PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAÍSO

FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

Laboratorio de Biorreactores
IEB 448

INFORME TÉCNICO 2
LABORATORIO DE BIORREACTORES
(PARTE ENZIMAS)

Autores:
Germán Guajardo
Mauricio Núñez
Aníbal Rojo
Bastián Cortés
Vaitiare Cornejo
Profesora:
Zaida Cabrera

31 de Mayo, 2019
INDICE

I. RESULTADOS Y DISCUSIÓN:......................................................................................................... 3

1.1. DIAGRAMA DEL REACTOR: ................................................................................................. 3

1.2. PRUEBAS DE CONTROL DE pH: ........................................................................................... 4

1.3. CALIBRACIÓN DE LA BOMBA PERISTÁLTICA: ..................................................................... 4

1.4. COMPORTAMIENTO DEL REACTOR CON ENZIMA SOLUBLE: ............................................ 6

1.5. COMPORTAMIENTO DEL REACTOR CON ENZIMA INMOVILIZADA: .................................. 7

1.6. VELOCIDAD MÁXIMA DE REACCIÓN: ................................................................................ 8

II. CONCLUSIÓN ............................................................................................................................... 9

ANEXO ............................................................................................................................................... 11

ANEXO A: PRUEBAS DE PH. .......................................................................................................... 11

ANEXO B: CURVA BOMBA PERISTÁLTICA. ................................................................................... 11

 I. RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

1.1. DIAGRAMA DEL REACTOR:

Figura 1: Diagrama del reactor y accesorios (Temperatura y pH).

Este diagrama es realizado en base al práctico 1 que contempla la auto-regulación del pH por
medio del controlador que a su vez indica a las bombas peristálticas que solución se debe añadir
(ácido o base) para estabilizar el pH indicado en el set-point del controlador y sus tiempos para
llegar a la estabilidad. Las líneas finas corresponden a mangueras mientras que las líneas gruesas
hacen referencia a los conectores del controlador con las bombas y el electrodo de pH.

Para fines del práctico 2 y 3 no se utilizaron las bombas peristálticas ni el controlador debido a que
el pH fue controlado por un tampón de pH 6.
1.2. PRUEBAS DE CONTROL DE pH:

Se registró la evolución del pH al interior del reactor al inyectarle HCl y NaOH, los cuales se
muestran en la figura 2, elaboradas a partir de la Tabla A.1 (ANEXO A):

Control de pH
4,65

4,6
pH

4,55

4,5
HCL
4,45 NAOH

4,4

4,35
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Tiempo (s)

Figura 2: Pruebas control de pH (inyección de HCl).

Se puede observar como el HCl genera una mayor variación del pH que el NaOH en el mismo
periodo de tiempo. No se pudo realizar un mayor seguimiento de la evolución del pH al
inyectar HCl al medio.

1.3. CALIBRACIÓN DE LA BOMBA PERISTÁLTICA:

En la figura 3, confeccionada con los datos presentes en la Tabla B.1 (ANEXO B), se puede
observar el caudal que transporta la bomba peristáltica al aplicar distintas RPM.
 Figura 3: Curva de calibración de la bomba peristáltica.

Curva de la bomba (LongerPump BT100-2J)

200
y = 1,7873x + 2,504
180
R² = 0,9974
160
Caudal (mL/min)

140
120 y = 0,9497x + 0,1053
R² = 0,9985 16#
100
80 25#
60 Lineal (16#)
40 Lineal (25#)
20
0
0 20 40 60 80 100 120
Velocidad (RPM)

La bomba peristáltica es un tipo de bomba de desplazamiento positivo, es decir, tiene una

parte de succión y otra de expulsión, por lo que es utilizada para bombear una gran variedad
de fluidos. (Veintimilla & Ramiro, 2015)

En este practico se utilizó la una bomba peristáltica para laboratorio marca Longer Pump
modelo BT100-2J con un cabezal YZ2515X la cual es adecuada para dos tamaños de manguera
de silicona 15# y 24#, con un grosor de pared de 2,4 mm (Halma Company, 2015), en este
practico se utilizaron mangueras de 16# y 25#, así que al realizar una comparación con la curva
del fabricante no se pudo realizar una comparación tan efectiva debido a la diferencias de las
mangueras, pero lo que si se pudo observar es que a mayor diámetro mayor caudal y que
nuestra manguera de 25# podría presentar alguna incrustación o desgaste del material debido
a que marca un menor valor de caudal que el entregado por el fabricante al hacer una
comparación con la manguera 15# ya que presentan el mismo diámetro interno.
1.4. COMPORTAMIENTO DEL REACTOR CON ENZIMA SOLUBLE:

En la figura 4, confeccionada con los datos presentes en la Tabla C.1 (ANEXO C), se puede
observar la conversión de lactosa presente en el medio de reacción a través del avance de la
experiencia, usando como catalizador enzima disuelta.

Figura 4: Comportamiento del reactor experimental y teórica con una enzima soluble.

Conversión del sustrato (Enzima soluble)

1,20

1,00

0,80
Conversion

0,60
Exp
0,40 Teo

0,20

0,00
0 50 100 150
Tiempo (min)

Como se observa en la Figura 5, hay una generación bastante grande de glucosa en los
primeros 20 minutos de funcionamiento del reactor valor que luego decae al minuto 30, en
donde este comenzó a subir nuevamente. Esta caída puede deberse a diversos factores como
una breve inactivación de la enzima por acción del mismo producto. Al estar disuelta la enzima
esta presenta una generación de glucosa considerable respecto a la formación de glucosa en la
enzima inmovilizada con una conversión del 71% a los 140 [min].

Para la determinación de la velocidad de reacción, se utilizaron los datos presentes en la tabla

B.2 (ANEXO B), utilizando los datos presentes en el rango lineal (entre 0 y 20 minutos).
 1.5. COMPORTAMIENTO DEL REACTOR CON ENZIMA INMOVILIZADA:

En la figura 5, confeccionada con los datos presentes en la Tabla C.2 (ANEXO C), se puede
observar la conversión de lactosa presente en el medio de reacción a través del avance de la
experiencia, usando como catalizador enzima inmovilizada.

Figura 5: Comportamiento del reactor experimental y teórico con una enzima inmovilizada.

Conversión (Enzima inmovilizada)

1,20

1,00

0,80
Conversion

0,60
exp
0,40 teo
0,20

0,00
0 50 100 150
Tiempo (min)

La velocidad de reacción máxima para la enzima inmovilizada (experimental y teórica) a 40°C, se

muestra en la Tabla 1. Durante la experiencia se pudo visualizar que el comportamiento del
reactor con enzima inmovilizada en un soporte de Agarosa 6 BCL funciono de manera eficiente
pudiendo visualizar en la Figura 5 que a medida que pasaba el tiempo la concentración de
producto (glucosa) iba en aumento exponencial hasta el tiempo entre 60 – 80 [min] luego de esto,
se apreció una estabilidad de producto indicando que la enzima – soporte catalizó mayor parte del
sustrato ocurriendo una conversión a los 140 [min] de 52%. Debido a las características que posee
la inmovilización, la gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir
distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte,
existiendo perdida de actividad durante la inmovilización (Arroyo, 1998) lo que afectó
directamente a la conversión de sustrato a producto durante la experiencia.
Como podemos observar en la figura 5, la conversión de lactosa es baja respecto al valor teórico
podemos concluir en base a lo que dice Armisen (1997), quien afirma que “el hecho de que la
morfología interna del soporte sea de superficie plana, puede tener desventajas cuando la
proteína debe actuar frente a un sustrato o un ligando macromolecular. En este caso el acceso del
ligando puede verse impedido o al menos dificultado por el impedimento estérico del soporte”.
Por impedimento estérico se entiende como una propiedad estructural de la molécula que impide
o retarda la reacción con otra molécula. En base a esto podemos concluir que la enzima tuvo
dificultades para unirse al sustrato y que por esto la generación de glucosa experimental no fue
tan rápida como en el caso de su homologo teórico.

Teóricamente la conversión de la hidrolisis de lactosa a glucosa para enzima y el biocatalizador es

de un 99% siendo para el primero de ellos a los 98 [min] mientras que el segundo llega a la
conversión casi total a los 78 [min] evidenciando que al utilizar la enzima inmovilizada se llega a un
mejor resultado.

Para la determinación de la velocidad de reacción, se utilizaron los datos presentes en la Tabla C.2
(ANEXO C), utilizando los datos presentes en el rango lineal (entre 0 y 10 minutos).

1.6. VELOCIDAD MÁXIMA DE REACCIÓN:

Haciendo uso de la enzima B-galactosidasa extraída de la cepa Bacillus Circulans como enzima
soluble y la enzima B-galactosidasa unida covalentemente a un soporte de Glioxil-agarosa como
enzima inmovilizada, se obtuvieron las siguientes velocidades máximas de reacción (ANEXO E):

Velocidad máxima de hidrolisis de lactosa a 40°C

Enzima soluble Enzima inmovilizada
Vmáx Vmáx Vmáx Vmáx
Experimental Teórica Experimental Teórica
[UI] [UI] [UI] [UI]
7072,92 3773,4 9242,4 5991,9

Tabla 1: Velocidad máxima de reacción experimental y teórica de la hidrolisis enzimática de lactosa

a 40°C, pH 6.
 II. CONCLUSIÓN

Respecto a lo realizado en las experiencias 2 y 3, podemos darnos cuenta de que la conversión de

lactosa en glucosa en el caso de la enzima disuelta, alrededor de un 76%, es mayor que la de la
enzima inmovilizada que resultó ser de un 52%, posiblemente debido a lo que se comentó durante
la discusión respecto al impedimento estérico en el caso de la enzima inmovilizada. Sin embargo,
la velocidad máxima de reacción que resultó ser mayor fue la de la enzima inmovilizada, por lo que
en caso de que se necesite que la reacción ocurra en un corto periodo de tiempo, sin importar un
mayor grado de conversión del producto, la enzima inmovilizada es la opción más viable.

Como se sabe, la enzima disuelta se pierde ya que no hay una manera de recuperarla debido a su
tamaño, por lo que a escala industrial es necesario valorar el uso de una enzima inmovilizada
debido a la posibilidad que se tiene de recuperar esta, permitiendo abaratar costos, ya que
aunque la conversión de la enzima disuelta sea mayor que la de la inmovilizada esta presenta una
serie de ventajas como por ejemplo la estabilidad que le brinda el soporte, que en caso de que
algunas variables operacionales fallen, esta enzima no se desnaturalizaría con tanta facilidad como
la disuelta y además de que el catalizador se puede recuperar.
III. REFERENCIAS

 Arroyo, D. M. (1998). Inmovilización de enzimas. Fundamentos, médotos y aplicaciones.

Universidad Complutense de Madrid, (pág. 17). Madrid.

 Armisen M. (1997). Nuevos métodos de caracterización y activación de geles de agarosa

como soportes para la inmovilización de proteínas de interés industrial (tesis doctoral).
Universidad Complutense de Madrid, (pág. 148). Madrid, España.
 Halma Company. (19 de 12 de 2015). Longer. Obtenido de https://www.longerpump.com
 Veintimilla, R., & Ramiro, G. (2015). Diseño y construcción de una bomba peristáltica. Loja,
Ecuador.
ANEXO

ANEXO A: PRUEBAS DE PH.

HCl NaOH

Tiempo (s) pH pH Duplicado Promedio pH pH pH duplicado Promedio pH

0 5,41 4,62 5,015 4,38 4,39 4,385

10 4,6 4,61 4,605 4,41 4,4 4,405
20 4,58 4,62 4,6 4,4 4,39 4,395
30 4,57 4,62 4,595 4,4 4,39 4,395
40 4,58 4,59 4,585 4,4 4,42 4,41
50 4,55 4,58 4,565 4,4 4,42 4,41
60 4,54 4,59 4,565 4,4 4,42 4,41
70 4,53 4,56 4,545 4,4 4,42 4,41
80 4,53 4,54 4,535 4,43 4,42 4,425
90 4,53 4,56 4,545 4,43 4,45 4,44
100 4,5 4,54 4,52 4,43 4,45 4,44
110 - - - 4,43 4,45 4,44
120 - - - 4,43 4,45 4,44
130 - - - 4,43 4,45 4,44
140 - - - 4,43 4,48 4,455
150 - - - 4,46 4,48 4,47
160 - - - 4,5 4,48 4,49
170 - - - 4,49 4,51 4,5
Tabla A.1: Variones de pH con inyección de HCl y NaOH.

ANEXO B: CURVA BOMBA PERISTÁLTICA.

dt1 (s) dt2 (s) Promedio dt (s) Volumen (L) Q 16# (mL/min) Q 25# (mL/min) RPM
72,1 62,4 67,25 20 9,52 17,84 10
32 32,65 32,33 20 19,68 37,12 20
20,67 21,26 20,97 20 27,68 57,24 30
15,96 16,2 16,08 20 37,98 74,63 40
13,49 12,59 13,04 20 46,79 92,02 50
10 10,77 10,39 20 57,46 115,55 60
9,36 9,82 9,59 20 68,02 125,13 70
 8 8,17 8,09 20 75,95 148,42 80
7,21 7,67 7,44 20 87,27 161,29 90
6,55 6,87 6,71 20 93,05 178,84 100
Tabla B.1: Datos para curva de calibración de bomba peristáltica.

Figura 9: Gráfica entregada por el fabricante para bomba peristáltica cabezal YZ2515X.

Diámetro manguera Caudal del fabricante Caudal experimental

15# (4.8mm) 190 ml/min -
16# (3.1mm) - 89 ml/min
24# (6.4mm) 380 ml/min -
25# (4.8mm) - 160 ml/min
Tabla B.2: Caudales experimentales y teóricos de la bomba.

Este grafico fue intervenido con la creación de una cuadrilla para poder estimar de mejor manera
el caudal de las mangueras 15# y 24# a 100RPM.
 ANEXO C: CONVERSIÓN Y FORMACIÓN DE PRODUCTO (ENZ. SOLUBLE E INMOVILIZADA).

Enzima soluble Enzima inmovilizada

Promedio Promedio
Concentración Concentración
Tiempo concentración concentración
Muestra de glucosa Conversión de glucosa Conversión
(min) de glucosa de glucosa
(mM) (mM)
(g/L) (g/L)
0 1 12,4 68,83 0,23 0,07 0,36 0
10 2 19,19 106,49 0,35 9,07 50,32 0,17
20 3 26,18 145,29 0,48 14,25 79,1 0,26
30 4 8,36 46,4 0,15 17,8 98,8 0,33
40 5 19,37 107,49 0,36 18,65 103,52 0,35
55 6 23,18 128,67 0,43 21,31 118,26 0,39
70 7 29,89 165,91 0,55 22,77 126,36 0,42
85 8 31,78 176,4 0,59 24,64 136,74 0,46
100 9 34,9 193,72 0,65 26,25 145,68 0,49
120 10 36,63 203,32 0,68 26,74 148,43 0,49
140 11 38,27 212,43 0,71 28,08 155,84 0,52
160 12 41,1 228,14 0,76 - - -
Tabla C.1: Conversión de glucosa, enzima soluble e inmovilizada,

Enzima soluble Enzima inmovilizada

Concentración Concentración Concentración Concentración
Tiempo Producto Producto
Muestra de producto de producto de producto de producto
(min) (µmol) (µmol)
(g/L) (µmol/L) (g/L) (µmol/L)
1 0 12,40 68831,5 103247,3 0,07 360,8 541,2
2 10 19,19 106494,6 159741,9 9,07 50319,2 75478,8
3 20 26,18 145295,6 217943,4 14,25 79100,7 118651,1
4 30 8,36 46405,8 69608,7 17,80 98806,6 148209,8
5 40 19,37 107493,8 161240,6 18,65 103524,8 155287,3
6 55 23,18 128670,6 193005,8 21,31 118262,6 177393,8
7 70 29,89 165917,3 248875,9 22,77 126366,9 189550,4
8 85 31,78 176408,5 264612,8 24,64 136747,2 205120,7
9 100 34,90 193727,4 290591,2 26,25 145684,2 218526,2
10 120 36,63 203330,6 304995,8 26,74 148431,9 222647,8
11 140 38,27 212434,1 318651,1 28,08 155842,4 233763,5
12 160 41,10 228143,2 342214,8 - - -
Tabla C.2: Formación de producto, enzima soluble e inmovilizada.
ANEXO D: PERFILES TEORICOS.

Perfil teórico enzima disuelta Perfil teórico enzima inmovilizada

Conversión Tiempo (min) Conversión Tiempo (min)
0,1 7 0,1 5
0,2 13 0,2 10
0,3 20 0,3 14
0,4 27 0,4 20
0,5 34 0,5 25
0,6 42 0,6 31
0,7 50 0,7 37
0,8 60 0,8 44
0,9 72 0,9 54
0,99 98 0,99 78
Tabla D.1: Dato para el perfil de conversión teórico de ambas experiencias

Para calcular la enzima a utilizar en ambas experiencias se utilizó la siguiente ecuación:

𝑘 ∗ 𝑒 ∗ 𝑡 𝑆𝑜 ∗ 𝑋
= − 𝐿𝑛(1 − 𝑋)
𝐾𝑚 ∗ 𝑉𝑟 𝐾𝑚

Por ejemplo, se utilizó esta ecuación para determinar la cantidad de enzima que se utilizaría en la
experiencia 2 de la siguiente manera:

k = 1, Km = 50 [mM], t =2 [h], Vr = 2 [L], So = 300 [mM], X =0.99

1 ∗ 𝑒 ∗ 120 300 ∗ 0.99

= − 𝐿𝑛(1 − 0.99)
50 ∗ 2 50

𝑒 = 8,07 𝑈𝐼

8,07𝑈𝐼
𝑒=
105 𝑈𝐼/𝑔

𝑒 = 0,084 𝑔
La misma ecuación de comportamiento se puede utilizar para encontrar el tiempo en el que la
enzima alcanza cada conversión.

ANEXO E: CÁLCULO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD MÁXIMA.

Para calcular la velocidad máxima de reacción enzimática se debe graficar en primera instancia la
concentración de producto, que para fines de este práctico es la glucosa a través del tiempo de
muestreo correspondiente. La pendiente de dicho gráfico es equivalente a la velocidad inicial de
reacción la que sirve para despejar la velocidad máxima de reacción experimental de la ecuación
de Michaelis-Menten:

𝑉𝑚á𝑥 × [𝑆]
𝑉𝑜 =
𝐾𝑚 + [𝑆]

Usando la velocidad inicial de la reacción de hidrólisis con enzima disuelta, así, Vo = 5734,8 UI,
considerando la concentración inicial de lactosa de 300 mM y un Km de 70mM, se tiene:

𝑉𝑜(𝑘𝑚+[𝑆])
𝑉𝑚á𝑥= [𝑆]

𝑉𝑚á𝑥 = 7072,9 [𝑈𝐼]

Del mismo modo se calcula la velocidad máxima de reacción experimental para la enzima
inmovilizada. Usando la velocidad inicial de reacción correspondiente de valor 7493,8 UI, una
concentración de lactosa de 300 mM y un Km de 70 mM, se obtiene:

𝑉𝑜(𝑘𝑚 + [𝑆])
𝑉𝑚á𝑥 =
[𝑆]

𝑉𝑚á𝑥 = 9242,4 [𝑈𝐼]