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1. AGLUTINACIÓN.
Son técnicas más sensibles que las anteriores que se usan para valorar la presencia de
Ac específicos en el suero. Se basan en la capacidad de los Ag particulados, unidos a sus
Ac complementarios, para aglutinarse dando lugar a un agregado que se ve a simple
vista.
Esta técnica puede ser:
- Cualitativa: resultado positivo o negativo.
- Cuantitativo: sí se hace una dilución seriada del suero y se calcula el título de Ac. Título
de Ac es la inversa de la máxima dilución del suero que da positiva la reacción de
aglutinación.
Dependiendo de la conformación del Ag, se pueden distinguir dos tipos básicos de
aglutinación:
1.1.1. AGLUTINACIÓN DIRECTA.
Se utilizan Ag formes o particulados en suspensión (bacterias protozoos o esporas).
Todos ellos exhiben determinantes antigénicos o epitopos en su periferia.
d) Lectura de la prueba:
- REACCIÓN POSITIVA: no hay hemolisis porque el complemento se consumió en la
reacción inicial. Indica que hay Ac en el suero problema.
ANALISIS CLINICOS II
Docente: TATIANA DEL CASTILLO DE LOAYZA
2. FLUORESCENCIA
1°: Excitación: se entrega un fotón de energía por una fuente externa a un fluoróforo
que absorbe, pasando a un estado electrónico excitado S1’
2°: Duración del estado excitado: existe por un período de tiempo finito (típicamente
1-10 x 10-9 segundos), sufre cambios conformacionales y puede interaccionar con su
ambiente molecular. Consecuencias: La energía de S1’ es parcialmente disipada
produciendo un estado excitado relajado desde el que se emite la fluorescencia; no
todas las moléculas inicialmente excitadas del estado 1 vuelven al estado S0 por
fluorescencia, existen otros procesos.
3°: Emisión de fluorescencia: un fotón se emite, lo que permite el retorno al
fluoróforo al nivel S0. A causa de la disipación de energía durante el estado excitado, la
energía de este fotón es menor.
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- Las muestras biológicas marcadas con fluorescencia contienen típicamente más de una
especie fluorescente, haciendo que el aislamiento de la señal sea compleja. Otras señales
ópticas (como S2) quizás correspondan al background o a una segunda sonda
fluorescente.
- La detección de autofluorescencia puede ser minimizada por la selección de filtros
adecuados que reduzcan la transmisión de E2 respecto de E1.
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- Fuente luminosa: coincidente con espectro de absorción del fluorocromo. Que no llegue
al ocular (UV perjudica la retina) Luz monocromática o no.
- Filtros:Excitador: Transparente a l cortas bloqueando l más largas. Barrera:
Transparente a l largas bloqueando l cortas. Se coloca entre el objeto y el observador.
2.3.1. FUNDAMENTO.
Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo después este
conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de
microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Cuando la reacción es
positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el
microscopio de inmunofluorescencia. Se realiza un acople a un anticuerpo de un
fluoróforo o una enzima que cataliza una reacción por la cual se emite fluorescencia
2.3.2. PRINCIPIOS GENERALES DE MARCACIÓN DE ANTICUERPOS POR
SUSTANCIAS FLUORESCENTES
A) Conjugados
Compuestos fluorescentes + Anticuerpos = Conjugados
Un buen conjugado debe tener:
- Fluorescencia intensa
- Reacción específica con los antígenos
Depende de:
- Calidad y concentración de los Acs en el suero
- Propiedades de la sustancia fluorescente
- Modificaciones que ambos pueden sufrir en el acople
También influyen:
- Intensidad de marcación
- Homogeneidad de marcación
- Presencia en el conjugado de otras moléculas marcadas
B) Anticuerpos
- Para mayor especificidad utilizar antígenos puros para inmunizar
- Absorber los antisueros para eliminar Acs indeseables o naturales
- Purificar la fracción de Ig a marcar
- Verificar título de anticuerpos
- Existe un estrecho paralelismo entre título precipitante y fluorescente
- Titulación de reactivos: Ac 1° y Conjugado deben titularse.
C) Fluorocromos
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3. HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA
Histoquímica es el estudio químico de los tejidos independientemente del método de
análisis empleado. En la práctica se emplea la palabra para designar el método junto
con el auxilio de los microscopios ópticos (MO) y electrónico (ME).
Esta técnica permite la identificación y localización de compuestos o radicales químicos
en las células y tejidos. Esto se consigue provocando reacciones que dan productos
insolubles que son coloreados o electrodensos y visibles por el MO y el ME .
A. PRINCIPIOS BÁSICOS.
1. QUE LOS COMPUESTOS QUE DEBEN SER ANALIZADOS NO SEAN DIFUSIBLES.
Este problema se resuelve insolubilizando los compuestos que van a ser estudiados por
medio de la fijación del tejido.
- Se recomienda el uso de fijadores con alcohol para el estudio de sustancias
hidrosolubles como el glucógeno.
- Hay que evitar los fijadores ácidos en las técnicas de visualización del fosfato cálcico.
Los fijadores más utilizados son:
- Formaldehído para el MO .
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5. POLISACÁRIDOS.
Se encuentran unidos a proteínas o en forma libre. En el caso de ser un polímero, antes
hay que tratar la muestra con un enzima glucogenolítico para que libere los azucares.
La reacción más usada es la del PAS (ácido periódico-schiff). El ácido oxida a los azucares
en posición 1-2 y deja grupos aldehídos libres que reaccionan con el reactivo de SCHIFF
dando un compuesto insoluble y coloreado. De este modo se demuestra la presencia de:
- Glucógeno en el hígado y músculo.
- Depósito intracelular de glucógeno en enfermedades congénitas.
- Glucosaminoglicano o mucopolisacárido que forman parte de los proteoglicanos.
- Glucoproteínas.
Los azucares ácidos también reaccionan con el colorante AZUL DE ALCIAN.
6. CATECOLAMINAS. El formoaldehído reacciona con las catecolaminas produciendo
compuestos fluorescentes.
7. ENZIMAS. Su localización se basa en la producción de un precipitado fuertemente
coloreado o electrodenso en el sitio de actividad enzimática.
ENZIMA DETERMINACIÓN
FOSFATASA ÁCIDA Se usa el método de GOMORI que consiste en incubar cortes de
tejidos en una solución que contengan GLICEROL FOSFATO
SÓDICO y NITRATO DE PLOMO a pH 5 .
La enzima libera el fosfato que reacciona con el plomo y da un
precipitado insoluble.Después se añade sulfito de amonio que da
color negro y electro denso al precipitado.
Se usa para localizar lisosomas.
DESHIDROGENASAS Se usan cortes no fijados junto con un compuesto químico
soluble y debilmente coloreado del tipo TETRAZOL.El tetrazol es
reducido y forma un precipitado coloreado llamado FORMAZAN.
Se usa para detectar mitocondrias.
PEROXIDASA Promueve la reducción de ciertos sustratos, transfiriendo iones
hidrógenos desde el peróxido de hidrógeno al sustrato que se
reduce.
Como sustratos se usa el peróxido de hidrógeno y el tetraclorato
3,3-diamino-bencidina que cuando se reduce forma un
compuesto coloreado, insoluble y electrodenso.
B. FLUORESCENCIA.
Sustancia fluorescente es la que absorbe luz de una longitud de onda determinada y
emite luz en otra longitud de onda mayor. En microscopía se suele usar la excitación con
luz ultravioleta.
1. COMPUESTOS FLUORESCENTES.
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MÉTODO CARACTERÍSTICAS
FÍSICO - Calor, como en bacterilogía.
- Frió, como en el criostato.
Este paso es ESENCIAL, puesto que las proteínas son las principales responsables de la
estructura celular y se degrada después de la muerte celular.
Habitualmente se hace una doble fijación con una solución tamponada de:
- Glutaraldehído.
- Tetraóxido de osmio.
B. INCLUSIÓN.
- Da consistencia firme a los tejidos para que se puedan obtener cortes suficientemente
finos.
- Las sustancias más usadas para este fin son:
- GELATINA, CELOIDINA, PARAFINA para la MO.
- RESINA EPOXI para la ME.
Hay una serie de tratamientos a los que hay que someter a una pieza antes de la
inclusión:
TRATAMIENTO CARACTERÍSTICAS
DESHIDRATACIÓN Se extrae el agua de los tejidos con baños de
concentraciones crecientes de etanol ( de 70% a
100%).
ACLARAMIENTO O Sustitución del etanol por un liquido miscible en
DIAFANIZACIÓN etanol y parafina.Se usa xilol, benzol o toluol que
dejan a la pieza translúcida.
INCLUSIÓN O IMPREGNACIÓN - Se colocan las piezas en parafina fundida a 60 ºC
en el interior de una estufa.
- Debido al calor , el xilol o toluol se evaporan y los
espacios que dejan libre son ocupados por la
parafina.
- Se lleva la pieza a un recipiente rectangular y se
deja solidificar.
- Inconvenientes:
- Destruyen muchas enzimas
- Eliminan compuestos liposolubles
- Los bloques de parafina son seccionados por la cuchilla del microtomo, obteniéndose
cortes de 3 a 8 micras de espesor. Estos cortes son extendidos en agua caliente y
después se llevan a un portaobjetos.
- Para el microscopio electrónico se requieren cortes de 0.02 a 0.1 micra. El material se
incluye en plásticos bastante duros del tipo epoxi y para cortarlos se usa un
ultramicrotomo equipado con navaja de cristal o diamante.
- El microtomo de CONGELACIÓN SE USA PARA ESTUDIAR LOS LÍPIDOS DE LAS
ESTRUCTURAS CELULARES, ya que los solventes orgánicos los eliminan. Usa nieve
carbónica para congelar el tejido.
- CRIOSTATO es un microtomo de congelación más elaborado que permite la obtención
rápida de cortes sin pasar por todas las etapas anteriores, cuando se usa parafina.Son
muy utilizados en hospitales cuando se requiere un diagnostico rápido de un material
patológico.
El criostato es también muy útil en histoquímica , pues no inactiva las enzimas, pero
dificulta la difusión de las moléculas.
- MÉTODO DE CONGELACIÓN-DESECACIÓN: Se mantiene la actividad enzimática. Se
congela a -150 ºC y después se deshidrata lentamente a vació.
D. COLORACIÓN.
- Aumenta el contraste de las estructuras y hace a los tejidos visibles y diferenciables
unos de otros.
- Se realiza normalmente con MEZCLAS QUÍMICAS DE COLORANTES.
- La mayoría de los colorantes se comportan como ácidos o como bases y tienden a
formar sales con los radicales ionizables de los tejidos.
- Los componentes de los tejidos pueden ser:
Hematoxilina Negro - - - -
férrica
Tricromo Fuchina-ácida y - Rojo - - -
Masson Panceau
Verde luz - - Verde - -
RADIOAUTOGRAFIA
Se basa en el efecto de las radiaciones sobre las emulsiones fotográficas que contienen
bromuro de plata (microdetectores de radiactividad). Los cationes de plata que son
alcanzados por la radiación se transforman en plata metálica que aparece negra al
microscopio óptico (MO).
Fases:
1º. Inyectar el isótopo radiactivo al órgano en estudio.
2º. Poner un corte de órgano en contacto con la película de emulsión fotográfica.
3º. Dejar un período de exposición y revelar la película. Los puntos negros que aparecen
corresponden a los sitios del órgano que contienen el isótopo.
5. CITOMETRÍA DE FLUJO.
5.1. FUNDAMENTO
La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo
fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células)
alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada
célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de
la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas señales
en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida
simultánea de varios parámetros en una misma célula.
En el momento de realizar las mediciones en el citómetro de flujo, las células pueden
estar vivas o fijadas, pero obligadamente en suspensión celular y en forma de célula
única. Al obligarlas a pasar alineadas una a una frente a un haz láser mediante un flujo
continuo, cada célula, a la vez que dispersa la luz, emite luz fluorescente como
consecuencia de la excitación láser a la que es sometida. Los parámetros que típicamente
se miden de forma simultánea por cada célula son:
1. Dispersión frontal de la luz a 2º (forward scatter), valor proporcional al tamaño
celular.
2. Dispersión de la luz ortogonal (side scatter), proporcional a la cantidad de estructuras
granulares o complejidad de la célula.
3. Intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.
B) Los sistemas ópticos permiten el enfoque láser en un haz con un diámetro reducido
para impactar sobre el menor número de partículas posibles simultáneamente.
B) Señales de Fluorescencia.
Los citómetros de flujo permiten detectar señales de fluorescencia procedentes de
complejos Antigeno/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una célula,
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6. REACCIONES INMUNOENZIMÁTICAS.
6.1. ENZIMOINMUNOANÁLISIS
A1) Ventajas:
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Más precisos
A2) Desventajas:
B1) Ventajas :
B2) Desventajas :
2. Todas las placas son sometidas a un tapizado con gelatina o albúmina sérica bovina,
que recubre las zonas en las que no se ha fijado el primer componente de la reacción
(Ag o Ac).
Los reactivos utilizados suelen ser los mismos (peroxidasa, fosfatasa alcalina, beta-
glucosidasa, glucosa oxidasa) para todos los ELIASAs, con la diferencia del sustrato de
la enzima utilizada:
- La glucosa oxidasa reacciona con la glucosa y libera agua oxigenada que se detecta
por una mezcla de peroxidasa y un cromógeno. Sí queremos un precipitado, podemos
usar una sal de tetrazolio.
Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se
sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la
presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos
que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, …) pero en las que
se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles
positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).
Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos
y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos : uno
primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección
tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señál debida a la unión de
dos o más anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como
lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo
sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.
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• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán
específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los
anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los
antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal
forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará
específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal
forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará
específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
7.1. ELECTROFORESIS.
Separación de proteínas del suero en función de su comportamiento en el campo
eléctrico.
TIPOS DE ELECTROFORESIS
EQUIPO DE ELECTROFORESIS
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Fuente de alimentación
o Aplicador
o Cubeta y puente
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o Reactivos
Se hace correr una alicuota de suero en un gel de agarosa y con tampón barbital (pH
8.4), en el que las Ig (con carga positiva) se desplazan hacia el cátodo. Después de
correr el gel, éste es fijado en una solución ácido-alcohol y se tiñe con un colorante de
proteínas, y por ultimo se hace un densitometrado. Es una técnica CUALITATIVA.
Sirve para:
- Detectar hipergammaglobulinemias.
- Calcular la fracción gamma.
- Detectar paraproteínas (componentes monoclonales) en el suero..
7.2. INMUNOELECTROFORESIS (IEF).
Prueba CUALITATIVA.
Método combinado de precipitación.
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7.3. RADIOINMUNOELECTROFORESIS.
- Se marca radiactivamente los Ag y se hace una IEF; después se hace una
autorradiografía de las bandas obtenidas (se visualizan mejor).
- Es una prueba CUALITATIVA y/o semicuantitativa.
7.4. ELECTROINMUNODIFUSIÓN.
Consiste en acelerar la formación de la banda de precipitación por la acción de un campo
eléctrico. Con estas técnicas se detectan [Ag] de 20 mgr/ml y [Ac] de 20 mgr/ml. Estas
técnicas se basan en que el Ag y el Ac tienen cargas diferentes al pH seleccionado;
puesto que la mayoría de los Ag tienen un pI bajo y los Ac alto. Si las cargas sobre el
Ag y Ag apenas difieren, se puede modificar la molécula químicamente.
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globulinas son siempre sospechosas de ser proteínas monoclonales, y por lo tanto son
un indicio de gammapatías monoclonales.
- QUIMIOCONJUGADOS.
b) NO CONJUGADOS:
- ACCIÓN ANTITUMORAL
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- ELIMINACIÓN DE CÉLULAS.
- Quimeras con región Fc. IgG. alargan vida media del receptor soluble
Lectura de la placa
- Prueba CUALITATIVA.
- Se vierte el gel de agarosa sobre portas y se deja gelificar (1-2% de agarosa a pH 7-
8.5).
- Se hacen dos pocillos y se deposita el Ag en uno de ellos y el Ac en el otro.
- Ag y Ac difunden y en el punto de encuentro de los dos, y sí las concentraciones son
adecuadas, se produce una banda de precipitación.
- Si en la solución existen dos Ag reconocidos por el Ac, habrá dos bandas.
- Se puede usar azul cromassie para teñir las bandas.
10.3.3. INMUNODIFUSIÓN DOBLE TIPO II (IDD-II) U OUCHTERLONY.
También es conocida como Agar gel immunodiffusion test (AGID).
c) Identidad parcial (los dos Ag comparte un epitopo, pero uno de ellos tiene un epitopo
extra que es reconocido por el suero): se forma un arco de precipitación al que le sale
un espolón.