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‫اﻟﺠﻤﻬﻮرﻳﺔ اﻟﺠﺰاﺋﺮﻳﺔ اﻟﺪﻳﻤﻘﺮاﻃﻴﺔ اﻟﺸﻌﺒﻴﺔ‬

République Algérienne Démocratique et Populaire


‫وزارة اﻟﺘﻌﻠﻴﻢ اﻟﻌﺎﻟﻲ و اﻟﺒﺤﺚ اﻟﻌﻠﻤﻲ‬
Ministère de l’Enseignement et de la Recherche Scientifique

Faculté des Sciences


Département de Biotechnologie

Mémoire de MAGISTER
en Biotechnologie
Option : Ecosystèmes microbiens complexes

Présenté par
Mlle Halima DJELIL

Intitulé

Résistance au stress salin et osmoprotection chez


les bactéries lactiques : influence du sel sur les
aptitudes technologiques des souches

Devant le Jury :

Président : Pr. N-E. KARAM Université d’Oran


Examinateurs : Dr. F. DALACHE Université de
Mostaganem
Dr. F. BOUKORTT Université d’Oran

Rapporteur : Pr. H. ZADI-KARAM Université d’Oran


Co-Rapporteur : C. C. F. BOURAS- Université d’Oran
BOUBLENZA

Soutenu le : / / 2010
REMERCIEMENTS
Merci au bon dieu qui m’a prêté force, courage et patience lors de la réalisation de ce travail.

Je suis particulièrement reconnaissante a monsieur le professeur KARAM.N-E pour m’avoir


accueillie au sein de son laboratoire et de m’avoir fait l’honneur de présider le jury de ma
soutenance.

Je remercie mademoiselle DALACHE.F maitre de conférences à l’université de Mostaganem


d’avoir accepter d’examiner ce mémoire.

Je remercie aussi Mme BOUKORTT.F maitre de conférences à l’université d’Oran d’avoir


accepter d’examiner ce mémoire.

Un témoignage d’estime va directement à madame la professeur ZADI-KARAM.H d’avoir


accepté la charge de directrice de mon mémoire ainsi que pour sa présence son
professionnalisme et ses conseils avisés qui m’ont permis de mener ce travail dans des
conditions des plus propices.

Je tiens a remercier plus particulièrement madame BOURAS-BOUBLENZA.F maitre


assistante de m’avoir permis de mener a bien ce travail grâce a son soutient a chaque instant et
sa gentillesse qui ont été un appui et un réconfort précieux pour moi ses conseils ses
précieuses directives ainsi que sa disponibilité.

Je ne saurai oublier BENAISSA.M, DJELLOULI.M, GHALOUNI.A, HARMOUCHE.A et


MERZOUG.M pour leur précieuse aide dans la réalisation de ce travail, leur bonne humeur, et
leur soutien amical inébranlable.

J’adresse mes sincères remerciements a l’équipe du LBMB je citerai Madame ROUDJ.S qui
m’a beaucoup apporté par sa gentillesse ses conseils et sa disponibilité « merci maman ». A
monsieur HASSAINE.O pour ses précieux conseils et orientations qu’ainsi Un grand merci
aux techniciens pour leur gentillesse et leur dévouement.

Je voudrais également remercier madame et monsieur KAHIA TANI ainsi que le personnel
du laboratoire KAHIA TANI pour leur gentillesse leur sympathie et leur soutien moral.

Il m’est agréable d’adresser ma reconnaissance la plus profonde à monsieur TEBBOUNE.O


pour sa gentillesse sa disponibilité aussi pour m’avoir poussé a allé de l’avant dans les
moments les plus difficiles.

J’adresse aussi un vif remerciement a tout ceux qui ont été a mes cotés durant ces années
d’étude, mes amis(es) et mes proches.

Et a tous ceux que j’oublie aujourd’hui…

Merci
DÉDICACES

Je dédie ce modeste mémoire en signe de respect et de reconnaissance


aux êtres les plus chers à mon cœur :

A mes très chers parents pour leur affection, prières je les remercie d’avoir
réussi à faire de moi l’être que je suis, d’avoir conforté mon âme et mon
esprit, veillé sur mon confort nuits et jours je prie dieu de les garder et de les
protéger pour qu’ils soient témoin de mes futures réussites. Papa, Maman

MERCI.

A mes grands parents.

A mes frères AMINE et RACHID ainsi que ma petite sœur FAIZA.

A mes tantes et mes oncles.

A mes cousins et cousines.

A mes amis(es).
SOMMAIRE
Liste des tableaux i
Liste des figures ii
Liste des abréviations iii

1. INTRODUCTION 1

1.1 Classification et phylogénie 3


1.2 Lactococcus 6
1.2.1 Lactococcus lactis 6
1.2.2 Métabolisme azoté chez Lactococcus lactis 7
1.2.2.1 Protéolyse et croissance sur lait 8
1.2.2.2 Catabolisme et transport des peptides 9
1.2.2.3 Catabolisme et transport des acides aminés 9
1.3 L’utilisation du NaCl dans l’industrie agro-alimentaire 10
1.3.1 NaCl et conserves de viandes 10
1.3.2 La confiserie ou conserverie de légumes saumurés 11
1.3.3 Industrie laitière : fabrication de beurre et de fromages 11
1.4 Stress osmotique 12
1.4.1 Définition de l’osmose 12
1.4.2 Effets du stress sur les bactéries rencontrées dans l’aliment 13
1.4.3 L’effet du stress osmotique sur la cellule bactérienne 14
a) Environnement hypo-osmotique 14
b) Environnement hyper-osmotique 14
1.5 Les solutés compatibles : un moyen de réponse à un stress hyper-osmotique 18
Glycine bétaïne 19
La proline 20
Le glutamate 20
Les polyols 21
Les sucres 21
Les sulfoniums tertiaires 21
1.6 Les réponses aux stress 21
1.7 Les régulateurs globaux de la réponse au stress 23
Les systèmes à deux composants 23
Facteur sigma 25
1.8 Lactococcus lactis et le stress 25
1.9 Mécanismes de lutte contre le stress 27
1.9.1 Protection et réparation des constituants macromoléculaires 27
1.9.1.1 Les chaperonnes 27
1.9.1.2 Les protéases 30
1.9.1.3 Réparation de l’ADN 30

2. MATERIEL ET METHODES

2.1 Matériel biologique 31


2.2 Conditions de culture 32
2.3 Milieux de culture. 32
2.4 Vérification de la pureté des souches 33
2.5 Conservation des souches 33
2.6 Croissance en présence de différentes concentrations de NaCl 33
2.8 Croissance des souches en présence de CMI de NaCl et de glycine bétaïne ou de proline 33
2.9 Cinétique de croissance 33
2.10 Test de survie au stress salin 34
Préparation des cellules en phase exponentielle 34
Choc létal 34
Choc adaptatif 34
2.11 Activité protéolytique des souches 35
2.12 Cinétique d’acidification et production d’acide lactique 35
2.13 Techniques relatives à l’étude des protéines 36
2.13.1 Analyse des protéines totales par électrophorèse SDS-PAGE 36
2.13.1.1 Préparation des échantillons bactériens 36
2.13.1.2 Lyse cellulaire 36
Lyse par fragilisation thermique 36
Lyse par des microbilles en verres 37
Lyse dans un tampon échantillon 37
2.13.1.3 Dosage des protéines 37
2.13.2 Electrophorèse des protéines 38
2.13.2.1 Protocole de l’électrophorèse des protéines 38
Préparation du gel polyacrylamide 38
Dépôt des échantillons 39
Migration 39
Révélation 39
2. 14 Analyse du contenu cellulaire des souches par chromatographie sur papier 39
2.14.1 Principe 39
2.14.2 Systèmes de solvants de migration 40
2.14.3 Dépôt des échantillons 40
2.14.4 Conduite de la chromatographie 40

3. RESULTATS ET DISCUSSIONS

3.1 Caractérisation des souches et confirmation de leur appartenance au groupe lactique 42


Observation macroscopique 42
Examen microscopique 42
Test de la catalase 43
3.2 Croissance des bactéries en présence de 1.1M NaCl 43
3.3 Croissance des souches à différentes concentrations en NaCl 45
3.4 Croissance des souches en présence de la CMI de NaCl et d’osmoprotecteurs 47
3.5 Cinétique de croissance 50
3.6 Test de survie au stress salin 53
3.7 Activité protéolytique des souches cultivées en présence de sel 54
3.8 Pouvoir acidifiant des souches en présence et en absence de NaCl 57
3.9 Analyse des protéines totales 58
3.10 Analyse du contenu cellulaire par chromatographie de partage 62

CONCLUSION 65

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 67
LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Représentation du flux d’eau durant la croissance 13


Figure 2. Effet de l’osmolarité sur la structure d’une protéine d’une halobactérie et sa stabilisation
après l’ajout des solutés compatibles 19
Figure 3. Représentation schématique des différents paramètres physiologiques impliqués dans
l’osmosensing chez une bactérie Gram positif 24
Figure 4. Modèle d’action du système GroESL dans le repliement protéique 28
Figure 5. Modèle d’action du système DnaK dans le repliement protéique 29
Figure 6. Modèle d’action du complexe Clp protéase 30
Figure 7. Aspect macroscopique de la souche CHM7 et V13-1 42
Figure 8. Caractéristiques des souches LCL et CHM6 43
Figure 9. Croissance bactérienne en présence de 1.1M de NaCl 44
Figure 10. Répartition des souches selon leur comportement en présence de 1.1M de NaCl 44
Figure 11. Concentration Minimale Inhibitrice de NaCl des souches étudiées 46
Figure 12. Croissance de V13-1 en présence de différentes concentrations en NaCl 46
Figure 13. Croissance de la CHT2 en présence de différentes concentrations en NaCl 46
Figure 14. Evaluation de la croissance bactérienne en fonction de la concentration en sel 47
Figure 15. Croissance en présence de sel et d’osmoprotecteurs 48
Figure 16. Croissance des souches en présence de NaCl et d’osmoprotecteurs 48
Figure 17. Courbes de croissance des souches en présence de sel et d’osmoprotecteurs 50
Figure 18. Test de survie des souches étudiées 54
Figure 19. Activité protéolytique des souches 55
Figure 20. Protéolyse en absence de sel 56
Figure 21. Protéolyse en présence de 0.7M de NaCl 56
Figure 22 : Evolution du pH dans différents conditions de culture de la CHM6 57
Figure 23. Quantité d’acide lactique produite par CHM6 en fonction de la concentration de NaCl,
avec ou sans osmoprotection 58
Figure 24. Profils protéiques de lysats obtenus avec différents traitements de lyse de la souche
CHM6 cultivée en absence de sel 60
Figure 25. Protéines totales de la souche CHM6 cultivées dans différentes conditions 61
Figure 26. Chromatogramme des contenus cellulaires de la souche CHM6 cultivé en absence et en
présence de sel et d’osmoprotecteurs 63
LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Fonction des systèmes à deux composantes chez Lactococcus lactis 24


Tableau 2 : Origine des souches étudiées 31
Tableau 3 : Gamme étalon pour le dosage des protéines 37
Tableau 4 : Croissance des bactéries en présence de NaCl 45
Tableau 5 : Croissance en fonction de la concentration de glycine bétaïne 49
Tableau 6: Croissance en fonction de la concentration de proline 49
Tableau 7 : Temps de génération et taux de croissance des bactéries 52
Tableau 8 : Concentrations en protéine des différents échantillons de la CHM6 59
Tableau 9: Rapport frontaux des trois molécules testées 63
 

 
Introduction
 

Le secteur des industries agroalimentaires utilise un certain nombre d’auxiliaires


technologiques, parmi lesquels les bactéries lactiques, pour élaborer des aliments fermentés.
Les bactéries lactiques constituent un groupe de bactéries capables de produire par un
métabolisme fermentaire de l’acide lactique. L’acidification et les procédés enzymatiques
accompagnant leur développement influencent les qualités organoleptiques et la préservation
de nombreux aliments. Les différentes applications des bactéries lactiques en agroalimentaires
reposent sur l’utilisation de six genres-clefs: Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus, Oenococcus et Streptococcus.

Les levains lactiques les plus utilisés en industrie laitière sont les lactocoques ; leur
rôle technologique principal réside dans l’acidification du milieu produisant de l’acide
lactique, ils peuvent également produire de petites quantités de composés secondaires qui
contribuent à la formation de la flaveur et au goût du fromage, leur présence a aussi un effet
sur la texture finale grâce à leur activité protéolytique et acidifiante (Desmazeaud, 1996).

Les bactéries lactiques occupent des niches écologiques extrêmement variées et la


croissance des micro-organismes est influencée par les conditions physico-chimiques de leur
environnement. En effet, chaque espèce a ses propres conditions optimales de développement
suivant la température, le pH, la pression osmotique ou encore l’exposition lumineuse. Reste
que ces dernières sont constamment soumises à des fluctuations extérieures (variation
quantitative et qualitative des paramètres physico-chimiques environnants) auxquelles les
bactéries lactiques doivent répondre efficacement et rapidement afin de pouvoir survivre et se
développer (Romeo et al., 2001).

C’est dans ce contexte que notre laboratoire s’intéresse à l’étude des mécanismes de
résistance et de réponse au stress salin chez les lactocoques en particulier (Lactococcus
lactis) ; ce genre de stress est exercé lors de la salaison et de l’affinage. Un des enjeux de la
recherche actuelle pour les industries agroalimentaires consiste à mieux comprendre et
favoriser la capacité de réponse et d’adaptation des bactéries lactiques à ces variations afin de
conditionner la survie et la vitalité ultérieure des souches.

Le laboratoire de Biologie des Microorganismes et de Biotechnologie de l’université


d’Oran a constitué une collection de souches de bactéries lactiques isolées à partir de


 
Introduction
 
différents échantillons de lait, produits dérivés, d’huile d’olive, et plantes désertiques. Ce
souchier est composé de plus de 200 souches, essentiellement de Lactococcus et
Lactobacillus.

Ce travail s’insère dans l’étude de la résistance au sel et l’osmoprotection par la


proline et la glycine bétaïne chez les coques lactiques du souchier du LBMB, en comparaison
avec Lactococcus lactis LCL, souche témoin sensible au sel.

Après confirmation de la pureté des souches, nous avons étudié leur croissance à
différentes concentrations de NaCl afin de déterminer la concentration minimale inhibitrice ou
CMI ; la détermination de la concentration optimale de proline et de glycine bétaïne
permettant de lever l’inhibition de croissance exercée par le sel à la CMI est réalisée suite à
une culture sur milieu M17 additionné des deux substances osmoprotectrices à différentes
concentrations.

Dans un seconde étape, nous avons réalisé une étude cinétique de croissance en
absence et en présence de différentes concentrations en NaCl ainsi qu’en présence de proline
ou de glycine bétaïne. Nous avons aussi testé l’activité acidifiante et protéolytique des
souches en présence et en absence de sel ainsi que la corrélation entre ces deux caractères
technologiques.

Puis nous avons essayé une approche nouvelle qui porte sur les modalités
d’application du stress effet intensité/durée.
Ensuite, l’étude est complétée par une électrophorèse SDS-PAGE des protéines totales et
d’une chromatographie de partage sur papier Whatman du contenu cellulaire en absence et en
présence de stress hyper-osmotique.

La présentation des résultats de ce travail sera précédée d’une synthèse


bibliographique sur les microorganismes et stress en agroalimentaire, ainsi que la réponse au
stress osmotique chez les bactéries lactiques.


 
1. Introduction

L’intérêt des bactéries lactiques dans l’industrie agroalimentaire réside principalement


dans leur capacité à transformer certains sucres en lactate et ainsi à acidifier le milieu
environnant. Il s’agit d’une caractéristique utilisée dans de nombreux procédés de
transformation dont la fabrication fromagère (Rius et al., 2008).

1.1 Classification et phylogénie

En 1919 Orla-Jensen a défini les bactéries lactiques comme étant un groupe de


bactéries Gram positif, non mobiles, asporogènes, fermentant les hydrates de carbone et
certains alcools en lactate. Cependant, plus récemment, l’apport de nouvelles approches de
taxonomie bactérienne (physiologie, génétique), a permis d’affiner cette classification
(Schleifer, 1987; Vandamme et al., 1996), ce qui a conduit à regrouper les bactéries
lactiques en 11 genres (Stiles et Holzapfel, 1997).

En 2008 Poot les a classées en 14 genres: Aerococcus, Alloiococcus, Atopobium,


Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus,
Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weisella, dont les plus étudiés
restent Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Oenococcus et Enterococcus
comme souligné auparavant par Stiles et Holzapfel (1997).

Phylogénétiquement, les bactéries lactiques appartiennent à la branche clostridienne


des bactéries à Gram positif. Elles sont anaérobies mais parfois aérotolérantes, ce sont des
coques, coccobacilles ou bâtonnets qui possèdent moins de 55% de bases GC dans leur
génome. Ainsi, ces caractéristiques les éloignent des bifidobactéries longtemps considérées
comme appartenant à ce groupe, elles sont dépourvues d’activité de cytochrome.

Toutes les bactéries lactiques possèdent un métabolisme fermentaire leur permettant


de produire de l’acide lactique en utilisant des sucres fermentescibles, elles utilisent
principalement l’une des deux voies majeures du métabolisme des sucres Il s’agit des voies
homofermentaire (voie EMP) et hétérofermentaire (voie des pentoses-phosphate) (Thompson
et Gentry-Weeks, 1994).

 
1. Introduction

Ainsi, les bactéries lactiques sont divisées en deux groupes principaux d’espèces
homo- ou hétérofermentaires selon la nature et la concentration des produits terminaux issus
de la fermentation du glucose.

Le principal atout de ces bactéries réside donc dans leur capacité à acidifier les
produits alimentaires. L’acide lactique mais aussi d’autres acides organiques (acide acétique,
acide formique.) sont les produits du métabolisme fermentaire et jouent un rôle majeur dans la
conservation des aliments puisqu’ils inhibent fortement la croissance des bactéries pathogènes
à bas pH (Stiles, 1996). L’acide lactique a également un rôle direct dans l’industrie laitière
puisqu’il permet la formation du caillé.

Les bactéries lactiques participent également à la texture (production


d’exopolysaccharides) et à la saveur des produits laitiers. Les arômes sont multiples, parfois
indésirables (amines biogènes) et peuvent provenir d’origines diverses, soit du catabolisme
des hydrates de carbone présents dans le lait (lactose, citrate, ...), soit du métabolisme des
acides aminés ou encore des matières grasses.

Les bactéries lactiques sont dépourvues de catalase, enzyme catalysant la


décomposition du peroxyde d’hydrogène (H2O2) en eau et en oxygène. En conséquence,
l’H2O2 produit s’accumule dans l’environnement et peut inhiber certains microorganismes
présents (Condon, 1987, Caplice et Fitzgerald, 1999). Quelques souches possèdent une
pseudocatalase.

Les bactéries lactiques hétérofermentaires synthétisent du dioxyde de carbone (CO2)


comme métabolite secondaire. Son accumulation dans le milieu extérieur crée une
anaérobiose qui peut être toxique pour les microorganismes aérobies présents dans l’aliment.
Toutefois, le dioxyde de carbone peut aussi, à faible concentration, stimuler la croissance de
certaines bactéries (Lindgren et Dobrogosz, 1990).

Le diacétyle est un produit du métabolisme du citrate qui est responsable de l’arôme


«beurre» des produits laitiers. Les bactéries à Gram négatif, les levures et les moisissures sont
plus sensibles au diacétyle que les bactéries à Gram positif. Le diacétyle inhibe la croissance
bactérienne en interférant probablement avec les mécanismes gouvernant l’utilisation de

 
1. Introduction

l’arginine (Motlagh et al., 1991). Toutefois, le diacétyle est rarement présent dans l’aliment
en quantité suffisante pour y exercer une activité antimicrobienne importante (Caplice et
Fitzgerald, 1999).

L’utilisation des ferments lactiques capables de produire des substances à activité


antimicrobienne tel que les bactériocines pourraient aider a améliorer la qualité et la sécurité
des aliments fermentés. La seule bactériocine dont l’utilisation est actuellement autorisée en
tant qu’additif alimentaire est la Nisine (E234) (Baliarda, 2003).

Certaines bactéries lactiques appartenant aux genres Lactobacillus et Pediococcus sont


capables de créer des molécules à activité antifongique : des acides organiques (acide
propionique, acide phényle-lactique, acide 4-hydroxyphényl-lactique, en plus de l’acide
lactique (Lavermicocca et al., 2000 ; Magnusson et al., 2003).

Les bactéries lactiques sont également impliquées dans de nouveaux types de produits
dits «probiotiques». Il s’agit de micro-organismes vivants qui, une fois ingérés, vont conférer
un effet physiologique bénéfique à leur hôte animal grâce à leurs propriétés microbiennes
(Fuller, 1992). Les genres Lactobacillus, Bifidobacterium et Enterococcus abritent des
espèces considérées comme probiotiques (Fuller, 1991; Gordin et Gorbach, 1992). D’autres
bactéries, qui ne colonisent pas naturellement le tractus digestif des mammifères, mais sont
utilisées comme starters dans l’industrie laitière sont également considérées comme des
probiotiques, Lactobacillus bulgaricus et Streptococus thermophilus.

Leur classification dans les probiotiques ainsi que parmi les microorganismes GRAS,
fait de ces bactéries des acteurs potentiellement importants dans les domaines de la médecine
et de la santé : amélioration de la digestion du lactose, stimulation du système immunitaire,
vecteurs de molécules à effets thérapeutiques.

Les bactéries lactiques impliquées dans l’industrie alimentaire appartiennent à


différents genres: Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,
Oenococcus, Pediococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella (Vandamme et al.,
1996).

 
1. Introduction

1.2 Lactococcus

Les bactéries du genre Lactococcus sont des bactéries en forme de coques, regroupées
ou non en chaînettes de longueurs variables. Elles présentent un métabolisme homolactique,
sont mésophiles puisque leur température optimale de croissance est proche de 30°C, elles
n’ont aucune activité α-hémolytique.

Ce sont les études de Schleifer et al. (1985) qui ont justifié la création de ce nouveau
genre bactérien regroupant la quasi-totalité des streptocoques du groupe N de la classification
de Lancefield.

Les tests à l’arabinose, sorbitol, pyruvate et raffinose peuvent faciliter la distinction


entre les lactocoques et les entérocoques car leurs réactions sont opposées (Facklam et
Elliott, 1995) Le genre Lactococcus inclue différentes espèces : garviae, lactis, piscium,
plantarum et raffinolactis. L’espèce lactis regroupe elle-même trois sous-espèces, cremoris,
hordniae et lactis qui elle-même comprend le biovar diacetylactis, capable de surproduire le
diacétyle.

1.2.1 Lactococcus lactis

Lactococcus lactis est l’une des bactéries lactiques les plus étudiées. Son importance
cruciale dans les procédés de fermentations alimentaires, ainsi que la disponibilité de ses
séquences génomique et plasmidiques font de ce micro-organisme un modèle pour l’étude du
métabolisme des bactéries lactiques ainsi que de leur comportement face à différents stress.
Était autrefois apparenté aux streptocoques (Schleifer et al., 1985). Il est parmi les micro-
organismes les plus importants pour l’industrie laitière, faisant partie des levains utilisés dans
la plupart des fabrications fromagères.

Lactococcus lactis est une bactérie hétérotrophe à Gram positif, anaérobie facultative,
catalase négative, non sporulante, non mobile, formant des cellules sphériques ou ovoïdes,
isolées ou en courtes chaînettes de longueur variable mesurant 0,5 par 1,5 µ, mésophile
possédant une température optimale de croissance d’environ 30°C, et neutrophile puisque sa

 
1. Introduction

gamme de pH optimale varie de 6,3 à 6,9 (Hutkins et Nannen, 1993). Cette espèce est
homofermentaire.

Les différentes sous-espèces de Lactococcus lactis peuvent être différenciées, entre


autres, par leur résistance aux stress. Ainsi, la sous-espèce lactis est plus robuste que la sous-
espèce cremoris puisqu’elle est capable de croître à 40°C, ou en présence de 4 % de NaCl. De
plus, la sous-espèce lactis est capable de produire de l’ammoniac à partir d’arginine grâce à la
voie de l’arginine déiminase (ADI) qui est très rare chez cremoris. Les bactéries du genre
lactis sont les bactéries lactiques les plus importantes d’un point de vue commercial.

Les habitats les plus importants des lactocoques demeurent le lait, les laits fermentés
ainsi que les fromages où ils constituent la flore dominante. Cependant, on peut également les
isoler des plantes (Sandine et al., 1972) ainsi que de la peau de certains animaux, et il semble
que la contamination qui a lieu au cours de la traite aie pour origine principale le fourrage. Le
milieu d’isolement de Lc. cremoris semble être limité qu’aux produits laitiers (Mofredj et al.,
2007).

Cependant, Lc. lactis est un micro-organisme régulièrement soumis à des conditions


de croissance non favorables, tant dans son environnement naturel que lors des procédés
industriels.

1.2.2 Métabolisme azoté chez Lactococcus lactis :

Les besoins nutritionnels varient beaucoup d’un groupe bactérien à un autre. Les
bactéries lactiques sont hétérotrophes et nécessitent donc pour leur croissance l’apport de
certaines substances organiques exogènes. Elles se caractérisent par des besoins nutritionnels
particulièrement complexes car en plus d’un sucre fermentescible, elles nécessitent la
présence de plusieurs acides aminés essentiels qu’elles ne peuvent synthétiser à partir d’une
source azotée plus simple.

Les lactocoques ont généralement besoin d’un apport d’acide glutamique, d’histidine,
d’isoleucine, de leucine, de méthionine et de valine pour se développer, et plus rarement

 
1. Introduction

d’arginine, de thréonine et de tryptophane (Monnet et Gripon, 1994, Cocaign-Bousquet et


al. 1995).

Dans le lait, les concentrations de certains acides aminés essentiels comme


l’isoleucine, la leucine et la méthionine sont très faibles (moins de 1mg.l-1) ce qui en fait des
acides aminés potentiellement limitants pour la croissance (Mills et Thomas, 1981; Juillard
et al., 1995).

1.2.2.1 Protéolyse et croissance sur lait

Dans le lait, la croissance des lactocoques est fortement dépendante de l’hydrolyse des
caséines qui constituent la principale source d’azote (Mills et Thomas, 1981; Juillard et al.,
1995).
Lactococcus lactis produit une sérine-protéase (Cell Envelope Proteinase) localisée au
niveau de la paroi cellulaire, pivot de la protéolyse des caséines (Smid et al., 1991). Il s’agit
d’une enzyme clé essentielle pour une croissance rapide des souches de lactocoques dans le
lait puisqu’elle scinde les caséines en peptides. Bruinenberg et al. (1992) ont observé que la
synthèse des protéases est régulée par la composition du milieu ; les niveaux les plus élevés
sont obtenus en lait.

Deux types de protéases, -PI et -PIII sont distinguables par leur spécificité
d’hydrolyse, puisque les protéases de type-PI clivent préférentiellement la caséine β, la
caséine κ avec moins d’efficacité et presque pas la caséine αS1, alors que la protéase de type-
PIII clive les trois types de caséines avec la même efficacité (Visser et al., 1986 ; Reid et al.,
1991a et b; Reid et al., 1994). Ainsi le type de protéase de paroi exprimée va fortement
influencer la croissance de Lc. lactis (Exterkate et de Veer, 1987; Flambard et al., 1997;
Helinck et al., 1997; Flambard et al., 1998).

Chez Lactococcus lactis la croissance en lait est diauxique, elle est scindée en deux
phases exponentielles successives séparées par une phase au cours de laquelle la synthèse des
protéases de paroi est réalisée (Juillard et al., 1995; Letort et al., 2002). Au cours de la
première phase les bactéries consomment les acides aminés et peptides libres du milieu, tandis
qu’au cours de la seconde elles utilisent les caséines comme source d’acides aminés.

 
1. Introduction

Le taux de croissance est dépendant de la quantité de protéase synthétisée ainsi que de la


vitesse d’hydrolyse des caséines par PrtP (Bruinenberg et al., 1992; Helinck et al., 1997 ;
Letort et al., 2002).

1.2.2.2 Catabolisme et transport des peptides :

L’utilisation de peptides, initialement présents dans le lait ou dérivés de l’hydrolyse


des caséines, est indispensable à la croissance des lactocoques dans le lait. Elle est
conditionnée en premier lieu par leur transport à travers la membrane via différents systèmes
de transport, et également par leur hydrolyse en acides aminés libres dont certains sont
indispensables à la croissance.

Le système de transport des oligopeptides est particulièrement important pour la


croissance en lait, car l’incapacité à transporter ces peptides entraîne une lente coagulation du
lait, même en présence de la protéase Prt (Tynkkynen et al., 1993). Trois systèmes
fonctionnels de transport des peptides ont été décrits pour la souche L. lactis ssp. cremoris
MG1363.

Le transport des di- et tri-peptides, indispensables à la croissance en présence de


caséines, est réalisé par le système DtpT couplé à la force proton motrice ou PMF (Smid et
al., 1989 a et b; Kunji et al., 1993). Les oligopeptides de 4 à 35 résidus sont transportés par
un système de type ABC, Opp, couplé à l’hydrolyse de l’ATP. Les gènes oppDFBCA sont
organisés en opéron avec le gène pepO (Tynkkynen et al., 1993) et codent pour les cinq
composants du transporteur.

1.2.2.3 Catabolisme et transport des acides aminés :

Chez les lactocoques le transport des acides aminés est considérablement augmenté en
présence de glucose ou de lactose et stoppé par les inhibiteurs de la glycolyse ou les enzymes
hydrolysant l’ATP (Monnet et Gripon, 1994). Divers mécanismes de transport sont
impliqués selon les acides aminés, soit couplé à la force protomotrice, soit à l’ATP ou à
d’autres molécules possédant des liaisons phosphate riches en énergie, soit des systèmes
antiports impliquant les gradients de concentration des acides transportés.

 
1. Introduction

La proline est un acide aminé essentiel pour certaines souches de lactocoques.


Cependant ni pour ces souches ni pour celles qui sont autotrophes pour cet acide aminé, il n’a
pu être détecté de système de transport spécifique de la proline (Smid et Konings, 1990).
La proline est également un soluté impliqué dans la résistance contre le stress osmotique et
des transporteurs spécifiques osmorégulés ont été mis en évidence chez L. lactis (Molenaar et
al., 1993).

1.3 L’utilisation de NaCl dans l’industrie agro-alimentaire :

Le sel destiné à la consommation humaine a un double rôle de nutrition et de


conservation des aliments. La teneur en NaCl des aliments est très variable, allant de quelques
pour cent pour les plats préparés, le pain, les fromages, à plus de 40% dans le cas de
préparations très concentrées comme les bouillons en sachets. Par ailleurs, NaCl agit comme
un agent dépresseur de l’activité de l’eau dans les aliments, assurant ainsi leur stabilité
microbiologique. En effet, la disponibilité de l'eau présente dans l'atmosphère ou dans une
substance favorise la croissance bactérienne. Or l'activité de l'eau (Aw) est inversement
proportionnelle à la pression osmotique d'un composé. Ainsi, elle est affectée par la présence
plus ou moins importante de sels ou de sucres dissous dans l'eau.
Enfin, selon sa concentration en NaCl, l’eau salée autorise le développement de
certains micro-organismes au détriment d’autres qui sont soit détruits soit inactivés.
Ainsi, le sel agit comme antimicrobien sélectif ou agent bactériostatique. Le rôle d’inhibiteur-
retardateur du sel est mis à profit en conserverie, notamment des viandes et du poisson
(salaisons), tandis que son rôle de régulateur-orientateur sur le développement des micro-
organismes sert, par exemple, au processus de fabrication puis d’affinage des fromages
(Martinez et al., 1995). C’est ainsi que de nombreux secteurs agro-alimentaires sont
concernés par l’utilisation de NaCl.

1.3.1 NaCl et conserves de viandes :

On distingue généralement les «salaisons vraies» dans lesquelles le sel est réparti
uniformément dans la viande à un taux supérieur à 5%, assurant ainsi une conservation de
plusieurs mois, des «produits salés» dans lesquels le sel est réparti parfois de façon hétérogène
10 

 
1. Introduction

et à des taux de 1 à 2% au maximum, servant alors davantage à accroître la qualité


organoleptique du produit qu’à en assurer sa conservation (Moletta, 2002).

Le sel est aussi largement utilisé dans les produits marinés très populaires en Europe
du Nord. Les marinades sont typiquement des émulsions d’eau et d’huile contenant du sel, du
sucre et des acides. Le double effet du sel et du pH acide agit alors comme un exhausteur de
goût en même temps qu’un agent antimicrobien. (Lefebvre, 2005).

1.3.2 La confiserie ou conserverie de légumes saumurés :

Dans l’industrie de la conserve, le sel agit par osmose, c’est à dire qu’il pénètre dans
les aliments au fur et à mesure que ceux-ci se vident de leur eau de constitution. Par ailleurs,
alors qu’il pénètre peu à peu à l’intérieur des aliments, le sel inhibe la croissance des micro-
organismes qu’ils contiennent, retardant leur décomposition. Le sel se retrouve généralement
à un taux de 2% dans les conserves de légumes (Lozach, 2001).

1.3.3 Industrie laitière : fabrication de beurre et de fromages:

La concentration moyenne en sel dans le fromage est de l’ordre de 1 à 2%. Dans les
fromages bleus et dans certains fromages de chèvre, elle peut toutefois atteindre 3 à 4%. Dans
le cycle de fabrication des fromages, le salage s’effectue après l’égouttage et avant l’affinage.
Il sert à protéger les fromages contre les micro-organismes indésirables (protection d’autant
plus nécessaire que le fromage est humide), mais aussi à sélectionner des micro-organismes
spécifiques nécessaires à la maturation du produit (développement du goût et de la fleur du
fromage).

Ainsi le sel permet la sélection de souches microbiennes productrices d’enzymes utiles


à la protéolyse et à la lipolyse du fromage et conditionne ainsi son affinage. En effet, la
transformation du lait en fromage se fait sous l’influence de différents micro-organismes.
Jusqu’à l’affinage et la maturation, le sel sélectionne certains micro-organismes producteurs
d’enzymes spécifiques indispensables à la protéolyse du caillé et autorise le développement
d’espèces utiles telles que celles responsables de la pousse du bleu dans la masse de certains
fromages ou celles formant la croûte fleurie en blanc des camemberts, ou encore la flore du

11 

 
1. Introduction

rouge des munsters et des pont-l’évêque. En ce qui concerne le beurre, le taux de sel n’excède
pas 5% du poids total du beurre demi-sel et 10% du beurre salé, en respect des normes
françaises. Le salage permet d’inhiber partiellement le développement microbien, notamment
celui des ferments lactiques (Lozach, 2001).

1.4 Stress osmotique

Outre les stress acide et hypothermique, les lactocoques sont soumis à d’autres stress
physico-chimiques au cours des procédés fromagers. Ils sont soumis à de brusques variations
de l’osmolarité environnante lors par exemple de l’égouttage/pressage ou du salage des
produits. Le stress osmotique correspond à une diminution ou une augmentation de
l’osmolarité de l’environnement de la bactérie (Csonka, 1989) qui, en modifiant la
disponibilité de l’eau de la cellule, affecte sa survie et/ou sa croissance (Potts, 1994).

Donc l’abaissement de l’activité de l’eau extérieure provoque un stress osmotique chez


la flore microbienne des aliments, qui se matérialise par une diminution de la pression de
turgescence pouvant conduire à la plasmolyse cellulaire et une dénaturation des
macromolécules causée par l’augmentation de la force ionique.

La réponse des bactéries au stress hyper-osmotique consiste principalement à


accumuler des composés dits compatibles (par synthèse ou transport) dans leur cytoplasme
afin de rétablir une pression de turgescence compatible avec les fonctions cellulaires (Sleator
et Hill, 2002).

1.4.1 Définition de l’osmose

Le phénomène d’osmose correspond à la diffusion spontanée, sous la seule influence


de l’agitation moléculaire, d’un composé chimique à travers une membrane semi-perméable.
Il se produit lorsqu’une substance est présente à des concentrations différentes de part et
d’autre de la membrane. Cette différence engendre un excès de pression, appelé pression
osmotique. La diffusion se fait alors de manière à ce que les deux concentrations tendent à
s’égaliser. Le corps dissous dans l’eau franchit la membrane vers la solution la moins
concentrée sous l’effet de la pression osmotique.

12 

 
1. Introduction

Ce transfert spontané ne nécessite aucune dépense d’énergie et joue un rôle essentiel dans
l’activité des cellules. Par osmose, les cellules vivantes peuvent, par exemple, capter des
nutriments dont elles ont besoin et rejeter leurs déchets.

Milieu extérieur

Equilibre osmotique 

Milieu extérieur

Choc hyper osmotique 

Milieu extérieur

Choc hypo osmotique 

Figure 1 : Représentation du flux d’eau durant la croissance (O’Byrne et Booth, 2002)

1.4.2 Effets du stress sur les bactéries rencontrées dans l’aliment

Les effets du stress dépendent des modalités d’application de ce dernier (acclimatation


ou choc). Ils entraînent surtout des défauts de croissance et/ou de viabilité chez les bactéries.
L’observation par microscopie de cellules stressées révèle différents types de modifications
morphologiques. Ainsi, un phénomène d’allongement cellulaire a été décrit chez Lb.
acidophilus en présence d’un stress hypo-thermique (Lorca et Font de Valdez, 1999), chez
Lb. alimentarius en présence d’un stress acide (Lemay et al., 2000), chez Listeria
monocytogenes en présence d’un stress acide, basique ou hyper-osmotique (Isom et al., 1995)
et chez Staphylococcus. aureus en présence d’un stress hyper-osmotique (Vijaranakul et al.,

13 

 
1. Introduction

1995). Au contraire, le raccourcissement cellulaire est observé chez Lb. sakei en présence
d’un stress hypo-thermique ou hyper-osmotique (Marceau et al., 2003).
L’association de ces deux stress a pour conséquence de lisser la surface externe des
cellules de Lb. sakei (Marceau et al., 2003). Le stress peut également provoquer un
événement d’agrégation cellulaire, comme c’est le cas chez Lb. alimentarius en présence d’un
stress hyper-osmotique (Lemay et al., 2000).

1.4.3 L’effet du stress osmotique sur la cellule bactérienne

a) Environnement hypo-osmotique :
Une diminution rapide de l’osmolarité du milieu extérieur (choc hypo-osmotique)
provoque un afflux d’eau dans la cellule et par conséquent une augmentation du volume
cellulaire et de la pression de turgescence. Etant donné que la rigidité de la paroi bactérienne
permet à la cellule de supporter des pressions élevées [jusqu’à 100 atm chez les bactéries à
Gram négatif (Carpita, 1985)], un choc hypo-osmotique ne provoque, en général, qu’une
faible augmentation du volume cellulaire.

b) Environnement hyper-osmotique :
Une augmentation brusque de l’osmolarité du milieu extérieur (choc hyper-osmotique)
entraîne un rapide flux d’eau vers l’extérieur de la cellule ; le volume du cytoplasme diminue.
Ce phénomène de plasmolyse peut être détecté instantanément par une augmentation de la
turbidité du milieu (Koch, 1984).

La cinétique de plasmolyse dépend de l’importance de la variation de l’osmolarité du


milieu et de la nature des solutés employés (sels, sucres…).
Dans le cas d’un choc hyper-osmotique sévère, la brusque diminution de l’activité de l'eau du
cytoplasme inhibe certaines fonctions cellulaires comme l’adsorption de nutriments, la
réplication de l’ADN ou la biosynthèse de macromolécules (Csonka, 1989).

En cas de choc hyper-osmotique modéré, la plasmolyse n’est qu’une étape transitoire.


En effet, la cellule est capable de s’adapter à ces faibles variations de l’osmolarité du milieu.

14 

 
1. Introduction

Ce phénomène n’est, bien sûr, pas observé lorsque la solution hyper-osmotique


contient des molécules diffusibles comme le glycérol ou l’éthanol. Il n’y a pas de plasmolyse
chez les bactéries à Gram positif car elles ont une pression de turgescence supérieure à celle
des Gram négatif parce que leur membrane est collée au peptidoglycane.

Cependant un stress osmotique entraînera quand même un arrêt de la croissance ainsi


que l’inhibition d’autres fonctions biologiques. De la même façon, lors d’un choc hypo-
osmotique, il va y avoir un afflux d’eau vers l’intérieur de la bactérie provoquant un
gonflement, une augmentation de la pression de turgescence s’exerçant sur la membrane
allant parfois jusqu’à l’éclatement cellulaire (Glaasker et al., 1998; Poolman et Glaasker,
1998).

En réponse à ces phénomènes physiques, la cellule ne se contente pas de voir son


volume varier, elle va mettre en place un système actif permettant d’équilibrer les pressions
osmotiques sans mouvements d’eau. Ce système est basé sur l’entrée ou la sortie de solutés
qui peuvent être récupérés dans le milieu ou néo-synthétisés, appelés solutés compatibles.

Les solutés impliqués dans ces phénomènes sont dits compatibles car leur
accumulation dans le cytoplasme bactérien n’a aucun effet sur les processus cellulaires vitaux.
Parmi eux, on trouve des ions (K+), des acides aminés (proline, glutamate, glutamine), des
polyols, des sucres (sucrose, tréhalose) ainsi que des composés ammoniums quaternaires
(glycine bétaïne et carnitine).

Certains de ces composés sont dits osmoprotectants car en plus d’être compatibles
avec la physiologie cellulaire, ils sont capables de lever les différentes inhibitions de
croissance imposées par le stress osmotique.

Les osmoprotectants les plus importants sont la proline et surtout la glycine bétaïne
qui en plus de modifier l’osmolarité cellulaire est capable de se lier aux protéines et de les
stabiliser. Ces solutés peuvent être accumulés dans la cellule grâce à un transport actif ou dans
certains cas grâce à une synthèse de novo induite par le stress (Glaasker et al., 1998;
Poolman et Glaasker, 1998).

15 

 
1. Introduction

Chez les bactéries à Gram négatif, un stress hyper-osmotique va entraîner des


mouvements de solutés compatibles. Les premiers transporteurs activés suite à un tel stress
chez E. coli sont ceux responsables de l’entrée d’ions K+. Deux types de systèmes sont
impliqués, un système Kdp à deux composants, dont KdpD est la protéine kinase-senseur
membranaire probablement activée par une altération des interactions protéines-lipides
(Poolman et al., 2002), et KdpE est la protéine régulatrice associée qui une fois phosphorylée
va activer les gènes kdpABC du transporteur. Le second système, Trk, est également régulé au
niveau transcriptionnel et son activité dépend de la pression de turgescence, de l’osmolarité
interne et/ou de la concentration intracellulaire en K+.

Chez Bacillus subtilis, un tel choc induit également l’accumulation d’ions K+ dans le
cytoplasme puis une augmentation soit de la bétaïne soit de la proline intracellulaire par
transport ou synthèse de novo. Il existe trois systèmes de transport osmorégulés chez B.
subtilis, OpuA qui est de la famille des transporteurs ABC (homologue à ProU d’E. coli),
OpuC (ProP), et OpuD qui est un homologue de BetT, transporteur de haute affinité pour la
choline indispensable à la néo-synthèse de glycine-bétaïne chez E. coli (Kappes et al., 1996).
Contrairement aux lactocoques, B. subtilis est capable comme E. coli de synthétiser de la
glycine-bétaïne (Boch et al., 1996) lorsque la choline (précurseur) se trouve dans le milieu,
par le biais d’enzymes analogues à celles trouvées chez E. coli qui sont ici codées par
l’opéron plasmidique gbsAB.

Chez les bactéries lactiques un choc hyper-osmotique entraîne également


l’accumulation cytoplasmique de glycine bétaïne qui paraît être le soluté le plus efficace pour
ces bactéries. Ici, l’accumulation s’effectue grâce à un transport de glycine-bétaïne exogène
car les lactocoques, comme les lactobacilles (Glaasker et al., 1996; Glaasker et al., 1998),
sont incapables de synthétiser ce composé. Obis et al. (1999) ont caractérisé à l’aide de
mutants les gènes impliqués dans ce transport. L’opéron busA comprend le gène busAA qui
code pour la protéine BusAA (407 acides aminés) homologue à OpuAA de B. subtilis et ProV
d’E. coli qui sont des protéines de liaison à l’ATP. Le gène busAB code pour une protéine de
573 acides aminés qui comporte un domaine hydrophobe transmembranaire (N-terminal) et
un domaine hydrophile C-terminal de liaison à la bétaïne.

16 

 
1. Introduction

BusAB présente des homologies avec OpuAC et ProV bien que les sous-domaines se trouvent
inversés. L’opéron busAB semble sous contrôle osmotique, et outre la glycine-bétaïne, ce
transporteur peut également utiliser la proline mais avec une affinité moindre.
Van der Heide et Poolman (2000) nomment ce système de transport OpuABC. Pour eux, la
régulation de l’entrée de la glycine-bétaïne s’effectue au niveau de l’expression et de l’activité
du transporteur chez Lc. lactis, alors que chez Lb. plantarum, seule une régulation de son
activité est impliquée.
En effet, il a été mis en évidence chez Lc. lactis l’existence d’une protéine OpuR impliquée
dans la régulation osmotique du gène opuA (Romeo et al., 2001).
L’opéron opuA ou busA semble être induit par des changements de gradient osmotique
transmembranaire ou de pression de turgescence qui seraient transmis au système via des
distorsions de la bicouche lipidique induisant des modifications physiques du statut lipidique
membranaire (plus d’acides gras insaturés et cycliques) ressenties via des interactions
lipide/protéine (Guillot et al., 2000; van der Heide et Poolman, 2000).

La capacité d’accumulation de la bétaïne va donc déterminer l’osmotolérance des


lactocoques. Ainsi, la différence de tolérance au stress osmotique des bactéries de la sous
espèce lactis par rapport à celles de la sous-espèce cremoris (souches généralement moins
résistantes) a pu être expliquée par une absence ou une faible activité du transporteur (Obis et
al., 2001).

Ces systèmes permettent donc aux bactéries de contrecarrer les effets de


l’hyperosmolarité du milieu, néanmoins, comme c’est le cas avec le stress acide, une
meilleure réponse cellulaire (croissance, survie) est obtenue lorsque les bactéries ont été pré-
adaptées par un stress non létal. L’analyse de la production de protéines en réponse à un choc
hyperosmotique chez Lc. lactis a montré l’augmentation de la synthèse d’au moins douze
protéines, dont celles impliquées dans le transport de la glycine-bétaïne (OpuAA et OpuABC)
ainsi que DnaK, GroES et GroEL impliquées dans la réponse au choc thermique (Kilstrup et
al., 1997).

Comme c’est le cas pour les deux stress physico-chimiques précédents, il semble
clairement que le stress hyper-osmotique induit des réponses croisées avec d’autres stress. La
réponse à l’hypo-osmolarité du milieu passe par l’efflux de solutés compatibles afin d’éviter

17 

 
1. Introduction

le gonflement cellulaire. Cette réponse a essentiellement été étudiée chez les bactéries à Gram
négatif, et deux systèmes d’efflux ont été identifiés à ce jour, les canaux mécano-sensibles et
les porines.

Les canaux mécano-sensibles ont été étudiés chez E. coli (Blount et Moe, 1999;
Sukharev, 1999), trois canaux ont été mis en évidence en fonction de leur conductance :
MscL (large conductance), MscS (small) et MscM (mini), il semble que MscL et S jouent un
rôle important et redondant dans l’osmorégulation.
Il semble que ces canaux soient activés soit par la tension exercée au niveau de la membrane
soit par un état d’hydratation des protéines tel que la conformation ouverte du canal est
favorisée (Poolman et al., 2002). Chez Lactococcus lactis les gènes yncB et mscL codent pour
des protéines homologues à MscS et MscL. Seule l’activité de MscL est identifiée chez Lc.
lactis qui utilise ce type de canal pour l’efflux de solutés compatibles et la protection
cellulaire dans des conditions d’hypo-osmolarité (Folgering et al., 2005).

Les porines n’existent que chez les bactéries à Gram négatif car elles sont enchâssées
dans la membrane externe. L’expression des porines OmpF et C en réponse à l’osmolarité
extracellulaire est régulée par un système à deux composants dont la protéine membranaire
EnvZ est le senseur et OmpR l’activateur transcriptionnel (Csonka, 1989).

1.5 Les solutés compatibles : un moyen de réponse à un stress hyper-osmotique

En réponse à un stress osmotique, une perte d’eau est constatée dans la cellule pour
maintenir une pression de turgescence constante. Ceci conduit à une modification du volume
cellulaire et des concentrations des solutés. Pour remédier à ces effets, la cellule accumule des
solutés compatibles, physiologiquement inactifs, qui permettent de rétablir la balance
osmotique.
Les solutés compatibles sont des molécules organiques très hydrosolubles qui possèdent une
charge nette nulle au pH physiologique, n’interagissent pas avec les protéines, n’interfèrent
pas, même à forte concentration (>1 M), avec les fonctions cellulaires vitales (Sleator et Hill,
2002).

18 

 
1. Introduction

Bien que les solutés compatibles aient été décrits comme «inertes» vis-à-vis des
macromolécules biologiques, des études réalisées in vitro montrent qu’ils stabilisent
indirectement les enzymes contre les effets d’agents dénaturants comme le sel, la température
ou la dessiccation (Lipper et Galinski, 1992; Timasheff, 1993). Ces composés agiraient
comme des chaperonnes chimiques en aidant les protéines cytoplasmiques à conserver leur
état de compaction (Tatzelt et al., 1996; Bourot et al., 2000).

Figure 2. Effet de l’osmolarité sur la structure d’une protéine d’une halobactérie et sa


stabilisation après l’ajout des solutés compatibles (Sleator et Hill, 2002)

• Glycine bétaïne

Le rôle de cet ammonium quaternaire naturel, le N,N,N-triméthylglycine (Anthoni et al.,


1991) dans l’osmoprotection a été signalé chez Pediococcus soyas dès 1960 (Attou , 2004).
Plusieurs observations suggèrent que la glycine bétaïne est préférable aux autres solutés
compatibles pour plusieurs bactéries en conditions hyper-osmotiques. C’est un
19 

 
1. Introduction

osmoprotecteur qui stimule la croissance des bactéries lactiques à pression osmotique élevée
(Csonka, 1989). Chez les entérobacteriacées et les Rhizobiacées, la glycine bétaïne joue un
rôle majeur dans l’osmorégulation (Perroud et Le Rudulier, 1985) ; la synthèse de la glycine
bétaïne dépend de la présence d’un précurseur immédiat, la choline ou la glycine bétaïne
aldéhyde (Smith et al., 1998).

Le transport de la glycine bétaïne exogène chez les cellules soumises à un stress


osmotique, conduit à l’accumulation massive de cette molécule (Perroud et Le Rudulier,
1985), elle permet l’attraction et la rétention d’eau dans la cellule (Le Rudulier et al., 1984)

Les entérobactéries et Bacillus subtilis ne peuvent pas synthétiser les solutés compatibles.
Elles les accumulent dans le milieu intracellulaire lors d’un choc osmotique grâce aux
mécanismes de transport (Glaasker et al., 1998 ; Romeo et al., 2001). Parfois l’accumulation
intracellulaire de la glycine bétaïne dépend d’un transport stimulé par un stress osmotique (Le
Rudulier, 1993).

• La proline

La concentration intracellulaire en proline augmente chez plusieurs bactéries Gram – ou


+ ; cette accumulation peut être le résultat d’une stimulation de la synthèse et/ou d’activité de
transport (Csonka, 1981 ; Le Rudulier et al., 1984) des travaux ont mis en évidence le rôle
osmoprotecteur de la proline exogène chez de nombreuse espèces bactériennes (Csonka et
al., 1991)

Les bactéries Gram – sont entièrement dépendantes de la présence de proline exogène pour
l’accumuler sous stress osmotique (Le Rudulier et Bouillard, 1993 ; Csonka, 1989).

• Le glutamate

Le taux de glutamate dans le cytoplasme augmente chez les procaryotes après exposition à
une forte osmolarité (Fujihama et Yaneyama, 1994) ; l’augmentation relative du glutamate
est moins importante chez les bactéries à Gram positif que chez les bactéries à Gram négatif
(Killham et Firestone, 1984). La teneur intracellulaire en glutamate augmente aussi lors
d’une élévation de l’osmolarité du cytoplasme (Le Rudulier, 1993) afin de maintenir
l’électroneutralité du milieu intracellulaire chez les bactéries à Gram négatif le glutamate est
important dans la maintenance de la pression de turgescence de la cellule (Neidhardt et al .,
1994)
20 

 
1. Introduction

• Les polyols

Les polyols (les glucides et leurs dérivés polyalcools) sont les principaux solutés
compatibles, le glycérol est le prédominant (Brown et Edgley, 1980).

Chez les bactéries, les plantes et les animaux, les acides aminés et leurs dérivés sont
prédominants (Csonka, 1989 ; Kinne, 1993). Chez Pseudomonas neudocina, le glycérol est
important (Picard et al., 1994). Chez les algues et les champignons, les polyols sont limités, à
l’exception du sorbitol chez Zymomonas mobilis et du mannitol chez Pseudomonas putida
(Kets et al., 1996).

• Les sucres

Les sucres sont des solutés moins compatibles, utilisés dans l’adaptation osmotique chez
les organismes halotolérants limités. Dans la croissance normale, l’addition des sucres
provoque des altérations physiologiques et structurelles.

Les sucres (tels que le saccharose et le tréhalose) interviennent chez quelques


microorganismes lorsqu’ils poussent sous stress osmotique. Ces derniers dépassent une
concentration cytoplasmique de 0.5 M (Galinski et Truper, 1994).

• Les sulfoniums tertiaires

Ces composés ont une structure analogue à celle des ammoniums quaternaires (N est
substitué par S) : le diméthylsulfoniacétate (DMSA) est une molécule osmoprotectrice aussi
efficace que la glycine bétaïne chez les bactéries (Chambers et al., 1987).

Le diméthylsulfoniopropionate (DMSP) a un rôle très important dans l’ajustement osmotique


chez les algues marines (Blunden et al., 1982 ; Seruto et al., 1989 ; Colmer et al., 1996).

1.6 Les réponses aux stress :

Toute modification des conditions environnementales, nutritionnelles ou physico-


chimiques, causant une perturbation notable de la physiologie cellulaire est considérée comme
un stress, qu’elle s’accompagne ou non d’une létalité.

21 

 
1. Introduction

La croissance des bactéries dépend des conditions nutritionnelles et environnementales


qu’elles rencontrent. En effet, les micro-organismes ne peuvent se développer de façon
optimale que dans une gamme limitée de facteurs physico-chimiques (tels que la température,
le pH, la salinité, etc.) et nécessitent un apport en carbone, azote et phosphate, requis pour la
synthèse des constituants cellulaires (protéines, acides nucléiques, etc.).
Pendant la production des ferments lactiques, les bactéries sont soumises à différents
stress et leur résistance à ces stress varie selon plusieurs facteurs. Deux concepts sont
importants pour l’analyse et la compréhension d’un stress: le concept d’intensité et le concept
de cinétique.

Les cellules peuvent être soumises à des stress dits mineurs, modérés ou létaux et elles
réagissent différemment à ces conditions. Par exemple, les cellules exposées à un stress
mineur, vont réduire leur taux de croissance mais vont être capables de s’adapter au nouvel
environnement. Quand le stress devient un peu plus intense (stress modéré), la croissance peut
être drastiquement réduite et les cellules adaptent leur métabolisme énergétique avec l’objectif
de survivre. Enfin, dans une situation de stress létal, une grande mortalité cellulaire est
observée. Dans ce cas, les bactéries survivantes développent des mécanismes leur permettant
de retrouver un état cellulaire actif. Lorsqu’elles sont, par la suite, exposées à des conditions
environnementales plus favorables (Nikolaev et al., 2006)

L’intensité du stress perçu par les cellules comprend aussi la notion de cinétique
d’application du stress. Par exemple, un changement brusque dans l’environnement, même si
l’intensité de ce changement est faible, peut être ressenti par les cellules comme un stress fort,
car elles n’ont pas eu le temps de s’adapter. Par contre, un changement lent et progressif avec
une intensité forte, peut donner aux cellules l’opportunité de développer des mécanismes
d’adaptation et, donc, de mieux résister (Avinash et al., 2008).

Les bactéries préviennent les dommages plutôt que de les réparer (Hengge-Aronis,
2002) aussi une bactérie dispose de différents systèmes protégeant la cellule des contraintes
extérieures dont les activités seront modulées par les variations des paramètres
environnementaux.

22 

 
1. Introduction

La plupart du temps, il s’agira pour la bactérie de détecter le signal stress puis


d’activer ou de réprimer la transcription de différents gènes permettant une réponse rapide et
efficace. Cette réponse est spécifique de la nature du stress appliqué et/ou général (réponse
globale indépendante de la nature du stress appliqué).

Les régulateurs potentiels de la réponse au stress chez les bactéries sont nombreux. Il
en existe par exemple 138 chez Lc. lactis (par homologie avec des familles connues de
régulateurs) (Guédon et al., 2001). Deux types de régulateurs jouent un rôle important chez
les bactéries. Il s’agit des facteurs de transcription et des systèmes à deux composants.

1.7 Les régulateurs globaux de la réponse au stress

Les bactéries répondent aux variations de leur environnement en activant ou en


réprimant certains gènes. La détection du signal stress et la régulation des gènes protecteurs
supposent l’existence de systèmes plus ou moins généraux de régulation. Deux grandes
familles de régulateurs existent: les systèmes dits à deux composants et les facteurs de
transcription (facteurs sigma).

1.7.1 Les systèmes à deux composants :

Ils comprennent une protéine Histidine Kinase senseur (HK) et une protéine régulatrice de
réponse (RR). Les protéines senseurs intégrées dans la membrane s’autophosphorylent au
niveau de résidus histidine lorsqu’elles perçoivent un signal de type stress.
Elles sont alors capables d’activer les protéines régulatrices par phosphorylation. Ceci
s’effectue au niveau d’un résidu aspartate de la protéine RR. Sous leur état phosphorylé, ces
protéines RR activent une réponse cellulaire appropriée, souvent par induction
transcriptionnelle (les RR sont pour la plupart des protéines de liaison à l’ADN).

23 

 
1. Introduction

Tableau 01: Fonction des systèmes à deux composantes chez Lactococcus lactis

Figure 3. Représentation schématique des différents paramètres physiologiques impliqués


dans l’osmosensing chez une bactérie Gram positif (selon Sleator et Hill, 2002)

24 

 
1. Introduction

1.7.2 Facteur sigma

La régulation de la réponse générale au stress est également contrôlée par des facteurs
de transcription (facteurs sigma) qui, en se fixant à l’ARN polymérase, lui confèrent une
spécificité de reconnaissance vis-à-vis de certains promoteurs (Haldenwang, 1995)
Les nombreux facteurs sigma bactériens ont été regroupés dans deux familles d’après leurs
similarités protéiques : la famille δ70, facteur végétatif nommé ainsi d’après le facteur δ d’E.
coli de 70 kDa) et la famille δ 54 (nommée ainsi d’après le facteur δ d’E. coli de 54 kDa)
(Wosten, 1998).

La famille δ70 est elle-même divisée en trois groupes: le premier comprend les
facteurs sigma responsables de la transcription de la plupart des gènes exprimés durant la
phase exponentielle de croissance bactérienne; le second est composé des facteurs sigma non
essentiels à la croissance bactérienne; le dernier est celui des facteurs sigma dits «alternatifs»
contrôlant la transcription des régulons spécifiques durant des conditions physiologiques
particulières (production de flagelles, sporulation), et en réponse à des stress
environnementaux (Gruber et Bryant, 1997; Wosten, 1998).
Les facteurs sigma intervenant dans la réponse au stress se répartissent dans les groupes 2 et
3. Ils sont impliqués dans la réponse aux stress cytoplasmiques ou bien extracytoplasmiques.

1.8 Lactococcus lactis et le stress

Les bactéries lactiques, et en particulier Lactococcus lactis, jouent un rôle primordial


dans les premières étapes de la transformation du lait, mais elles interviennent aussi,
directement et indirectement, dans la phase d’affinage et dans la qualité sanitaire des produits.
La croissance des bactéries en général, et de Lactococcus lactis en particulier, dépend des
conditions nutritionnelles (sources de carbone et d’azote.) et physico-chimiques (pH,
température, salinité.). Les conditions de culture en laboratoire sont souvent optimisées et
contrôlées pour assurer une croissance rapide. A l’inverse, Lactococcus lactis, que ce soit
dans son habitat naturel (plantes, sol) ou lors de sa mise en œuvre dans les processus
industriels, doit faire face à de multiples stress nutritionnels ou physico-chimiques (thermique,
oxydatif, acide, osmotique) parfois concomitants (Bunthof et al., 1999; Sanders et al., 1999;
Stuart et al., 1999). En effet, Lc. lactis est soumis à de fortes variations de températures dans

25 

 
1. Introduction

le sol ou lors de la fabrication de fromages tels que le cheddar, pour lequel la température
monte jusqu’à 40°C. A l’inverse, la température est beaucoup plus faible pendant l’affinage
(8-16°C) ou le stockage du fromage. De même, la production de lactate dans les levains
provoque, quant à elle, une acidification croissante du milieu (lait). Dans ce cas, les bactéries
sont elles-mêmes à l’origine du stress acide. La pression osmotique est également susceptible
de varier significativement, notamment lors du pressage. Cette étape peut également conduire
à une limitation carbonée par l’élimination du lactose dans le lactosérum (Stuart et al., 1999).

Les mécanismes de perception du stress, essentiels pour que la cellule puisse se protéger
avant que les effets de ce stress ne soient irréversibles, sont encore peu connus chez
Lactococcus lactis, mais semblent se faire chez les autres bactéries, soit au niveau
membranaire, soit au niveau du cytoplasme (Rallu, 1999). Les effets du stress peuvent être
visualisés à plusieurs niveaux : modification du catabolisme, de l’anabolisme, de l’état
énergétique, des constituants cellulaires. Face aux différents effets du stress, les bactéries
disposent de plusieurs types de réactions qui se répartissent en trois catégories (Rallu, 1999).

• La fuite consiste, pour les bactéries capables de motilité, à rechercher des conditions
plus favorables à la croissance, mais Lactococcus lactis qui est dépourvu de flagelle ne
peut pas utiliser cette tactique.
• Le refus a pour but de diminuer l’intensité du stress, par exemple en utilisant une autre
source de nutriment lorsqu’elle est épuisée.
• La résistance devient nécessaire lorsque le stress est persistant et/ou dommageable
pour les constituants cellulaires. Elle peut être acquise soit par une modification
irréversible du matériel génétique (mutation, remaniement) conduisant à une meilleure
tolérance aux conditions environnementales, soit par l’induction de systèmes de
protection et de lutte contre le stress ou de réparation contre les dommages causés.

26 

 
1. Introduction

1.9 Mécanismes de lutte contre le stress

Chez Lc. lactis, bien que la participation d’un mécanisme de réponse générale au stress
reste entièrement hypothétique, de nombreuses réponses au stress ont été identifiées, dont
certaines apparaissent communes à différentes conditions. Ainsi, plutôt que de décrire les
réponses mises en œuvre pour chaque type de stress que peut rencontrer Lc. lactis, celles-ci
seront décrites dans la section suivante selon leur rôle dans la cellule. Les mécanismes de lutte
contre les effets du stress sur les constituants cellulaires, l’homéostasie du cytoplasme ou
l’énergétique cellulaire seront ainsi présentés, de même que la réponse stringente induite dans
diverses conditions de stress dont la carence en acides aminés.

1.9.1 Protection et réparation des constituants macromoléculaires


Divers stress, en particulier les stress physico-chimiques, altèrent les protéines et les
acides nucléiques. Ces composants étant essentiels au fonctionnement de la cellule, une des
réponses majeures au stress chez tous les micro-organismes est l’induction de protéines
impliquées dans leur protection ou leur réparation.

1.9.1.1 Les chaperonnes

Ces protéines, très conservées parmi les différentes espèces bactériennes, assurent le
repliement correct des protéines nouvellement synthétisées ou endommagées et préviennent
l’agrégation des protéines altérées. Les chaperonnes initialement identifiées lors du choc
thermique sont également impliquées dans la majorité des stress chez la plupart des micro-
organismes. Chez Lc. lactis, elles sont induites en stress hyperthermique, acide et osmotique
(Whitaker et Batt, 1991; Kim et Batt, 1993; Arnau et al., 1996; Hartke et al., 1997;
Kilstrup et al., 1997; Frees et al., 2003). Le mécanisme le mieux caractérisé est l’induction
des chaperonnes DnaK, GroEL et GroES. Les chaperonnes DnaJ et GrpE ont à ce jour été
identifiées en stress hyperthermique et acide uniquement (Duwat et al., 1995; Arnau et al.,
1996; Frees et al., 2003). En revanche, l’implication des chaperonnes dans les réponses à la
carence en carbone ou en azote ou lors du stress hypothermique n’a pas été mise en évidence
chez L. lactis (Kunji et al., 1993; Hartke et al., 1994) ni chez B. subtilis (Eymann et al.,
2002; Bernhardt et al., 2003). Ceci peut certainement s’expliquer par le fait que ces
conditions ne causent pas de dommages majeurs aux protéines.

27 

 
1. Introduction

Figure 4. Modèle d’action du système GroESL dans le repliement protéique

Chez B. subtilis, les gènes codant pour les chaperonnes (opérons dnaK et groE) sont
régulés par le répresseur HrcA (Schulz et Schumann, 1996). Celui-ci réprime l’expression
des chaperonnes en se fixant sur les séquences CIRCE (Controlling Inverted Repeat
Chaperone Expression) présentes en amont des gènes (Zuber et Schumann, 1994; Hecker et
al., 1996). Ces séquences inversées répétées de 9bp sont retrouvées chez plus de 27 espèces
bactériennes (Hecker et al., 1996). L’activité du répresseur HrcA est contrôlée chez B.
subtilis par les chaperonnes GroES/EL (Mogk et al., 1997; Mogk et al., 1998).

En conditions normales de croissance, elles assurent un repliement optimal de HrcA ce


qui autorise sa fixation aux séquences CIRCE. Lors d’un stress, la disponibilité des
chaperonnes GroES/EL va être réduite, causant une inactivation partielle de HrcA qui affecte
sa fixation aux séquences CIRCE. Par conséquent, une levée de la répression des gènes
codant pour les chaperonnes est observée.

Chez Lc. lactis, 3 unités de transcription codant pour les chaperonnes ont été
identifiées, révélant une organisation génétique particulière: l’opéron hrcA-grpE-dnaK
(Eaton et al., 1993), l’opéron groESL (Kim et Batt, 1993) et dnaJ (Van Asseldonk et al.,
1993). Leur régulation n’a pas été formellement mise en évidence, cependant elle semble
impliquer HrcA, comme chez B. subtilis. En effet, le gène codant pour ce régulateur a été
identifié (Kilstrup et al., 1997) et les 3 opérons codant pour les chaperonnes présentent une
séquence CIRCE en amont de leurs séquences codantes (Guedon et al., 2002). Il est

28 

 
1. Intrroduction

importaant de soulligner qu’auucune autree séquencee CIRCE n’est


n présennte sur le génome,
indiquannt que le réégulon hrcA
A doit être liimité à ces 3 unités chez Lc. lactiis. A l’inverrse de ce
qui est observé
o cheez B. subtiliis, DnaK estt impliquée dans la maaturation de HrcA (Kocch et al.,
1998) alors que GroES/EL ne semblent pas interveniir dans le coontrôle de ce répresseur.

5 Modèle d’action du système


Figure 5. s DnaK dans le repliement
r pprotéique

L protéases
1.9.1.2 Les

D
Différentes protéases sont impliiquées dan
ns les réponses au sttress. Leur activité
protéolyytique a unn rôle préppondérant pour
p dégrad
der les prootéines altérrées, limitaant ainsi
l’accum
mulation de protéines anormales
a d
dans la celllule, ou pouur assurer ddes phénom
mènes de
régulation spécifiqques. 3 typees de protéaases particip
pent aux méécanismes m
majeurs de réponse
au stress: les protéaases Clp, HttrA et HflB.
Les prootéases Clp sont les pluus répanduees et les miieux caractéérisées. 4 gèènes ont étéé mis en
évidencce chez Lc. lactis
l : clpP
P qui code pour
p une sérrine protéasee (Frees et Ingmer, 19
999) et 3
gènes coodant pour des ATPasees Clp-dépeendantes, clp
lpB, clpC ett clpE. Ces ATPases seeules ont
un rôle de chaperoonnes. Leurr associatioon à ClpP confère
c unee activité prrotéolytiquee à cette
protéasee et définit sa spécificiité de substtrat (Ingmer et al., 19999). Le com
mplexe Clp dégrade
les prottéines dénatturées qui ne
n peuvent pas être rep
pliées par lees chaperonnnes, ce qui permet
d’éviterr l’accumulaation de prootéines anorrmales (Frees et Ingmeer, 1999). C
ClpP est nottamment
induite à bas pH et en stress thhermique ouu osmotiquee.

29 

 
1. Intrroduction

Figure 6. Modèle d’action du co


omplexe Cllp protéase

1.9.1.3 Réparation
R n de l’ADN
N
 
D
Diverses coonditions dee stress connduisent à une
u altératioon de l’ADN
N qui est fo
ortement
dommaggeable pourr le développpement de la cellule. RecA
R est laa principale protéine im
mpliquée
N par ses propriétés reecombinantes et sa caapacité à in
dans la réparation de l’ADN nduire la
réponsee SOS. Chezz Lc. lactis,, recA est im
mpliqué dan
ns les réponnses aux ageents endommageant
l’ADN (Duwat et al.,
a 1995).

30 

 
 

 
2. Matériel & méthodes
 
2.1 Matériel biologique

Nous avons utilisé 55 souches de bactéries lactiques. Ces souches proviennent de la


collection du Laboratoire de Biologie des Microorganismes et Biotechnologie de l’Université
d’Oran (LBMB), elles sont isolées de différents écosystèmes.
Les souches bactériennes utilisées ainsi que leurs sources d’isolement sont indiquées dans le
tableau 2

Tableau 02 : Origine des souches étudiées


Souche Genre et Espèce Origine d’isolement

CHM1 Lactococcus sp Lait de chamelle de


CHM2 Lactococcus sp Mauritanie (Ould Ahmed
CHM3 Lactococcus sp Elmokhtar, 2008)
CHM4 Lactococcus sp
CHM6 Lactococcus sp
CHM7 Lactococcus sp

Lait de chamelle de
CHT2 Enterococcus faecalis Timimoune (Zadi-
CHT4 Enterococcus faecalis Karam, 1998)

GHB1 Enterococcus sp
GHB2 Enterococcus sp
GHB3 Enterococcus sp Ghars (pâte de dattes) de
GHB4 Enterococcus sp Biskra (Benmouna, 2008)
GHB5 Enterococcus sp
GHB6 Enterococcus sp
GHB7 Enterococcus sp
GHB8 Lactococcus lactis ssp diacetylactis
GHB9 Enterococcus sp
GHB10 Enterococcus sp
GHB11 Lactococcus lactis ssp diacetylactis
GHB12 Enterococcus sp
GHB13 Enterococcus sp
GHB14 Enterococcus sp
GHB15 Lactococcus lactis ssp diacetylactis
GHB16 Enterococcus sp
GHB17 Lactococcus lactis ssp diacetylactis
GHB18 Enterococcus sp
GHB19 Enterococcus sp
GHB20 Enterococcus sp
GHB21 Enterococcus sp
GHB22 Enterococcus sp
GHB23 Enterococcus sp
GHB24 Lactococcus lactis ssp diacetylactis
GHB25 Enterococcus sp

  31
2. Matériel & méthodes
 

LV4 Lactoccus lactis ssp diacetylactis Lben (Kacem, 2004)


LV6 Lactoccus lactis ssp diacetylactis
LV10 Lactoccus lactis ssp diacetylactis
LV12 Lactoccus lactis ssp lactis

V1 Lactoccus lactis ssp lactis


V2 Lactoccus lactis ssp lactis
V3 Lactoccus lactis ssp lactis
V5 Lactoccus lactis ssp lactis
V6-1 Lactoccus lactis ssp lactis
V6-2 Lactoccus lactis ssp lactis
V9 Lactoccus lactis ssp cremoris
V13-1 Lactoccus lactis ssp lactis Viande bovine fraiche de
V15 Lactoccus lactis ssp cremoris Mostaganem
V17 Lactoccus lactis ssp lactis (Benbernou, 2008)
V19 Lactoccus lactis ssp lactis
V24 Lactoccus lactis ssp lactis
V26-1 Lactoccus lactis ssp lactis
V26-2 Lactoccus lactis ssp lactis

LVK3 Lactococcus sp Lait de vache d’El-Karma


LVK21 Lactococcus sp (Karam, 1995)
LVK22 Lactococcus sp
LVK25 Lactococcus sp

BO1 Lactoccus lactis ssp diacetylactis Beurre


F4 Lactoccus lactis ssp diacetylactis Fromage
OV5 Lactoccus lactis ssp diacetylactis Saumure d’olives vertes
LCL Lactoccus lactis ssp lactis INRA

2.2 Conditions de culture


Les souches sont cultivées à 30°C dans le milieu M17 liquide ou solide.
2.3 Milieux de culture
• Milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975) : utilisé pour la culture des coques lactiques
Les milieux de culture solides sont obtenus par addition de 15g/l d’agar-agar aux
milieux liquides.
• Milieu M17 Milk–agar (Van Den Berg et al, 1993) : ce milieu est composé du milieu
M17, additionné de 2% (m/v) de lait écrémé, pour mettre en évidence l’activité
protéolytique.
• Lait écrémé : reconstitué à 10%, stérilisé et utilisé pour la conservation des souches.

La composition des milieux de culture est indiquée en annexe.

  32
2. Matériel & méthodes
 
2.4 Vérification de la pureté des souches

Les souches sont ensemencées par stries sur milieu M17. Après incubation à 30°C, on
prélève une colonie isolée afin d’effectuer une coloration de Gram et une recherche de
l’enzyme catalase.
La pureté des souches est confirmée par l’étude des caractères macroscopiques et
microscopiques après coloration de Gram.
L’activité catalasique est recherchée par émulsion d’une colonie bactérienne dans
quelques gouttes d’eau oxygénée (10V). La présence de la catalase se manifeste par
l’apparition de bulles gazeuses.

Les bactéries lactiques sont Gram positif et catalase négative.

2.5 Conservation des souches

Pour une conservation de courte durée, les bactéries en phase exponentielle de


croissance sont conservées à 4°C sur gélose inclinée.
Pour une conservation plus longue, les cultures en lait écrémé à 10% sont placées à -20°C.

2.6 Croissance des souches en présence de différentes concentrations de NaCl

Les souches sont ensemencées dans 5ml de milieu M17 liquide en absence ou en
présence de différentes concentrations de NaCl : 0.42M, 0.77M, 1.1M, 1.3M, 1.45M, 1.65M
et 1.7M. La croissance cellulaire est estimée par mesure de la densité optique par
spectrophotométrie à une longueur d’onde de 600nm.
Ce test permet de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) de NaCl ; elle
correspond à la plus faible concentration en NaCl empêchant la croissance bactérienne.

2.8 Croissance des souches en présence de CMI de NaCl et de glycine betaine ou de


proline

La croissance des souches est inhibée aux CMI de NaCl et elle est rétablie par
l’addition de substances osmoprotectrices au milieu de culture (Le Marrec et al., 2006).

  33
2. Matériel & méthodes
 
On a testé la croissance des souches en milieu M17 liquide en présence de la
concentration minimale inhibitrice de NaCl et de différentes concentrations de glycine betaine
ou de proline (de 5mM à 100mM). Après incubation à 30°C pendant 72h, la croissance se
traduit par l’apparition d’un trouble bactérien.
La densité optique est mesurée à DO600nm ce qui permet de déterminer la concentration
optimale d’osmoprotecteurs assurant la meilleure croissance bactérienne.

2.9 Cinétique de croissance

Après avoir déterminé les concentrations optimales de proline et de glycine betaine qui
permettent de lever l’inhibition exercée par le sel, nous avons réalisé des cinétiques de
croissance en absence ou en présence de différentes concentrations de NaCl et de proline ou
glycine bétaine.
Les essais sont réalisés dans 100 ml de milieu M17 additionné de différentes
concentrations de NaCl et d’osmoprotecteurs. L’ensemencement est effectué à raison de 1%
(v/v) à partir de bactéries issues d’une pré-culture d’une nuit. L’incubation est faite à 30°C.
La croissance est estimée par mesure de la densité optique à 600 nm sur des
prélèvements effectués toutes les deux heures.

2.10 Test de survie au stress salin

• Préparation des cellules en phase exponentielle :


Afin de tester la survie des souches au stress salin intense et sub-optimal de courte
durée, des cellules en croissance exponentielle provenant de 10ml de M17 sont diluées à
DO=0,08 et cultivées dans 1,5ml de milieu M17 en absence de sel pendant 1h30, récupérées
par centrifugation (3min à 8000 g/min).

• Choc létal :
Les culots cellulaires sont repris dans 1ml de milieu M17 additionné de la CMI de NaCl
de chaque souche.
La viabilité est mesurée par étalement sur boites de milieu M17, immédiatement (T0) et
30min après le transfert dans le milieu salin (T30) (Eng Mong Lim et al., 2001).

  34
2. Matériel & méthodes
 

• Choc adaptatif :
Les mêmes étapes du choc létal sont reprises, mais cette fois-ci le test est réalisé avec des
cellules en phase de croissance exponentielle adaptées à 0.7M NaCl pour la souche CHM7 et
à 1.2M de NaCl pour les souches OV5 et CHM6, puis repris dans 1ml de milieu M17
additionné de la CMI de NaCl de chaque souche.

Le taux de survie est égal au nombre d’unités formant des colonies (UFC) à T30 rapporté
au nombre d’UFC à T0. (Marceau et al., 2003. O’Sullivan et Condon, 1997, Eng Mong Lim
et al, 2001). Pour cela un dénombrement des cellules viables a été réalisé sur gélose M17.

Le facteur de tolérance induit par l’adaptation est déduit en calculant le rapport du taux de
survie des cellules adaptées (choc adaptatif) / cellules non adaptées (choc létal) (Flahauta et
al., 1996).

2.11 Activité protéolytique des souches

Ce test a été réalisé avec cinq souches sélectionnées (LCL, CHM7, OV5, CHM6, V13-
1). Cette activité est recherchée sur milieu solide M17 tamponné à pH=7 à l’aide d’un tampon
phosphate (KH2PO4/NaHPO4) 0,01M, additionné de 1% de lait écrémé stérile reconstitué à
10% selon la méthode décrite par Van den Berg et al. (1993) adaptée au laboratoire
(Hassaine et Beloufa, 1998 ; Zadi-Karam, 1998) et aussi en présence et en absence de
NaCl.
Le milieu est ensemencé par touche avec des cultures jeunes (18h) après incubation à
30°C pendant 48h l’activité protéolytique est révélée par l’apparition d’un halo clair autour de
chaque touche déposée, la dimension de cet halo est mesurée. Les résultats sont exprimés par
le rapport « diamètre du halo clair/diamètre de la colonie ».

2.12 Cinétique d’acidification et production d’acide lactique

Les cinétiques d’acidification du milieu de culture M17 en présence de différentes


concentrations en NaCl ainsi qu’en présence des osmoprotecteurs, glycine betaine ou proline ,
sont estimées par pH-métrie et la production d’acide lactique est estimée par titration à la
soude sur des prélèvements effectués toutes les deux heures.

  35
2. Matériel & méthodes
 
A partir de chaque flacon nous avons prélevé 30ml du milieu que l’on réparti après
homogénéisation dans trois béchers à raison de 10ml chacun (3 essais par mesure). Sous
agitation et en mesurant le pH on ajoute goutte à goutte de la soude Dornic (N/9) jusqu'à ce
que le pH initial soit atteint.
Le volume de soude est relevé puis les résultats sont exprimés en degrés Dornic selon
la loi suivante : acidité (D°)= n x 10 (Accolas et al., 1977)
Avec : n= volume moyen (trois tests) de soude ajoutée jusqu'à l’atteinte du pH initial,
1°D= 0,1g/l d’acide lactique

2.13 Techniques relatives à l’étude des protéines


2.13.1 Analyse des protéines totales par électrophorèse SDS-PAGE :
2.13.1.1 Préparation des échantillons bactériens

Des cultures bactériennes sont réalisées dans 10 ml de milieu de culture M17 à


différentes concentrations de NaCl et en présence de proline ou de glycine betaine.
Les cultures sont arrêtées après 24h et 48h d’incubation à 30°C. Les cellules sont récoltées par
centrifugation (6000g/10min), les culots sont resuspendus dans de l'eau distillée. Une dernière
centrifugation est effectuée afin de récolter les cellules

2.13.1.2 Lyse cellulaire

Afin d’optimiser une technique de lyse cellulaire qui permettra de casser (lyser) les
cellules bactériennes nous avons procédé de différentes manières :

a) Lyse par fragilisation thermique :


Les culots sont resuspendus dans 150µl d’eau distillée ou de tampon phosphate
(KH2PO4/NaHPO4) 0,01M, pH=7 et subissent une alternance de 15 cycles de « congélation
(1h) - décongélation (30min) ».
Les préparations sont bien homogénéisées après chaque cycle de décongélation.
Après la fin des cycles de lyse, les surnageants sont récupérés après une centrifugation
(10000g/15min).

  36
2. Matériel & méthodes
 
b) Lyse par des microbilles en verres :
Les cellules sont resuspendues dans de l’eau physiologique puis 250µl de suspension
bactérienne sont additionnés à 150µl de tampon d’échantillon – voir composition en annexe.
Le broyage est réalisé au fond d’un tube Eppendorf à l’aide de 100mg de billes de verre (425-
600µm Sigma Aldrich Membrane PVDF Hybond Bio-rad) sous agitation à l’aide du vortex
pendant 3x3min, avec un temps de repos dans la glace après chaque cycle.
On centrifuge le broyat pendant 15min à 10000g ; les surnageants protéiques sont récupérés
(Redon, 2005).

c) Lyse dans un tampon échantillon


Le culot cellulaire d’une culture en phase exponentielle est repris dans 250µl de tampon
d’échantillon (voir Annexe) dans des tubes Eppendorf. Les cellules sont cassées (lysées) par
ébullition à 100°C pendant 10min. Après centrifugation du lysat les surnageants protéiques
sont récupérés.

2.13.1.3 Dosage des protéines

Les concentrations en protéines dans les extraits cellulaires sont déterminées par un
dosage de Bradford (1976) ; une gamme étalon est établie avec une solution d’albumine
bovine ou BSA (1mg/ml) préparée dans de l’eau distillée.
Une série de six tubes en triples exemplaires est préparée comme présenté dans le tableau 3 :

Tableau 3 : Gamme étalon pour le dosage des protéines

Tubes 1 2 3 4 5 6
Solution de BSA (µl) 0 10 20 30 40 50
Eau distillée (µl) 50 40 30 20 10 0
Réactif de Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2

Après homogénéisation, les tubes sont incubés à l’obscurité à température ambiante pendant
deux minutes. La lecture de l’absorbance est ensuite effectuée à 595 nm.

  37
2. Matériel & méthodes
 
Les résultats permettent d’établir une courbe étalon (densité optique en fonction de la
concentration protéique).
On détermine graphiquement la concentration des protéines de l’échantillon à l’aide de la
courbe étalon par extrapolation.

2.13.2 Electrophorèse des protéines

L’électrophorèse en gel est utilisée pour séparer les macromolécules biologiques en


fonction de leur taille et de leur charge électrique. Le gel est constitué d'une matrice de
polymère baignant dans un tampon conducteur.
L’électrophorèse des protéines est réalisée en condition dénaturantes sur gel de
polyacrylamide et en présence d’un détergent anionique, le dodécylsulfate de sodium (SDS),
qui donnera une charge négative globale aux protéines et les sépare en sous unités.
Dans de telles conditions les protéines migrent sous l’effet d’un champ électrique
continu et sont séparés dans le gel essentiellement en fonction de leur poids moléculaire
(Laemmli, 1970).

2.13.2.1 Protocole de l’électrophorèse des protéines

Le gel de polyacrylamide (gel de séparation de 11% et gel de concentration à 5%), en


présence de 10% de SDS est préparé selon la méthode décrite par Laemmli (1970).

• Préparation du gel polyacrylamide


Nous avons utilisé des gels plats de 18x24 cm et de 1.5cm d’épaisseur. ils sont composés
d’un gel de concentration à 5% d’acrylamide, se trouvant dans la partie supérieure et qui
permet de concentrer les protéines, et d’un gel de séparation à 11% qui permet de séparer les
protéines selon leur poids moléculaire et dont la concentration en acrylamide peut être
modifiée selon la taille des protéines à séparer.
Après avoir assemblé les plaques de verre on prépare la solution du gel de séparation, on
homogénéise puis on la verse à l’aide d’une pipette entre les deux plaques il faut veiller à
laisser de l’espace pour couler le gel de concentration. On recouvre le gel de quelques gouttes
d’eau distillée.

  38
2. Matériel & méthodes
 
Dés la polymérisation complète du gel, on élimine l’eau distillée et on place le peigne
afin de créer des poches puis on prépare le deuxième gel « gel de concentration » qu’on verse
par la suite au dessus du gel inferieur.
Après la polymérisation du gel de séparation, on enlève le peigne, les cuves inférieure et
supérieure sont remplies de tampon de migration (voir composition en annexe).
Le gel est prêt pour la séparation des protéines.

• Dépôt des échantillons


15 µg de protéine sont prélevés de chaque échantillon est additionnée de 1/5 (v/v) de
tampon d’échantillon voir composition –annexe- puis chauffée à 100°C pendant 2min avant
d’être déposés au niveau des puits.

• Migration
La migration est réalisée en appliquant un courant continu de 50mA jusqu'à ce que le bleu
de bromophénol atteigne le bas du gel de séparation.

• Révélation
Après démoulage, le gel de concentration est éliminé et le gel de concentration est coloré
pendant une heure dans une solution de bleu de Coomasie R250 (Merck) 0.5% (voir
composition en annexe).
La décoloration est réalisée par trempage du gel dans une solution de décoloration (voir
composition en annexe).

2. 14 Analyse du contenu cellulaire des souches par chromatographie sur papier

Le but de cette technique est de mettre en évidence l’accumulation de proline et de


glycine betaine à l’intérieur des cellules cultivées en milieu hypersalé.
Les chromatographies sont réalisées sur papier Whatman N°1 (Chromatography Paper
« 1CHR », 20x20, CAT N°3001-861 WHATMAN).

2.14.1 Principe :

La chromatographie sur papier est une méthode de séparation dont le principe repose
surtout sur des phénomènes de partage. La phase mobile est le plus souvent un solvant

  39
2. Matériel & méthodes
 
organique et l'eau; la phase stationnaire est constituée par l'eau elle même, adsorbée par la
cellulose du papier ou liée chimiquement à elle. Comme en chromatographie sur couche
mince, l'échantillon, mis en solution, est déposé en un point repère du papier et le solvant qui
se déplace par capillarité fait migrer les composants de l'échantillon à des vitesses variables
selon leur solubilité. Généralement, les composés les plus solubles dans l'eau ou ceux qui
forment facilement des associations par liaisons hydrogène sont fortement retenus par la
phase stationnaire et migrent donc lentement.
Lorsque l'eau est un des solvants de la phase mobile, le ou les solvants organiques doivent y
être assez solubles. C'est pourquoi, des produits comme l'acide éthanoïque, le propanol, le
phénol, ou la pyridine sont les solvants les plus fréquemment mélangés avec l'eau pour
développer un chromatogramme.

2.14.2 Systèmes de solvants de migration


Les systèmes de migrations utilisés lors de ce travail sont :
¾ Butanol / Acide acétique / Eau (80:20:20).
¾ Ethanol / Acide acétique / Eau (4 :1:1).
¾ Ethanol / Acide acétique / Eau (60:20:20).

2.14.3 Dépôt des échantillons


3 µl de chaque échantillon ont été déposés sur une plaque, espacés d’une distance de
1cm.
Les échantillons analysés sont : le milieu M17 stérile, peptone, extrait de levure,
solution de proline, solution de glycine, solution de glycine betaine, contenu cellulaire de la
souche CHM6 : 0.42M, 0.77M, 1.45M, 1.65M et 1.7M (0M ; 1.1M ; 1.3M ; 1.65M +Proline ;
1.65M + Glycine Betaine), les pourcentages représentent les concentrations en NaCl dans le
milieu M17.

2.14.4 Conduite de la chromatographie


On dépose 3µl de chaque échantillon, en séchant immédiatement après chaque dépôt à
l’aide d’un sèche-cheveux, puis on fait glisser la feuille de chromatographie dans une cuve
saturée par le solvant de migration.
On laisse la phase mobile migrer jusqu’au front, on retire la plaque de la cuve, on fait
sécher a l’air chaud puis on vaporise par une solution de ninhydrine 2% (2mg/100ml solvant
éthanol-acide acétique (4:1).

  40
2. Matériel & méthodes
 
La feuille est mise à 60°C dans une étuve pendant 10min ; ceci permet l’apparition des
taches sur le chromatogramme révélant la présence des acides aminés.
On mesure les distances h de migration des différentes taches puis on calcule les
rapports frontaux grâce à la relation Rf = h / H, où H est la distance de migration du solvant.

  41
 

 
3. Résultats et discussions
 

3.1 Caractérisation des souches et confirmation de leur appartenance au groupe lactique


Les résultats des tests réalisés nous ont permis de confirmer l’appartenance des souches
étudiées au groupe lactique.

• Observation macroscopique
En milieu solide, les souches forment de petites colonies blanchâtres, rondes à contour
régulier, lisses et légèrement bombées (Figure 7).

CHM7 V13-1
Figure 7. Aspect macroscopique des cultures en milieu solide

On remarque aussi que sur milieu M17 solide les colonies de certaines souches sont plus
grandes que d’autres.

• Examen microscopique
Sous microscope, les cellules se présentent sous forme de coques isolés ou regroupés en
paires ou en petites chainettes, colorés positivement à la coloration de Gram (Figure 8). On
observe une différence de taille des cellules selon leurs origines : ainsi les cellules de CHT2 et
celles des souches isolées de Ghars sont plus grandes que celles de LCL, des CHM et des
souches isolées de viande bovine fraiche.

  42
3. Résultats et discussions
 

LCL  CHM6 

Figure 8. Aspect des cellules de LCL et CHM6 (G : 10x100)


• Test de la catalase
Les souches étudiées sont toutes dépourvues d’activité catalasique
Les résultats obtenus confirment la pureté et l’appartenance des souches au groupe lactique.

3.2 Croissance des bactéries en présence de 1.1M de NaCl


La mise en culture des souches en présence de 1.1M NaCl nous a permis de voir leurs
aptitudes à croitre en présence de cette concentration. Les résultats obtenus montrent la
présence de deux groupes de bactéries :
• Un premier groupe de bactéries dont la croissance est inhibée par cette concentration
de NaCl
• Un second groupe de bactéries qui résistent à cette concentration de NaCl.

La spécificité de ce deuxième groupe de bactéries est leur capacité de croitre en présence


d’une telle concentration de sel. Des résultats similaires ont été observés par Saad (1997) ;
Zadi-Karam (1998) ; Tahri (2000) ; Bouras-Boublenza (2003) ; Boumaaza (2003) ; Attou
(2004) ; Dellilache (2005) ; Redjouh et Rebadj (2007) ; Bouanani (2008) et Chikh (2008).

La figure 9 montre l’exemple de CHM6 qui résiste à 1.1M de NaCl alors que V13-1 y est
sensible.

  43
3. Résultats et discussions
 

1 2 3 4 5

Figure 9. Croissance bactérienne en présence de 1.1M de NaCl


1 et 4 : milieu M17 sans NaCl ensemencé avec V13-1 ou CHM6
3: milieu M17 non ensemencé
2 et 5 : milieu M17 additionné de 1,1M de NaCl ensemencé avec V13-1 ou CHM6

La figure 10 et le tableau 3 regroupent les résultats obtenus pour toutes les autres souches.

Figure 10. Répartition des souches selon leur comportement en présence de 1.1M de NaCl

  44
3. Résultats et discussions
 

Tableau 3. Croissance des bactéries en présence de NaCl


Croissance en présence de 1.1M de Croissance en présence de 1.1M
Souches NaCl Souches de NaCl

Croissance Densité optique à Croissance Densité optique à


600nm 600nm
V1 + 0.83 GHB13 + 0.48
V2 - / GHB14 + 1.23
V3 - / GHB15 + 0.98
V5 - / GHB16 + 1.46
V6-1 - / GHB17 + 1.3
V6-2 - / GHB18 + 1.41
V13-1 - / GHB22 + 0.71
V15 - / GHB24 + 1.31
V17 - / GHB25 + 1.31
V19 - / CHM1 + 0.57
V24 + 0.85 CHM2 + 1.4
V26-1 - / CHM3 + 0.8
V26-2 - / CHM4 + 1.23
V30-1 - / CHM6 + 1.32
V38 - / CHM7 - /
GHB1 + 1.43 LV4 + 0.55
GHB2 + 0.56 LV6 + 0.87
GHB3 + 1.31 LV10 + 0.97
GHB4 + 0.31 LV12 + 0.39
GHB5 + 1.51 CHT2 + 1.27
GHB6 + 1.45 CHT4 + 1.16
GHB7 + 0.73 LVK21 + 1.21
GHB8 + 0.87 LVK25 + 1.19
GHB9 + 1.4 LCL - /
GHB10 + 1.19 OV5 + 0.88
GHB11 + 1.27 BO1 + 0.91
GHB12 + 1.40 F4 + 1.04

+ : croissance - : pas de croissance

3.3 Croissance des souches à différentes concentrations en NaCl


Nous avons réalisé des tests de croissance des souches en absence ainsi qu’en présence
de NaCl à différentes concentrations (0.42M, 0.77M, 1.1M, 1.3M, 1.45M, 1.65M et 1.7M).
Après incubation à 30°C pendant 72h, on observe un trouble bactérien pour certaines
concentrations de sel. Cela indique que la croissance est différente d’une souche à une autre,
même si celles-ci proviennent de la même source d’isolement.
La croissance est estimée par mesure de la densité optique à 600nm et ceci permet de relever
la CMI de NaCl, concentration pour laquelle la croissance d’une souche est inhibée. La figure
11 montre la répartition globale des souches en fonction de cette CMI de NaCl.

  45
3. Résultats et discussions
 

Figure 11. Concentration Minimale Inhibitrice de NaCl des souches étudiées.


Chaque portion représente le nombre des souches

Des exemples de résultats sont montrés dans les figures 12 et 13 pour la croissance de V13-1
en milieu solide et pour CHT2 en milieu liquide.

Figure 12. Croissance de V13-1 en présence de différentes concentrations en NaCl


(milieu M17 solide, 48h d’incubation à 30°C).

Figure 13. Croissance de la CHT2 en présence de différentes concentrations en NaCl


(Milieu M17 liquide, 48h d’incubation à 30°C):

  46
3. Résultats et discussions
 

T : tube témoin ; 1 : CHT2 + 0M NaCl ; 2 : CHT2 + 1.1M NaCl ; 3 : CHT2 + 1.3M NaCl ;
4 : CHT2 + 1.42M NaCl ; 5 : CHT2 + 1.7M NaCl.

Les résultats globaux sont rassemblés dans la figure 14.

Figure 14. Evaluation de la croissance bactérienne en fonction de la concentration en sel.

Les résultats obtenus conduisent à noter les observations suivantes :


• Aucune croissance n’est enregistrée à 1.7M NaCl.
• Certaines souches telles que CHT2, CHM6, OV5 et GHB15 sont parfaitement
adaptées aux milieux hyper-salés.
• La CMI de NaCl semble avoir évolué avec le temps : ainsi par exemple pour CHT2
elle est passée de 1.3M comme rapporté par Bouras-Boublenza en 2003 à 1.65M lors
de cette étude ; la même observation a été aussi notée par Radjouh et Rebadj (2007) et
Bouanani (2008).
• La souche témoin LCL est sensible au sel et ne peut croitre à 1.1M de NaCl.

Le nombre de cellules est réduit d’environ 60% à 1.7M de NaCl : ceci est significatif car lors
d’un choc hyper osmotique la cellule à tendance à réduire ses activités métaboliques (Redon,
2005).
L’ensemble de ces observations nous a permis de retenir 6 souches, selon leurs aptitudes à
croitre en milieu salé et aussi selon leurs origines, pour la suite du travail.

3.4 Croissance des souches en présence de la CMI de NaCl et d’osmoprotecteurs

  47
3. Résultats et discussions
 

On a voulu montrer l’effet osmoprotecteur de la proline et de la glycine bétaïne, en


cherchant à lever l’inhibition de croissance exercée par les fortes concentrations de sel.
La figure 15 montre un exemple de résultats obtenus avec CHM6, en absence ou en présence
de NaCl avec ou sans osmoprotecteur.

T : tube témoin,
1: CHM6 + 0M NaCl,
2: CHM6 + 1.1M NaCl,
3: CHM6 + 1.3M NaCl
4: CHM6 + 1.42M NaCl+Proline,
5 : CHM6 + 1.7M NaCl+Glycine Bétaïne

 
Figure 15. Croissance en présence de sel et d’osmoprotecteurs

La figure 16 regroupe les résultats obtenus pour les différentes souches bactériennes en
utilisant la proline ou la glycine bétaine comme osmoprotecteur.

DO 600nm  DO 600nm

Figure 16. Croissance des souches en présence de NaCl et d’osmoprotecteurs.


Nos résultats montrent que les différentes concentrations des deux substances
osmoprotectrices, la proline et la glycine bétaïne, ont un effet osmoprotecteur qui permet aux
souches de croître en présence de la CMI de NaCl.
La concentration optimale de l’osmoprotecteur qui permet la croissance diffère d’une souche
à une autre mais aussi d’un osmoprotecteur à un autre

  48
3. Résultats et discussions
 

Le rôle osmoprotecteur de la proline et de la glycine bétaïne a été rapporté par Britten (1962)
Csonka (1981, 1989) et Glaasker et al (1993).
Bouras-Boublenza (2003) a étudié l’effet protecteur de la glycine bétaïne et la proline chez
certaines souches CHT et a montré que ce sont les osmoprotecteurs les plus efficaces. Ceci a
été confirmé par Tahri (2000) et Delileche (2005). Toutes ces observations sont en accord
avec celles de Romeo et al. (2001) qui ont remarqué que la proline et la glycine bétaïne
assuraient une bonne osmoprotection chez les lactocoques.
Ces observations sont à relier au fait que le lait de chamelle, bien qu’assez salé, abrite des
lactocoques car il contient des quantités importantes (11%) de proline pouvant assurer une
osmprotection (Knoess et al., 1986).

Après avoir déterminé les concentrations optimales de proline et de glycine bétaïne qui
permettent de lever l’inhibition exercée par le sel, nous avons sélectionné six souches (LCL,
CHM7, V13-1, CHM6, OV5 et CHT2) pour lesquelles les concentrations optimales de proline
et de glycine bétaïne sont montrées dans les tableaux 4 et 5 suivants :

Tableau 4 : Croissance en fonction de la concentration de glycine bétaïne


Souche LCL CHM7 V13-1 OV5 CHM6 CHT2
Glycine bétaïne (mM)
20 0 0 0,069 0 0 0
50 0,28 0,792 0,172 0 0,092 0,089
70 0,84 1,32 0,241 0,54 0,34 0,145
90 0,38 1,63 0,31 0,88 0,33 0,924
100 0,22 1,05 0,345 0,34 0,021 1,078

Tableau 5 : Croissance en fonction de la concentration de proline


Souche LCL CHM7 V13-1 OV5 CHM6 CHT2
Proline (mM)
20 0 0 0 0 0,157 0,011
50 0,061 0,15 0,37 0 0,298 0,082
70 0,23 1,08 0,906 0,149 0,098 0,038
90 0,83 0,96 0,71 0,092 0 0,053
100 1,11 0,19 0,042 0,084 0 0,059

  49
3. Résultats et discussions
 

3.5 Cinétique de croissance


Nous avons mesuré la croissance des six souches sélectionnées en présence et en
absence de NaCl , de proline ou de glycine bétaïne par des mesures spectrophotométriques à
600nm, ce qui nous a permis d’évaluer graphiquement les temps de générations et de calculer
le taux de croissance.
La figure 17 montre les courbes de croissance obtenues et le tableau 6 rassemble les
temps de génération et taux de croissance pour chaque souche

  50
3. Résultats et discussions
 

Figure 17. Courbes de croissance des souches en présence de sel et d’osmoprotecteurs.

  51
3. Résultats et discussions
 

Ces résultats nous ont permis de faire les observations suivantes :


• La croissance se déroule selon un schéma classique d’une culture discontinue.
• A des concentrations basses de NaCl, on note une croissance faible au début de la
cinétique (phase de latence) puis elle subit une forte accélération.
• La durée de la phase de latence est proportionnelle à la concentration de NaCl ; plus la
concentration de NaCl augmente dans le milieu M17 plus le temps de temps de latence
est long : ceci représente une phase d’adaptation des cellules aux concentrations de
sel.
• La phase exponentielle démarre rapidement lorsque le milieu ne contient pas ou peu de
sel. On note des temps de générations de 1h, 1.5h, 2h et 2.5h, selon la souche, lorsque
le milieu ne contient pas de sel. Ce temps va augmenter pour atteindre 3.5h pour les
souches LCL et CHT2, 5h pour V13-1 et OV5 et 6h pour les autres souches en
présence de leur CMI de NaCl et d’osmoprotecteurs. La croissance en présence de la
CMI de NaCl et de proline ou de glycine bétaïne est confirmée, ces deux molécules
apportent bien une osmoprotection.
• L’osmoprotecteur le plus efficace pour nos souches est la glycine bétaïne, sauf pour
CHM7 qui présente une meilleure croissance lors de l’utilisation de la proline comme
osmoprotecteur.

Tableau 6 : Temps de génération et taux de croissance des bactéries


Souche LCL CHM7 V13-1
Concentration 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
NaCl
Temps de
1.5 2 2 4.5 3.5 1.5 2.5 4 3 6 2 3 6 6 5
génération (h)
Taux de
0.66 0.5 0.5 0.22 0.28 0.66 0.4 0.25 0.3 0.16 0.5 0.3 0.16 0.16 0.26
croissance (h-1)
1 : 0M , 2 : 0.42M , 3 : 0.77M , 4 : 1.1M+ Proline, 5 :1.1M+Glycine Bétaïne

Souche OV5 CHM6 CHT2


Concentration 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
NaCl
Temps de
1 2 2 6 5 1.5 2 2 4 6 2 2.5 3 4.5 3.5
génération (h)

  52
3. Résultats et discussions
 

Taux de
1 0.5 0.5 0.16 0.2 0.66 0.5 0.5 0.25 0.16 0.5 0.4 0.3 0.22 0.28
croissance (h-1)
1 : 0M , 2 : 1.1M , 3 : 1.3M , 4 : 1.45M+ Proline, 5 :1.45M+Glycine Bétaïne

Ces résultats indiquent que le sel affecte la survie et/ou la croissance des cellules comme cela
a été rapporté (Csonka, 1989 ; Potts, 1994): dans le cas d’un choc hyper-osmotique,
la diminution de l’activité de l’eau du cytoplasme inhibe certaines fonctions cellulaires
comme l’adsorption de nutriments, la réplication de l’ADN et la biosynthèse des
macromolécules.

3.6 Test de survie au stress salin

La tolérance au stress salin des bactéries est évaluée par leur taux de survie à un choc
osmotique.
Le phénomène d’adaptation au stress osmotique a déjà été observé chez plusieurs bactéries.
(Bearson et al., 1997. Eng Mong Lim et al., 2001) ont rapporté qu’une incubation à une
concentration osmotique élevée ou à un pH acide non létal permettait aux cellules de
développer une tolérance à un stress létal.
Nous avons appliqué ce type de test à trois souches en mesurant le taux de survie au
stress osmotique de type létal pendant 30min à (1.1M NaCl pour CHM7 ; 1.45M pour OV5 et
CHM6).

Dans une première étape, les cellules en phase exponentielle étaient cultivées
préalablement en absence de sel avant d’être exposées à un stress osmotique de type létal.
Le taux de survie est calculé pour les trois souches ; il est de 1.65x10-5 pour OV5, de 3x10-4
pour CHM6 et de 1x10-4 pour CHM7.

Dans une seconde étape le même test de survie était effectué mais avec des cellules en
phase exponentielle de croissance adaptées à un stress non létal (exposition pendant 30min à
une concentration en sel de 0.7M pour CHM7 ; 1.3 M pour OV5 et CHM6).
On peut alors remarquer que le taux de survie est supérieur à celui enregistré lors du
premier test. Les taux de survie sont les suivants : 1.55x10-3 pour OV5, 4.5x10-3 pour CHM6,
enfin celui de CHM7 est de 1x10-2.

  53
3. Résultats et discussions
 

Les résultats de ces différents tests sont regroupés dans la figure 18.

 
Figure 18. Test de survie des souches étudiées

On constate donc que les bactéries adaptées sont plus tolérantes au stress osmotique
que les bactéries non adaptées ; la souche CHM7 adaptée devient 100 fois plus tolérante que
lorsqu’on lui applique un stress létal sans adaptation. La même constatation est faite pour les
deux autres souches ; on relève que les souches OV5 et CHM6 sont 94 fois et 15 fois
respectivement plus tolérantes que lorsqu’on les cultive préalablement dans un milieu
contenant une concentration de NaCl non létale.

Ces résultats rejoignent ceux observés par Eng Mong Lim et al (2001) et ceux de
Karam et Zadi-Karam (2005) qui suggèrent fortement que lorsque les bactéries sont
adaptées à des stress non létaux, des synthèses protéiques sont induites et sont responsables
d’une augmentation significative de la tolérance au stress.

3.7 Activité protéolytique des souches cultivées en présence de sel


Nous avons comparé l’activité protéolytique de nos bactéries lactiques en milieu M17
solide à deux valeurs de NaCl (0M et 0.77M) comme décrit dans matériel et méthodes. Les
résultats obtenus sont montrés dans la figure 19 (a, b)

  54
3. Résultats et discussions
 

1 2 
1  2 

5  5

4  3  4 3 

a  b

Figure 19. Activité protéolytique des souches


a : En absence de NaCl ; b : En présence de 0.7M NaCl
1: OV5 ; 2: V13-1 ; 3: CHM7 ; 4: CHM6 ; 5: CHT2

Ces résultats montrent qu’à 0M de NaCl, à l’exception de CHM6, toutes les souches
testées présentent une activité protéolytique se manifestant par un halo clair autour de la
colonie bactérienne. Ce type de résultats a été observé pour d’autres souches de la collection
(Zadi-Karam, 1998 ; Hassaine et Beloufa, 1998 ; Belkheir, 2004 ; Roudj et al., 2009).
On peut donc dire que ces souches disposent de protéases et que l’activité protéolytique varie
d’une souche à une autre.

On estime l’activité protéolytique en faisant le rapport « diamètre du halo de la zone de


protéolyse / diamètre de la colonie », ce qui permet de mettre en évidence une corrélation
entre concentration en NaCl et activité protéolytique.
Les figures 20 et 21 résument les résultats obtenus.

  55
3. Résultats et discussions
 

Figure 20. Protéolyse en absence de sel.

Figure 21. Protéolyse en présence de 0.7M de NaCl.

On peut noter les observations suivantes :


• L’ajout du sel n’a pas affecté l’activité protéolytique des souches CHT2 et V13-1 Le
rapport H/T est resté constant et il est de 1.2 et 1.5 respectivement.
• Le rapport H/T des souches OV5 et CHM7 est plus élevé à 0.77M de sel qu’à 0M et
avec l’ajout du NaCl dans le milieu. La souche CHM6 devient protéolytique alors
qu’elle ne présentait pas cette activité en absence de NaCl ; ceci indique que l’ajout du
sel dans le milieu a un effet stimulant sur l’activité protéolytique des souches.

  56
3. Résultats et discussions
 

Nos observations nous conduisent à suggérer que ces bactéries utilisent les produits de la
protéolyse (dégradation de la caséine) afin de mieux résister au stress exercé par le sel et que
l’activité protéolytique est sous l’influence de la concentration en sel dans le milieu.

3.8 Pouvoir acidifiant des souches en présence et en absence de NaCl


Lors de ce test, le pH est mesuré toutes les deux heures. La figure 22 montre l’évolution du
pH en fonction du temps dans différentes conditions de culture pour la CHM6.

Figure 22 : Evolution du pH dans différents conditions de culture de la CHM6.

Les résultats montrent que lorsque CHM6 est ensemencée dans un milieu qui ne
contient pas de sel, elle est légèrement plus acidifiante que lorsqu’elle est en présence de
NaCl. On note qu’à 8h d’incubation (phase exponentielle), le pH est presque le même en
présence ou en absence de sel et reste compris entre pH 6.4 et pH 6.8.
Le pH continu de baisser tout au long du test, suite à la production d’acide lactique, pour
atteindre pH 3.7 en absence de sel, et pH 4 en présence de la CMI de NaCl et proline.

La production d’acide lactique est associée à la croissance bactérienne et donc la


production d’acide lactique est la plus élevée à 0M de NaCl (figure 23). On note aussi que la
présence de sel entraîne une diminution sensible du pouvoir acidifiant de CHM6, même en
présence d’osmoprotecteur.

  57
3. Résultats et discussions
 

Figure 23. Quantité d’acide lactique produite par CHM6 en fonction de la


concentration de NaCl, avec et sans osmoprotection

3.9 Analyse des protéines totales


Des courbes étalons ont été réalisé à l’aide du sérum albumine bovine selon la
méthode décrite par Bradford (1976) afin d’estimer la quantité de protéines.

Les résultats obtenus pour les échantillons issus de différents traitements de lyse de la souche
CHM6 cultivée en présence ou absence de NaCl avec ou sans osmoprotecteur sont regroupés
dans le tableau 7.

  58
3. Résultats et discussions
 

Tableau 7 : Concentrations en protéine des différents échantillons de la CHM6


Techniques de lyse
Congélation/décongélation Tampon de lyse + Chaleur Tampon de lyse +
Concentration microbilles en verres
NaCl /
DO595nm Concentration DO595nm Concentration DO595nm Concentration
± osmoprotecteur
Protéique Protéique Protéique
µg µg µg
0M 0.2 0.108 0.2857 0.308 0.1467 0.138
1.1M 0.417 0.402 0.4974 0.492 0.4974 0.492
1.3M 0.6934 0.678 0.5912 0.538 0.734 0.738
1.42M+Proline 0.472 0.572 0.3094 0.402 0.5098 0.5
1.42M+G.B 0.558 0.591 0.5098 0.467 0.5009 0.492

On peut déduire à partir de ces résultats que la technique de lyse la plus adéquate pour
casser les cellules de la souche CHM6 est obtenue en utilisant des microbilles en verre, suivie
par celle utilisant la congélation/ décongélation.

Les résultats obtenus par électrophorèse SDS-PAGE des échantillons sont présentés
dans la figure 24.
On note que la synthèse protéique la plus importante est obtenue à 1.3M de NaCl et ceci
quelle que soit la technique de lyse utilisée.

  59
3. Résultats et discussions
 

C/D : congélation- décongélation.

T+C : tampon de lyse+ ébullition à 100°C.

T+MB : tampon de lyse+microbilles.

C/D TP : Congélation-décongélation dans


du tampon phosphate.

 
 
Figure 24. Profils protéiques de lysats obtenus avec différents traitements de lyse de la
souche CHM6 cultivée en absence de sel.
 
La figure 25 présente les profils protéiques obtenus pour la souche CHM6 cultivée à 30°C en
absence ou en présence de NaCl (1.1M, 1.3M, 1.42M+ Proline, 1.42M+Glycine Bétaïne) et à
deux temps d’incubation (18h et 48h).

  60
3. Résultats et discussions
 

   

 
 
Figure 25. Protéines totales de la souche CHM6 cultivées dans différentes conditions
Piste 1 : absence de NaCl     Piste 7 : absence de NaCl  
Piste 2 : 0M  de NaCl  Piste 8 : 1.1M  de NaCl 
Piste 3 : 1.1M  de NaCl                18h d’incubation    Piste 9 : 1.33M de NaCl                          48h d’incubation 
Piste 4 : 1.33M de NaCl                 Piste 10: 1.45M de NaCl+ P 
  Piste 11 : 1.45M de NaCl+ GB 
Piste 5 : 1.45M de NaCl+ P 
Piste 6 : 1.45M de NaCl+ GB   

* : bande protéique apparue * : bande protéique disparue P : protéine

On peut noter les observations suivantes :


• Certaines protéines se caractérisent par des niveaux de migrations similaires en
présence des différentes concentrations de NaCl comme en son absence.
• On constate l’apparition de nouvelles protéines ou la disparition d’autres en présence
de NaCl : on note l’apparition d’au moins 13 bandes (P1 à P13) en présence des
différentes concentrations en NaCl, aux deux temps d’incubation. Le nombre des
protéines apparues (nouvellement synthétisées) est plus important à 18 h d’incubation.
• On note aussi la disparition de quelques bandes qui étaient présentes en absence de
sel ; à chaque fois que la concentration en NaCl augmente on remarque la disparition
d’une ou plusieurs bandes.

  61
3. Résultats et discussions
 

Ceci suggère que des protéines de stress sont synthétisées et que d’autres sont catabolisées ou
inhibées lorsque la souche est soumise à de fortes osmolarités
Plusieurs auteurs ont expliqué que les protéines synthétisées lors d’un choc osmotique sont les
mêmes que celles synthétisées durant un choc thermique (Heat Shock Protein) (Elmanasser,
2006) suggérant que lors d’un choc thermique les bactéries adaptées à ce genre d’agression
développent aussi une tolérance au stress osmotique (protection croisée).

Ces protéines peuvent aussi être synthétisées et utilisées pour la modification de la


composition de la membrane plasmique, siège de la perception des signaux des changements
environnementaux lors d’un stress osmotique, en changeant la fluidité par la modification des
fractions d’acides gras (Guillot et al., 2000), et peuvent avoir un rapport avec l’osmosensing
et/ou les protéines de transport (ABC, aquaporines, canaux méchanosensibles) qui rentrent en
action lors d’un stress pour l’influx et/ou l’efflux de solutés compatibles et de l’eau.

3.10 Analyse du contenu cellulaire par chromatographie de partage


Cette analyse a pour but de rechercher s’il y a accumulation (présence) des deux
substances osmoprotectrices (proline et glycine bétaïne) dans le milieu intracellulaire de la
souche CHM6 soumise à un stress osmotique.
Les résultats de la chromatographie de partage sont illustrés dans la figure 26. Les Rf des trois
osmoprotecteurs testés sont reportés dans le tableau 8.

  62
3. Résultats et discussions
 

 1      2     3      4     5         6      7      8    9     10       

 
Figure 26. Chromatogramme des contenus cellulaires de la souche CHM6 cultivé en absence
et en présence de sel et d’osmoprotecteurs
Piste 1 : absence de NaCl  
Piste 7 : absence de NaCl  
Piste 2 : 1.1M  de NaCl                18h d’incubation                                  
Piste 8 : 1.1M  de NaCl 
Piste 3 : 1.33M de NaCl                
Piste 9 : 1.33M de NaCl                          48h d’incubation 
Piste 4 : 1.45M de NaCl+ P 
Piste 10: 1.45M de NaCl+ P 
Piste 5 : 1.45M de NaCl+ GB 
Piste 11 : 1.45M de NaCl+ GB 
 

Tableau 8 : Rapport frontaux des trois molécules testées


Substance Rf
Glycine 0.32
Proline 0.52
Glycine bétaïne 0.83

Ces résultats permettent de faire les observations suivantes :


Le milieu M17, l’extrait de levure et la peptone ne contiennent pas de proline ni de glycine-
bétaine en quantités détectables par cette méthode (pas de spot jaune ou rose, respectivement).
Il y a une similitude de profil du contenu en absence et en présence de 1.1M de NaCl après 18
heures d’incubation.

  63
3. Résultats et discussions
 

Cette technique nous a permis de montrer l’accumulation de proline et de glycine betaine dans
les cellules bactériennes ; on remarque aussi que l’intensité des spots est fonction du stress
osmotique.

La glycine betaine est d’une grande intensité chez la souche CHM6 cultivée à des
concentrations en NaCl élevées plutôt que dans les cellules cultivées dans un milieu exempte
de NaCl cette intensité est due à l’accumulation de cette substance dans le milieu
intracellulaire dans des conditions d’hyper salinité.

La proline (Rf = 0.52) a été mise en évidence mais son intensité est moindre par rapport a
l’intensité de la glycine bétaïne (Rf = 0.83). La présence de proline à 0M de NaCl est liée au
métabolisme des lactocoques qui sont dotés de peptidases spécifiques des prolines, pour la
libérer des peptides (Monnet, 1993).

  64
 

 
Conclusion
 

L’étude des mécanismes de résistance au sel chez les bactéries lactiques est importante pour
la sélection des ferments lactiques utilisés en milieu salin dans les procédés industriels

Ce travail a permis d’explorer les mécanismes engendrés dans la résistance au sel et d’évaluer
puis comparer cette résistance chez les lactocoques et entérocoques du Laboratoire de
Biologie des Microorganismes et Biotechnologie

En effet après confirmation des caractéristiques des souches utilisées dans ce travail nous
avons noté qu’il existe un groupe de bactéries qui à la faculté de croitre à 1.1M NaCl.

L’étude de la croissance des souches en présence de concentrations croissantes en NaCl a


permis de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) de NaCl de chaque souche,
celle-ci varie d’une souche à une autre et elle atteint 1.65M chez CHT2, aucune croissance
n’est enregistrée à 1.7M.

De plus ce travail permet de confirmer que la résistance au sel est liée à l’accumulation
d’osmoprotecteurs dans le cytoplasme ; les résultats ont montré que la glycine bétaïne et la
proline ont un effet osmoprotecteur efficace sur les souches étudiées. La recherche de la
concentration optimale d’osmoprotecteur a montré que c’est la glycine bétaïne qui permet la
croissance la plus élevée en présence de sel pour toutes les souches, à l’exception de CHM7
pour qui l’osmoprotecteur le plus efficace est la proline.

La comparaison des cinétiques de croissance des bactéries cultivées dans un milieu hyper salé
montre des phases de latence beaucoup plus prononcées, et aussi que les concentrations
élevées en NaCl n’ont aucun effet sur l’activité acidifiante des souches. Si la production de
l’acide lactique est associée à la croissance bactérienne, l’activité protéolytique est stimulée
en présence de NaCl.

Ce travail permet également de confirmer que la tolérance au stress salin, évaluée par le taux
de survie, est plus importante lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu sub-optimal.
Le facteur de tolérance au stress est 100 fois plus élevé dans ces mêmes conditions.

L’analyse comparative du contenu protéique de la souche CHM6 cultivée à 30°C pendant


18H et 48h en milieu M17 en absence et en présence de différentes concentrations de NaCl
montre qu’il existe une relation entre la résistance au sel et la production de nouvelles
protéines induites par de forte concentrations de sel, ces nouvelles protéines semblent être des
SSP (Shock Salt Protein), et sont au nombre d’une dizaine.

Enfin, l’étude par la chromatographie de partage du contenu cellulaire en absence ainsi qu’en
présence de différentes concentrations de sel et à différents temps d’incubation a montré qu’il
y’avait une accumulation des deux substances osmoprotectrices à l’intérieur des cellules
stressées, ceci confirme le rôle osmoprotecteur important que joue la glycine bétaïne et la
proline pour lever l’inhibition de croissance exercée par les fortes concentrations de sel.

Nos résultats montrent qu’il serait intéressant d’approfondir cette étude de la résistance au sel
des bactéries lactiques au vu de leur importance actuelle en industrie agroalimentaire.

65 
 
Conclusion
 

Les prochaine étapes du travail devraient porter sur :

• La purification puis l’identification des protéines synthétisées lors d’un stress


osmotique.

• Une approche transcriptomique qui facilitera l’identification du mécanisme général de


stress qui reste a ce jour méconnu.

• L’étude approfondie de la corrélation entre la résistance au sel et la présence de


plasmide.

• L’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la réponse au stress salin, en


particulier la perception des signaux de stress ainsi que l’activation des différents
systèmes de transport de molécules osmoprotectrices.

66 
 
 

 
ANNEXE
Milieux de culture

• Milieu M17, prêt a l’emploi (Merck)

Peptone de farine de soja 5.0 g

Peptone de viande 2.5 g

Peptone de caséine 2.5 g

Extrait de levure 2.5 g

Extrait de viande 5.0 g

Acide ascorbique 0.5 g

Na-β-glycérophosphate 19.0 g

Sulfate de magnésium 0.25 g

D(+) lactose 0.5 g

Eau distillée qsp 950 ml

pH= 7.2 à 25°C.

stérilisation à 120°C pendant 20min

• Lait écrémé :

Lait écrémé 10 g

Extrait de levure 0.5 g

Eau distillée 100 ml

Le milieu est stérilisé à 110°C pendant 15min


Tampons

• Tampon phosphate (0.01M, pH =7)

Les solutions mères utilisées :

‐ KH2PO4 : le poids moléculaire égal à 27,218 g/l distillée correspond à 0.2M

‐ Na2HPO4, 12H2O : le poids moléculaire égal à 71.63 g/l d’eau distillée correspond à
0.2M

Préparation du tampon :

‐ 1.95 ml de KH2PO4 + 3.05 ml de Na2HPO4, 12H2O + 50 ml d’eau distillée (dilué


jusqu’à 0.01M)

• Tampon de migration ; pH=8.3 .

Tris 3.3 g
SDS 14.4 g
Glycérol 1g
Eau distillée 1000 ml
qsp

• Tampon d’échantillon

Tris 0.15 g
SDS 0.4 g
Glycérol 2g
Bleu de bromophenol 0.01g
Β-mercaptoéthanol 0.05 ml
Eau distillée 100 ml
qsp

• Tampon Tris-EDTA ; pH=7.5

Tris 50Mm
EDTA 5mM

• Tampon TBE ; pH=8

Tris-HCl 0.09mM
EDTA 2.80mM
Acide Borique 0.09mM
• Tampon de charge

Bleu de bromophénol 25%

Glycérol 40%

Réactifs

• Réactif de bradford

Bleu de coomassie G250 (Merck) 10 mg

Acide orthophosphorique 85% 10 mg

Ethanol 95% 5mg

Eau distillée qsp 100 ml

Solutions

• Les solutions utilisées pour SDS-PAGE :

Composition des gels inferieur et supérieur ( Sambrook et al, 1989)

ingrédients Gel inferieur (V ≈30ml) Gel supérieur ( V≈ 6ml)

11% 5%

H2O (ml) 10.90 4.10

Acrylamide Mix 30% (ml) 11.00 1.00

Tris 1.5M pH 8.8 (ml) 7.5 ---

Tris 1.0M pH 6.8 (ml) --- 0.75

SDS 10% (µl) 300 60

Persulfate d’ammonium (µl) 300 60

TEMED (N,N,N-tétraméthyléne 18 60
diamine) solution commerciale
(Kodak) (µl)
‐ Acrylamide Mix 30% : 29% Acrylamide + 1% N,N méthyléne bisacrylamide.

‐ Tris 1.5M : 18.17g de tris dans 100ml d’eau distillée

‐ Tris 1M : 12.11g de tris dans 100ml d’eau distillée

‐ SDS : 1g de SDS dans 100ml d’eau distillée

‐ Persulfate d’ammonium : 100mg de Persulfate d’ammonium dans 1ml d’eau distillée ;


cette solution doit être préparée extemporanément

‐ TEMED (N,N,N-tétraméthyléne diamine) solution commerciale (Kodak)

‐ Solution de coloration

Bleu de Coomassie R250 (Merck) 0.5 g

Méthanol- eau distillée (v/v) 90 ml

Acide acétique 10 ml

‐ Solution de décoloration

Méthanol- eau distillée (v/v) 900 ml

Acide acétique 100 ml

Phases mobiles pour la chromatographie de partage

¾ Système de migration N°1


Butanol 80
Acide acétique 20
Eau 20

¾ Système de migration N°2


Ethanol 4

Acide acétique 1

Eau 1
¾ Système de migration N°3
Ethanol 60

Acide acétique 20

Eau 20
 

 
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RESUME
55 coques lactiques sont mis en présence de concentrations croissantes de sel afin de déterminer la CMI de NaCl pour
chacune des souches, les résultats ont montré qu’il existe des souches dont la croissance est inhibée à 1.1M NaCl,
d’autres qui ont la faculté de croitre au delà de cette concentration et que la CMI varie d’une souche à une autre et
atteint 1.65M pour CHT2 ; aucune croissance n’est enregistrée à 1.7M.
Ceci nous a conduit à étudier l’osmoprotection par ajout de proline ou glycine bétaïne à différentes concentrations au
milieu hyper salé ; les résultats montrent que ces deux substances ont un effet osmoprotecteur efficace sur nos souches
dans ces situations de contraintes hyper-osmotiques.
Nous avons ensuite étudié l’effet du NaCl sur la croissance des bactéries. Les résultats montrent que les phases de
latence sont prolongées en fonction des concentrations de NaCl, et aussi qu’il n’a aucun effet sur l’activité acidifiante
des souches. La production de l’acide lactique est associée à la croissance bactérienne. La présence de NaCl stimule
l’activité protéolytique ; le taux de survie est plus important lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu sub-
optimal ; le facteur de tolérance au stress est 100 fois plus élevé dans ces mêmes conditions.
L’analyse des protéines totales de la souche CHM6 par SDS-PAGE en présence et en absence d’un stress salin montre
l’apparition et/ou la disparition de quelques protéines
L’estimation qualitative de l’accumulation de la proline ainsi que de la glycine bétaïne par chromatographie de partage
montre qu’il y a passage des deux substances du milieu extracellulaire vers l’intérieur des cellules de la CHM6 cultivées
en présence de NaCl.

Mots clés : bactéries lactiques, croissance, NaCl, osmoprotecteurs, acidification, protéolyse, taux de croissance, facteur
de tolérance, SDS-PAGE, chromatographie de partage, stress osmotique.

SUMMARY
The MIC of NaCl of 55 lactic coccis were determined in M17 medium with several salt concentrations, the results
showed that there exist strains whose growth is inhibited by 1.1M of salt while others grew beyond this concentration
and that the MIC varies from a strain to another for example CHT2 was inhibited by 1.65M of NaCl, no growth was
recorded in 1.7M.
This led us to study the osmoprotection by the addition of proline or glycine betain with various concentrations in the
M17 hyper-salted medium, the results showed that these two substances have an osmoprotector effect on our strains in
these situations of hyper-osmotic stress.
Then we studied the effect of salt on the growth of the bacteria, the results reveal that the latency phases are prolonged
according to the NaCl concentrations, also it has no effect on the acidifying activity of the strains, the production of the
lactic acid is associated to the bacterial growth but that it has a capacity to stimulate the proteolytic activity, the survival
rate is more important when the cells are cultivated in an sub-optimal medium and that the tolerance factor to the salt
stress is 100 times higher under these same conditions. The analysis of total proteins contents of CHM6 by SDS-PAGE
in the presence and the absence of salt stress, evidenced by the appearance and/or the disappearance of some proteins
The accumulation of the proline as of the glycine betain by qualitative chromatography reveal that these two substances
are accumulated in the bacterial cells CHM6 cultivated in the presence of salt stress.
Key words : lactic acid bacteria, growth, NaCl, osmoprotectant, acidification, proteolysis, survival rate, tolerance
factor, SDS-PAGE, chromatography of division, osmotical stress

‫اﻟﻤﻠﺨﺺ‬
‫ ﺳﻼﻟﺔ ﻣﻦ ﺑﻜﺘﻴﺮﻳﺎ اﻟﻠﺒﻦ وﺿﻌﺖ ﻓﻲ وﺳﻂ ﻏﺬاﺋﻲ ﻳﺤﺘﻮي ﻋﻠﻰ ﻧﺴﺒﺔ ﻋﺎﻟﻴﺔ ﻣﻦ اﻟﻤﻠﺢ ﺑﺘﺮاآﻴﺰ ﻣﺘﺰاﻳﺪة ﻗﺼﺪ ﺗﺤﺪﻳﺪ اﻟﺘﺮآﻴﺰ اﻟﻤﻠﺤﻲ اﻷدﻧﻰ اﻟﻤﺜﺒﻂ ﻟﻠﻨﻤﻮ‬55
‫ وﺑﺎﻟﺘﺎﻟﻲ‬،‫وﻣﺠﻤﻮﻋﺔ أﺧﺮى ﻟﻬﺎ اﻟﻘﺪرة ﻋﻠﻰ اﻟﻨﻤﻮ ﻋﻨﺪ ﺗﺮاآﻴﺰ ﻋﻠﻴﺎ‬1.1M ‫ اﻟﻨﺘﺎﺋﺞ أﻇﻬﺮت أن ﻣﺠﻤﻮﻋﺔ ﻣﻦ اﻟﺴﻼﻻت ﻻ ﺗﻨﻤﻮ ﻋﻨﺪ‬،‫اﻟﺨﺎص ﺑﻜﻞ ﺳﻼﻟﺔ‬
.‫ اﻟﻤﻠﺢ‬1.7 M‫ ﻟﻢ ﻧﺴﺠﻞ ﻧﻤﻮا ﻋﻨﺪ اﻟﺘﺮآﻴﺰ‬.‫ﻓﺎﻟﺘﺮآﻴﺰ اﻟﻤﻠﺤﻲ اﻟﻤﺜﺒﻂ ﻟﻠﻨﻤﻮ ﻳﺨﺘﻠﻒ ﻣﻦ ﺳﻼﻟﺔ ﻷﺧﺮى‬

‫دراﺳﺔ اﻟﺤﻤﺎﻳﺔ اﻷﺳﻤﻮزﻳﺔ ﻋﻦ ﻃﺮﻳﻖ اﻟﺒﺮوﻟﻴﻦ واﻟﻘﻠﻴﺴﻴﻦ ﺑﻴﺘﻴﻴﻦ ﺑﺘﺮاآﻴﺰ ﻣﺨﺘﻠﻔﺔ ﻓﻲ اﻟﻮﺳﻂ اﻟﻐﺬاﺋﻲ اﻟﻌﺎﻟﻲ اﻟﻤﻠﻮﺣﺔ أﻇﻬﺮت أن ﻟﻠﻤﺎدﺗﺎن ﺗﺄﺛﻴﺮ إﻳﺠﺎﺑﻲ‬
‫ﻓﻌﺎل آﻤﺤﺎﻓﻆ أﺳﻤﻮزي ﻋﻨﺪ اﻟﺴﻼﻻت‬

‫ ﻟﻪ ﺗﺄﺛﻴﺮ إﻳﺠﺎﺑﻲ ﻋﻠﻰ اﻟﺘﺤﻠﻞ‬, ‫ﺗﻢ ﻗﻤﻨﺎ ﺑﺪراﺳﺔ ﺗﺄﺛﻴﺮ اﻟﻤﻠﺢ ﻋﻠﻰ ﻣﺮاﺣﻞ ﻧﻤﻮ اﻟﺒﻜﺘﻴﺮﻳﺎ ﻓﺎﺳﺘﻨﺘﺠﻨﺎ ﺗﺰاﻳﺪ ﻓﻲ ﻣﺪة ﻣﺮﺣﻠﺔ اﻟﺘﺄﻗﻠﻢ ﻋﺪم ﺗﺎﺗﺮاﻟﻤﻔﻌﻮل أﻟﺘﺤﻤﻴﻀﻲ‬
.‫أﻟﺒﺮوﺗﻴﻨﻲ‬

‫( ﺑﻮاﺳﻄﺔ اﻟﺮﺣﻼن اﻟﻜﻬﺮﺑﺎﺋﻲ ﻓﻲ وﺟﻮد أو ﻋﺪم وﺟﻮد ﺗﻮﺗﺮ ﻣﻠﺤﻲ ﺑﻴﻦ ﻇﻬﻮر أو واﺧﺘﻔﺎء ﺑﻌﺾ‬CHM6) ‫إن ﻓﺤﺺ اﻟﺒﺮوﺗﻴﻨﺎت اﻟﺨﻠﻮﻳﺔ ﻟﻠﺴﻼﻟﺔ‬
.‫اﻟﺒﺮوﺗﻴﻨﺎت‬

‫اﻟﺘﻘﻴﻴﻢ اﻟﻨﻮﻋﻲ ﻟﺘﺮاآﻢ اﻟﺒﺮوﻟﻴﻦ واﻟﻐﻠﺴﻴﻦ ﺑﻴﺘﺎﺑﻴﻦ ﻋﻦ ﻃﺮﻳﻖ اﻟﻜﺮوﻣﺎﺗﻮﻏﺮاﻓﻴﺎ ﻋﻠﻰ اﻟﻮرق ﺑﻴﻦ أﻧﻪ ﻳﻮﺟﺪ اﻧﺘﻘﺎل ﻟﻠﻤﺎدﺗﻴﻦ ﻣﻦ اﻟﻮﺳﻂ اﻟﺨﺎرج ﺧﻠﻮي إﻟﻰ‬
.‫ ﻓﻲ ﺷﺮوط اﻟﺘﻮﺗﺮ اﻟﻤﻠﺤﻲ‬CHM6 ‫داﺧﻞ ﺧﻼﻳﺎ اﻟﺴﻼﻟﺔ‬

: ‫اﻟﻜﻠﻤـــــﺎت اﻟﻤﻔﺘﺎﺣﻴﺔ‬

-‫ آﺮوﻣﺎﺗﻮﻏﺮاﻓﻴﺎ ﻋﻠﻰ اﻟﻮرق – ﺗﻮﺗﺮ ﻣﻠﺤﻲ‬-‫ ﻋﺎﻣﻞ اﻟﺘﻘﺒﻞ‬-‫ ﻧﺴﺒﺔ اﻟﻨﻤﻮ‬-‫ اﻟﺘﺤﻠﻞ اﻟﺒﺮوﺗﻴﻨﻲ‬-‫ اﻟﺘﺤﻤﻴﺾ‬-‫ – ﺣﻤﺎﻳﺔ اﺳﻤﻮزﻳﺔ‬NaCl - ‫اﻟﺒﻴﻜﺘﻴﺮﻳﺎ اﻟﺒﻨﻴﺔ –اﻟﻨﻤﻮ‬
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