UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI

CAMPUS ALTO PARAOPEBA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA, BIOTECNOLOGIA E ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS
DISCIPLINA: BIOLOGIA MOLECULAR EXPERIMENTAL

Relatório Biologia Molecular

Agnes Souza de Oliveira 144250052

Cecília Pimenta de Almeida 144200016

Emanuelle Fernandes 144250007

Júlia de Paula Rodrigues 144250053

Ouro Branco
Novembro de 2017

Rodovia MG 443, KM 7, Campus Alto Paraopeba, UFSJ CEP: 36420-000

Ouro Branco – MG
 1. INTRODUÇÃO

INTRODUÇÃO
A extração dos ácidos nucléicos (DNA e RNA) é o primeiro passo para a realização da
maioria das metodologias de biologia molecular. Pode-se obter DNA a partir de inúmeros
tipos de tecidos e células, e existe uma infinidade de protocolos para a realização de tal
procedimento (BARTLETT, 2003).

O plasmídeo bacteriano é uma molécula de DNA circular, de fita dupla,

extracromossômica e é um dos vetores mais utilizados em técnicas de DNA recombinante
para o isolamento e propagação de moléculas de DNA (ZAHA, 2012). O DNA plasmidial
está presente juntamente com DNA genômico, proteínas e outros constituintes nas colônias
das bactérias, portanto, para sua utilização, deve ser extraído de forma eficiente para que
esteja isento de contaminantes e adequado para o uso.

Após o processo de extração do DNA gênomico e plasmídial, torna-se necessário

proceder a quantificação, para verificar a quantidade de material obtido, que é uma etapa
fundamental para a eficiência da reação de PCR (reação de polimerase em cadeia) (COSTA,
2001). Na quantificação é importante analisar o nível de integridade da amostra, bem como o
grau de pureza dele. Para isso, utiliza-se em geral três métodos: eletroforese,
espectrofotometria no UV e a PCR.

Na eletroforese, o princípio é baseado no fato da molécula de DNA possuir carga

negativa em valores de pH neutro ou alcalino e consequentemente, quando aplicado ou imerso
em uma matriz de gel submetida a um campo elétrico, migra em direção ao pólo positivo
(anôdo) (CORREA, 2017). Assim o ácido nucléico em grande quantidade pode ser facilmente
detectado a olho nú diretamente em gel de eletroforese através de corantes específicos para
eles, é possível analisar se houve contaminações ou falhas no experimento. Na
espectrofotometria no UV, que além de determinar se há contaminação, medindo-se em
comprimentos de onda (λ) de 230 nm, indica presença de proteínas numa absorção a 280 nm e
no comprimento de onda a 260 nm, determina-se a quantidade de ácido nucléico na amostra
(RODRIGUES,2017). Quanto maior for a absorção de luz nesse comprimento de onda, maior
a concentração de DNA na solução. Para avaliar a pureza de DNA na amostra calcula-se a

1
relação A260nm / A280nm, e se os valores estiverem entre 1,4 e 2,0 indicam pureza adequada
das extrações de DNA (NONOHAY, 2017). Por fim, a PCR (“Polymerase Chain Reaction”)
amplifica-se o DNA presente na amostra que depois é analisado por eletroforese para
identificar se havia contaminação, por exemplo com RNA, bem como se a sequência alvo foi
amplificada juntamente com sequências indesejáveis e se o DNA extraído estava ou não
degradado (ANTONINI et al., 2004).

Portanto, neste relatório, o objetivo é aplicar o conteúdo das aulas teóricas de biologia
molecular, extraindo o DNA genômico e plasmidial da bactéria E. coli e analisá-los em gel de
eletroforese, espectrofotometria e PCR.

2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Extração de DNA Genômico de células de Escherichia coli

A cultura de células de Escherichia coli foi centrifugada por 5 min, a 12.000 rpm. O
pellet bacteriano obtido foi ressuspendido em 750 µL de solução salina-EDTA [150 mM de
NaCl; 100 mM EDTA]. Em seguida adicionou-se 60 µL de dodecil sulfato de sódio (SDS)
20% agitando-se suavemente a preparação que foi incubada a 65°C por 5 minutos.

As desproteinizações foram realizadas adicionando-se ao microtubo 650 µL da

solução de fenol-clorofórmio (1:1) seguida por vigorosa agitação no vórtex. Logo após,
centrifugou-se a preparação por 5 minutos a 13.000 rpm. 300 µL da fase aquosa obtida foram
coletados e transferidos para outro microtubo, ao qual adicionou-se 10 µL de NaCl 5M e 600
µL de etanol absoluto gelado. A amostra foi novamente centrifugada a 13.000 rpm por 5 min
e adicionou-se ao precipitado obtido 1 mL de etanol 70% gelado homogeneizando-se
suavemente a preparação que foi mais uma vez centrifugada. Descartou-se o sobrenadante
obtido e o pellet foi ressuspendido em 50 µL de água ultrapura esterilizada. A amostra foi
armazenada em geladeira a 4°C.

2.2 Extração do DNA Plasmidial de células de Escherichia coli

A cultura de células de Escherichia coli foi inoculada com 5mL de meio LB contendo
o antibiótico ampicilina após ser incubada a 37ºC em agitação (200 rpm) durante 16 horas,
2
após esse procedimento retirou-se 1,5mL e centrifugou-se a 12000 rpm por 5 minutos a 4ºC,
foi feito o descarte do sobrenadante em hipoclorito e centrifugou novamente sob as mesmas
condições. Ressuspendeu-se o pellet com 100µL de solução A, tampão GTE contendo glicose
50mM, Tris HCl 25mM, pH 8 e EDTA 10mM e foi feita a agitação por meio do vórtex para
posteriormente deixar incubado, por 5 minutos, no gelo. Em seguida adicionou-se 200µL de
solução B contendo NaOH 5M e SDS 1%, agitou-se o microtubo por inversão cinco vezes,
incubou-se no gelo por cinco minutos, em seguida adicionou-se 150µL de solução C contendo
acetato de potássio 3M e pH ajustado para 4,8 com ácido acético, agitou-se o microtubo por
inversão três vezes, incubou-se no gelo por cinco minutos. Passados os cinco minutos
centrifugou-se a 12000 rpm por 5 minutos à 4ºC. Transferiu-se o sobrenadante em um outro
microtubo e nele adicionou-se 500µL de isopropanol, para então ser incubado por 15 minutos
a -20ºC. Após incubação, centrifugou-se a 12000 rpm por 10 minutos a 4ºC, para descartar-se
o sobrenadante e adicionando-se 1 mL de etanol 70% gelado no sedimento. Sendo
centrifugado novamente a 12000 rpm por 10 minutos a 4ºC, para descartar-se o sobrenadante
e deixar o microtubo secar. Dissolvendo-se o DNA em 50µL de água Mili-Q estéril e
armazenando-o a -20ºC.

2.3 Eletroforese

O gel de agarose 0,7% utilizado nesta prática foi preparado pesando-se 0,7 g de
agarose e adicionando-se 100 mL de tampão TBE 0,5X [Tris base 54g; ácido bórico 27,5g;
EDTA 0,5M (pH 8,0), 20mL; água ultra-pura q.s.p 1000mL]. Em seguida aqueceu-se a
mistura em micro-ondas até a completa dissolução da agarose. Após a solubilização, a solução
de agarose foi resfriada, até atingir aproximadamente 40ºC. Verteu-se a agarose na forma até
uma altura de aproximadamente 5mm e o pente para formação das canaletas foi inserido. A
gelificação do gel ocorreu à temperatura ambiente. Retirou-se o pente lentamente para não
danificar os poços e transferiu-se o gel para a cuba, posicionando os poços no lado do eletrodo
negativo. Adicionou-se tampão TBE 0,5X a cuba de modo a cobrir o gel.

As amostras foram preparadas misturando-se em um microtubo 5 μl de DNA e 3 μl do

tampão de amostra 6X [azul de bromofenol 0,25% (p/v), xileno de cianol 0,25% (p/v) e
glicerol 30% (p/v)]. A seguir, as amostras foram aplicadas nos respectivos poços, enchendo-
3
os lentamente com auxílio de uma micropipeta. Após aplicação das amostras, colocou-se a
tampa na cuba e verificou-se se as amostras estavam orientadas corretamente, no lado do polo
negativo (eletrodo de cor preta). Os cabos foram ligados à fonte de eletricidade que foi
regulada para uma tensão de 100 volts. O desprendimento de bolhas devido à eletrólise e a
migração do azul de bromofenol foram observados. Após migração, desligou-se a corrente
elétrica na fonte e os cabos, retirando-se a seguir a tampa da cuba. O gel foi cuidadosamente
retirado e em seguida corado em banho com solução de brometo de etídeo 0,5μg/mL, durante
15min à temperatura ambiente. O gel corado foi examinado sob radiação ultravioleta e
fotografado para análise.

2.4 Quantificação e Determinação do Grau de Pureza dos Ácidos Nucleicos

Diluiu-se o DNA extraído com H2O ultrapura esterilizada e foi utilizado 10 μL da

preparação para um volume final de 1mL, resultando em um fator de diluição de 100x. Após
este procedimento, foram feitas as leituras em espectrofotômetro a 260 nm; 280nm e 230 nm,
utilizando a cubeta de quartzo. Com os resultados obtidos, a concentração da amostra e as
razões A260/280 e A260/230 foram calculadas pela seguinte fórmula:

𝐴260∗𝐹𝐷∗50
[DNA]( μg/ μL )=
1000
Onde FD = fator de diluição

2.5 PCR

Retirou-se o DNA genômico e plasmidial e os demais reagentes do freezer e os deixou

em banho de gelo, tomando-se cuidado maior com a Taq DNA Polimerase que deve
permanecer sempre em banho de gelo. Lembrando que a pessoa que manipulou as amostras
lavou as mãos, e em seguida, colocou as luvas. A bancada foi limpa com álcool 70% e os
tubos que foram usados nas reações, foram devidamente identificados. O mix de PCR foi

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preparado para quatro reações, no qual o volume final para cada reação foi 50µL, conforme
tabela 1.

Tabela 1 - Mix de PCR

Componentes Concentração Concentração 1 reação 4 reações
Estoque de Uso
Tampão da PCR (Taq Buffer) 10x 1x 5µL 20µL
dNTP (mix) 10mM 0,2mM 1µL 4µL
Forward Primer 10µM 0,4µM 2µl 8µl
Reverse Primer 10µM 0,4µM 2µL 8µL
Taq DNA Polimerase 5U/µl 5U/50 µL 1µL 4µL
DNA (amostra) 10pg - 1 µL - 2µl -
Água, nuclease-free (ultrapura) - - 37µL 148µL

Distribuiu-se, então, 48µL de mix de PCR com 2µL de DNA, este obtido nas práticas
anteriores, em cada tubo, com exceção do tubo controle. Levou-se ao termociclador conforme
descrito na Tabela 02. Foram utilizados primers universais, correspondentes ao gene que
codifica o RNA ribossomal 16s, o Forward Primer 968 F e o Reverse Primer 1492R.

Tabela 2 - Programação da reação de PCR no termociclador

Ciclos D.I Desnaturação Anelamento Extensão F. E. Resfriamento
35 94ºC - 94ºC - 45s 50ºC - 1min 72ºC 72ºC 4ºC
3min 1min e 15min
30 s
D.I- Desnaturação Inicial; F.E-Final da Extensão

Após o ciclo de PCR, realizou-se eletroforese para análise dos 5 µL dos produtos
obtidos (amplicons) em gel de agarose 1,2%. Corou-se com brometo de etídeo e visualizou-se
em transiluminador de luz UV. Os tamanhos dos fragmentos amplificados foram analisados
por comparação com padrão de massa molecular.

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 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.1 Extração de DNA Genômico de células de Escherichia coli

Segundo Romano e Brasileiro (1999), o processo de extração de DNA pode ser

dividido em duas etapas. A primeira etapa é a extração propriamente dita e consiste no
rompimento das membranas celulares e consequente exteriorização do DNA. A segunda fase
consiste na purificação do DNA em solução, ou seja, na remoção dos outros componentes
celulares da solução (restos de membrana, proteínas, RNA).
Para bactérias gram negativas, como E. coli, a combinação de detergentes e
substâncias alcalinas são eficientes para remoção das camadas lipídicas da membrana externa
e da parede celular expondo o DNA para a purificação (LIMA, 2008). No presente trabalho,
utilizou-se a combinação entre solução salina-EDTA e SDS para exteriorizar o DNA
genômico de E. coli. O EDTA é um agente quelante de cálcio, com a capacidade para
desestabilizar a estrutura do lipopolissacarídeo presente na membrana externa das bactérias
gram-negativas. Além disso, o EDTA inibe a atividade das desoxirribonucleases dependentes
de Mg2+. Já o SDS age emulsificando compostos lipídicos da parece celular e da membrana
plasmática.
A mistura de fenol e clorofórmio, empregada neste protocolo, provoca a desnaturação
das proteínas de maneira muito eficiente. Sua ação se fundamenta na propriedade hidrófoba
das proteínas que apresentam afinidade por solventes orgânicos. Após centrifugação, as
proteínas desnaturadas pelo tratamento com fenol e clorofórmio formam uma camada na
interface das fases aquosa e orgânica, separando-se do DNA que se mantém na fase
aquosa (OLIVEIRA et al., 2007).
A etapa final da extração de DNA genômico de E. Coli consistiu na precipitação do
DNA utilizando etanol absoluto associado a uma solução de NaCl 5M. O etanol, na presença
de sal, induz a transição estrutural nas moléculas de ácido, fazendo-as se agregarem, com
consequente precipitação. A precipitação com etanol absoluto, além de concentrar o DNA,
ajuda a remover resíduos de fenol e de clorofórmio presentes na amostra. O etanol a 70% foi
utilizado para remover da amostra possíveis resíduos de sais (OLIVEIRA et al., 2007).
A integridade e qualidade do DNA extraído serão analisadas por meio de eletroforese
em gel de agarose. Já sua concentração e pureza serão mensuradas por meio da análise da
densidade óptica (DO) em espectrofotômetro.
6
 3.2 Extração do DNA Plasmidial de células de Escherichia coli

A fim de preservar e evitar a desnaturação do DNA plasmidial é necessário que em

cada etapa do procedimento da extração do plasmídeo a amostra seja incubada em gelo.
Foi feita a transferência de 1,5mL da amostra, previamente preparada, para os
microtubos que foram submetidos à centrifugação, foi acrescentado sobre o pellet obtido a
solução A, cuja função era ressuspensão da célula sem que ocorra a lise da mesma. Seguindo
pela adição da solução B cujo objetivo era promover a lise alcalina da célula ao solubilizar os
lipídeos da membrana. E finalizando com a adição da solução C, tendo o intuito de neutralizar
o pH do lisado e precipitar o DNA cromossomal, uma vez que o DNA bacteriano não é capaz
de se desligar das proteínas.
Em seguida a amostra com a adição de todas as soluções foi levada à centrífuga
novamente, onde o resultado da qualidade e integridade do DNA Plasmidial extraído se deu
pela análise da eletroforese em gel de agarose e sua concentração e pureza são obtidas após a
análise da densidade óptica em espectrofotômetro realizada no experimento.

3.3 Eletroforese

A eletroforese em gel é um método usado para separar misturas de DNA e RNA de

acordo com os tamanhos das moléculas adquiridas após a extração desses ácidos nucleicos,
onde após sua análise é possível verificar a integridade e qualidade do material genético.
Neste experimento a eletroforese foi feita em gel de agarose, as amostras contendo o material
genético, já misturadas em um tampão contendo glicerol para assegurar que a amostra de
DNA entre no poço pela força da gravidade, e corantes sendo eles azul de bromofenol e o
xileno cianol, no qual facilitam a aplicação da amostra no gel, por acrescentar cor, e auxiliam
no monitoramento da corrida, já que apresentam velocidade conhecida durante a migração na
matriz em direção ao polo positivo (CORRÊA e POSSIK, 2007).
Além da amostra, também foi aplicado no gel um padrão/marcador de massa
molecular, para estimar por comparação o tamanho dos fragmentos de DNA presentes nas
amostras, esse padrão é constituído por diversos fragmentos de DNA de concentrações e

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tamanhos conhecidos, gerados a partir da digestão de plasmídeos (tipo de DNA circular
presente em bactérias) com enzimas de restrição (LEE et al., 2012).
Um fator de grande importância no qual também deve ser levado em conta para a
análise dos resultados é a voltagem utilizada, nesse experimento, foi utilizado uma voltagem
de 100V, estando dentro da faixa normalmente utilizada, pois voltagens excessivas ou muito
baixas interferem na mobilidade do DNA e causam distorções na migração (GOUVEIA E
REGITANO, 2007).
Após a corrida de eletroforese, o gel foi corado com brometo de etídeo, possibilitando
detectar uma quantidade igual ou maior que 10 nanogramas de DNA, sendo a intensidade de
fluorescência emitida proporcional à concentração de DNA presente na amostra (MOREIRA,
2003). Na figura 1, pode-se observar o resultado da eletroforese de extração de DNA
genômico e plasmidial dos quatro grupos. No pólo negativo do gel sendo a parte superior da
fotografia, tem-se DNA genômico e plasmidial e no pólo positivo sendo parte inferior da
fotografia tem-se RNA. Nota-se que houve corrida em todas as bandas correspondendo a uma
boa eletroforese, havendo apenas uma discrepância de fluorescência nas bandas dos Grupos 1
e 2 evidenciando uma concentração de DNA plasmidial maior que dos outros grupos, tanto no
DNA gnômico quanto no DNA plasmidial.

Figura 1: Gel de agarose 0,7%, contém 5 μl da amostra de DNA plasmidial e genômico extraídos de E. coli.
8
 3.4 Quantificação e Determinação do Grau de Pureza dos Ácidos Nucleicos

Ao analisar a Tabela 3 (abaixo), observa-se que a pureza do DNA genômico não foi
satisfatória, devido às relações de A260/A280, que não estão dentro do intervalo de 1,8 e 2, o
qual, segundo Sambrook (1998), a razão que se encontra entre 1,8 e 2 é considerada
satisfatória.
Sendo assim, pelo fato de o DNA genômico ter razão A260/A280 menor que 1,8 (Tabela
3) há indicativo que houve contaminação por proteínas ou lipídios, uma vez que a medição da
amostra a 280 nm é para determinar a quantidade desses componentes presentes, ou seja, o
processo de purificação não foi realizado corretamente (BROWN, 2010). Já a razão A260/A280
sendo maior que 2, segundo o manual da Thermo Scientific, há indicativo de que houve
medição do branco usando uma cubeta suja ou o branco utilizado foi impróprio, pois este
deve possuir pH e força iônica semelhante ao usada nas amostras, acredita-se que o último
caso é mais provável, uma vez que se usou água ultrapura esterilizada para medir o branco.
Além disso, observa-se pela Tabela 3, que as razões A260/A230 não estão dentro do que
Sambrook (1998) considera como satisfatório, os quais deveriam estar entre 2 e 2,2. Segundo
o manual da Thermo Scientific, razões de A260/A230 maiores que 2,2 não são indicativos de
problemas, porém essa relação foi menor que 2, indicando que houve contaminação por fenol
ou reagentes usados na extração, portanto, o processo de eliminação desses componentes não
foi realizado corretamente, levando a contaminação.

Tabela 3: Quantificação e análise do grau de pureza das preparações de DNA genômico obtidas pelos grupos
1,2,3 e 4.
Amostra A260 A280 A230[DNA] A260/A280 A260/A230
(µg/µL)
Grupo 1 -0,256 -0,301 -0,186 1,28 0,850 1,376

Grupo 2 -0,283 -0,244 -0,301 1,42 1,160 0,940

Grupo 3 -0,055 -0,072 -0,056 0,28 0,764 0,982

Grupo 4 -0,055 -0,077 -0,089 0,28 0,714 0,618

9
 3.5 PCR

Após o ciclo de PCR, realizou-se eletroforese para análise dos produtos obtidos
(amplicons) em gel de agarose 1,2%. Corou-se com brometo de etídeo e visualizou-se em
transluminador de luz UV. Comparou-se o tamanho dos fragmentos com um padrão
obtendo-se o peso molecular, esperando-se amplicons na ordem de 450pb. As amostras
foram colocadas à partir do 4º slot, ficando (G1, P1, G2, P2, G3, P3, G4, P4) e na primeira
corrida tem-se o marcador molecular de 100pb. Ao analisar a Figura 2, observa-se que as
bandas formadas pelo padrão molecular possuem bandas com pesos maiores e menores,
indicando diferentes pesos moleculares. Na primeira canaleta há o Branco 1 usado pelo
Grupo 1, no qual observa-se um arraste. O DNA das amostras não deve migrar no gel, se
fragmentos de DNA ocorrerem ao longo da linha da canaleta, o DNA está degradado
(COSTA, 2001) Também demonstra-se uma contaminação com RNA durante o
experimento, sendo necessário repetir a PCR e descobrir a causa desta contaminação,
sendo o principal fator a má manipulação da amostra (MOREIRA, 2017). Dando
continuidade, nos slots 2 e 3, nos quais foram colocados os brancos do grupo 2 e 3, não
houve formação de banda nem arraste, logo o resultado é esperado e positivo,
demonstrando que não houve contaminação no preparo para os Grupos 2 e 3 (ANTONINI
et al., 2004).
Para os Grupos 1 e 3 pode-se visualizar uma formação consistente das bandas,
demonstrando tanto para a amostra de DNA plasmidial quanto a do DNA genômico, um
bom e esperado resultado da extração, pois não houve ausência de bandas, formação de
arraste, várias bandas duplas e/ou inespecíficas ou dímeros no final da corrida
(MOREIRA, 2017). Nas amostras dos Grupos 2 e 4, também foi visualizado a formação
de bandas de mesmo tamanho molecular dos grupos anteriores, mas para estes dois grupos
a banda do DNA plasmidial ficou menos nítidas ou fracas, ou seja, possivelmente a
concentração de amplicons polimerizados foram baixas, decorrentes do processo de
extração ou também se houve uma degradação mais rápida da molécula de DNA antes da
análise por meio da eletroforese (MOREIRA, 2003).
Como dito anteriormente esperava-se amplicons da ordem de 450pb, mas como não
foi possível observar no gel o padrão de peso molecular, devido à baixa resolução, não foi

10
possível confirmar com exatidão se as bandas estão próximas de 450 pb, mas pela posição
semelhante às bandas 1 e 3 provavelmente elas também têm esse peso molecular.
Assim, conclui-se que o resultado da PCR visualizado no gel de agarose não foi
satisfatório para o Grupo 1, principalmente pois houve contaminação no branco, para o
Grupo 2 e 4, pois as bandas do DNA plasmidial ficaram pouco nítidas, porém o único
grupo que obteve boa resolução, ficando bem visíveis, e não houve arraste no branco, foi
o Grupo 3. Certamente, o motivo dos erros pode ser pela má manipulação dos materiais e
amostras, como erros de pipetagem e contaminação do local e/ou instrumentos ou pela
baixa estringência dos primers universais usados para o domínio bactéria, correspondentes
ao gene que codifica o RNA ribossomal 16S: Forward Primer: 968F: 5’
AACGCAAGAACCTTAC 3’ e Reverse Primer: 1493R: 5’ ACGGGCGGTGTGTAC 3’.
Uma das possibilidades, seria em aumentar as concentrações de MgCl2 ou da Taq,
resultando melhores resoluções, uma vez que concentrações incorretas de reagentes
resultam numa baixa eficiência da amplificação ou na produção de produtos não
específicos. Na fase de anelamento a temperatura pode aumentar de 5 a 10° C, para ter
uma maior especificidade dos iniciadores (ANTONINI et al., 2004).

Figura 2: Gel de agarose 1,2%, contém 5 μl da amostra de DNA plasmidial e genômico extraídos de E.
coli. No qual Branco 1, 2 e 3 representa o branco para os Grupos 1, 2 e 3 respectivamente e Padrão é o
padrão de peso molecular.

11
4 CONCLUSÃO

As etapas que constituem a PCR, hoje já possuem melhorias e inovações. Que

diminuem os riscos e falhas nos resultados. Porém, desde a extração até a verificação dos
resultados finais, várias são as chances de perda e/ou desnaturação do material de análise,
de contaminação e de erros de instrumentação mínimos, que afetam os resultados. Com
isso, mesmo sabendo que na prática essa técnica da PCR ser simples e de fácil
manipulação, ela não depende somente do bom tratamento dos parâmetros de suas etapas,
como: tempo, temperatura, primers, enzimas e nucleotídeos utilizados, mas precisamente
da completa integridade e da qualidade do DNA molde, vindos das etapas anteriores à
PCR. Com isso, conclui-se que se a pessoa ou o laboratório que for conduzir os
experimentos tiver um bom conhecimento da prática a ser realizada e muita atenção, será
possível obter resultados consistentes e seguros para uma determinada aplicação.

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5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ROMANO, E.; BRASILEIRO, A. C. M. Extração de DNA de plantas. Biotecnologia,

Ciência e Desenvolvimento, p. 40-43, 1999.

LIMA, Liziane Maria de. Conceitos Básicos de Técnicas em Biologia

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OLIVEIRA, Márcia Cristina de Sena et al. Fundamentos teórico-práticos e protocolos

de extração e de amplificação de DNA por meio de reação em cadeia da polimerase. São
Carlos: Embrapa Pecuária Sudeste, 2007.

ANTONINI, S. R. C.; MENEGHIN, S. P.; URASHIMA, A. S. Técnicas básicas de

biologia molecular. Manual, Universidade Federal de São Carlos, p. 57, 2004.

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coli recombinante. 2003. 118 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Centro de Ciências
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BARTLETT, J. M. S.; STIRLING, D. Methods in molecular biology. In: PCR Protocols,

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