeros 10 días postinfección.

Tabla 4: Proporción de macrófagos en sangre (media aritmética de las

 proporciones diarias)

Días
G1 G2 G3
postinfección
1 2* 0.1 0.7
3 0.1 2.5 1.6
5 0.4 1.2 1
7 0.3 0.6 0.9
9 0.5 0.6 1
11 1.9 2.5 1.3
G1: Grupo con inmunopotenciador biológico
G2: Grupo con glucano
G3: grupo testigo para los potenciadores
*: Expresado en %

   Los resultados de la valoración de la actividad de lisozima plasmática evidencian una actividad de

los inmunopotenciadores estudiados similar a la observada para los neutrófilos, es decir, el b 1-3
glucano provoca un incremento de la misma a partir del día 9 postinfección con respecto a los otros
dos grupos, incremento que se presenta muy marcado a partir de ese momento. Por el contrario, el
potenciador biológico provoca un aumento significativo de la actividad lisozima durante los primeros
5/7 días postinfección (tabla 5).

Tabla 5: Actividad de lisozima (media aritmética de los valores diarios)

Días
G1 G2 G3
postinfección
1 926.47* 799.95 641.65
3 851.65 718.30 754.95
5 1026.60 929.15 1025.50
7 874.40 787.45 735.70
9 1002.45 1024.25 830.80
11 799.97 1071.65 879.12
G1: Grupo con inmunopotenciador biológico
G2: Grupo con glucano
G3: grupo testigo para los potenciadores
*: Expresado en unidades de actividad lisozima

   Por último, la actividad fagocítica de los leucocitos de riñón anterior no se ha visto modificada,
dentro del periodo de estudio (tabla 6), lo que indica una ausencia de efecto de los potenciadores
inmunes inespecíficos utilizados en esta actividad que es dependiente en gran medida de los
macrófagos, células que no se habían visto modificadas por la parainmunización (tal y como se
indicaba en la tabla 4).

Tabla 6: Fagocitosis de leucocitos en riñón (media aritmética de las

proporciones diarias)

Días
 postinfección G1 G2 G3

1 60* 62 62
3 66 63 61.5
5 40 54 60.5
7 48.2 46.5 43
9 54.7 44.5 49.5
11 44.5 47 43.2
G1: Grupo con inmunopotenciador biológico
G2: Grupo con glucano
G3: grupo testigo para los potenciadores
*: Expresado en %

Discusión

   El estudio realizado ha puesto de manifiesto que los potenciadores de inmunidad inespecífica
utilizados han producido un incremento leve en la respuesta inmune inespecífica de los animales, ese
incremento ha resultado particularmente acusado en el caso del recuento de leucocitos totales y más
concretamente entre los linfocitos y neutrófilos, siendo prácticamente nulo en el caso de los
macrófagos.
   Estos resultados son similares a los obtenidos anteriormente en trabajos realizados con diversos
inmunopotenciadores (especialmente glucanos y complejos vitamínicos) administrados en la dieta
(Siwicki et al, 1994). A diferencia de estos resultados, algunos autores han indicado que los
inmunopotenciadores inespecíficos por si solos poseen una débil o nula eficacia en su capacidad para
incrementar las defensas del animal frente a una infección (Nikl et al, 1993), al señalar que es
necesaria la utilización de productos estimulantes de la inmunidad "específica" para lograr un estado
defensivo óptimo por parte del pez.
   De estos trabajos cabe deducir que posiblemente la eficacia de los potenciadores de inmunidad
inespecífica radique en su aplicación asociada a vacunas como potenciadores de inmunidad específica
y que cuya acción conjunta sea la que cree un estado defensivo adecuado en el animal, tal y como
observaron Nikl et al (1991) en trabajos experimentales basados en la aplicación simultanea de
potenciadores inespecíficos de inmunidad y bacterinas como potenciadores específicos.

   El hecho de que en nuestro trabajo se haya producido un mayor incremento en el recuento de
leucocitos tras la administración de los glucanos y el que ese aumento no se refleje en una mayor
actividad fagocitaria, podría sugerir que la acción de estos potenciadores se centre en incrementar la
producción de células productoras de sustancias mediadoras de la inmunidad inespecífica como son
las interleucinas o el interferón. Sin embargo, debemos indicar que estudios realizados por otros
autores con potenciadores de inmunidad inespecífica, si han evidenciado un incremento de la
actividad fagocitaria (Kitao & Yoshida, 1986), (Kodama et al, 1993).
   La posible acción de los potenciadores de inmunidad inespecífica sobre células productoras de
mediadores químicos, se vería respalda en nuestro caso por el hecho de haber observado que con los
dos potenciadores utilizados en el estudio se ha inducido un incremento de la actividad lisozima, si
bien este aumento se ha puesto de manifiesto en diferentes momentos para cada uno de los productos
utilizados.
   Esta idea anterior se vería confirmada también con el hecho de que en el conjunto de las células
blancas los incrementos más importantes se han presentado en la proporción de linfocitos, células que
se encuentran directamente relacionadas con la producción de las citoquinas, mientras que no se han
observado variaciones significativas en las proporciones de macrófagos/monocitos, células de acción
directa sobre agentes patógenos e implicadas en el proceso de fagocitosis (Roitt et al, 1997).

   No obstante, en los procesos de fagocitosis también intervienen los neutrófilos, células que en
nuestro estudio si han incrementado su proporción en algunos momentos. Sin embargo, la
participación de los neutrófilos en los procesos de fagocitosis parece ser más reducida que la de los
macrófagos, lo que podría colaborar en la explicación de que no se haya detectado un aumento
significativo en la actividad fagocitaria de los leucocitos.
   De estos resultados se deduce que la eficacia de los potenciadores de inmunidad inespecífica en la
puesta en marcha de una respuesta defensiva es bastante limitada por si solos o bien su actividad
podría afectar a la producción de algunos mediadores químicos de la inmunidad, y que en nuestro
trabajo no se han determinado, idea que al parecer podría deducirse de los trabajos realizados hasta el
momento por otros autores tanto en mamíferos como en peces (Mayr, 1986), (Nikl et al, 1991), por lo
que se hace necesario continuar con los estudios de su actividad mediante la valoración de otros
parámetros como son fundamentalmente la producción de interferón por los linfocitos y las células
infectadas o las interleucinas.

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Artículo publicado en la Revista AquaTIC nº 6, febrero 1999