INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERÍA EN SISTEMAS AMBIENTALES

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

LAB. DE BIOQUÍMICA FUNDAMENTAL

PRÁCTICA (3,4,5,6,7)
“Cinética enzimática.”

Eq. __ Sección 2
González Garduño Monica
Rodriguez Gallegos Andrea Guadalupe

4AV1

03/04/18
INTRODUCCIÓN
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan
información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificad del enzima; las enzimas son
moléculas de naturaleza proteica y estructural que catalizan reacciones químicas, siempre que sean
termodinámicamente posibles: una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posible, pero que
transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamente favorable, es decir, transcurra a una mayor velocidad respecto a
la ausencia de la enzima.

En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas muy específicas denominadas sustratos, las cuales se
convierten en productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas
significativas. Debido a que las enzimas son extremadamente selectivas con sus sustratos y su velocidad crece solo con
algunas reacciones, a su vez la velocidad de la reacción puede verse afectada por diferentes factores.

La actividad enzimática puede ser afectada por otras moléculas. Los inhibidores enzimáticos son moléculas que
disminuyen o impiden la actividad de las enzimas, mientras que los activadores son moléculas que incrementan dicha
actividad. Asimismo, gran cantidad de enzimas requieren de cofactores para su actividad. Muchas drogas o fármacos son
moléculas inhibidoras. Igualmente, la actividad es afectada por la temperatura, el pH, la concentración de la propia
enzima y del sustrato, y otros factores físico-químicos.

De una manera más extensa, la actividad enzimática se ve afectada por las siguientes condiciones físico-químicas;

 Temperatura
En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10ºC de incremento, la
velocidad de reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al
ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual
la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima, Por encima de esta temperatura, el aumento de
velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida
a la desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.
 pH
Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las
cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica
positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas,
habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH
óptimo. La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por
encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad.
 Concentración de enzima
La velocidad de una reacción enzimática es directamente proporcional a la concentración de la enzima a
cualquier concentración del sustrato. Cuando aumenta la cantidad de enzima, las moléculas actuaran
independientemente en solución para transformar más sustrato en un intervalo de tiempo.

 Concentración del sustrato

Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración inicial de sustrato ([S]0) Michaelis
y Men

ten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se
forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del
producto, liberando el enzima libre
  Efecto de los inhibidores

Ciertas moléculas pueden inhibir la acción catalítica de un enzima: son los inhibidores. Estos inhibidores bien pueden
ocupar temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el sustrato original (inhibidor competitivo) o
bien alteran la conformación espacial del enzima, impidiendo su unión al sustrato (inhibidor no competitivo)

Objetivo
 Demostrar que las reacciones enzimáticas son afectadas por la temperatura y calcular el valor de la energía de
activación
 Determinar el efecto del pH sobre la velocidad de la reacción catalizada por la invertasa.
 Demostrar que la velocidad de reacción en función de la concentración de enzima.
 Observar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática y determinar la
constante de Michaelis-Meten
 Determinar el tipo de inhibidores producidos por una sustancia (anilina)sobre la actividad de la invertasa

Resultados
Tubos problemas a la temperatura de

P1 P2 P3 P4 P5 P6

(0°) (25°) (37°) (50°) (75°) (92°)

Absorbancia 0.119 0.570 0.592 2.124 0.074 0.011

λ=540nm

Velocidad
(unidades de
- 0.1832 0.1939 0.45335 - -
invertasa)

Azúcar
reductor
(µmoles/2.0ml) 0 1.8322 1.9389 9.3686 0 0
 Tubos testigos a la temperatura de

T1 T2 T3 T4 T5 T6

(0°) (25°) (37°) (50°) (75°) (92°)

Absorbancia 0.098 0.388 0.409 0.834 0.055 0.014

λ=540nm

Velocidad
(unidades de
0.4385 2.3339 2.4712 5.249 0.1575 0
invertasa)

Azúcar
reductor
(µmoles/2.0ml) 2.1928 11.6699 12.3562 26.2450 0.7875 0

 Tabla 1.4 Efecto del pH sobre la velocidad de reacción

Tubos

Testigo P1 P2 P3 P4 P5

pH 5.0 3.0 4.5 5.0 6.5 7

Absorbancia λ = 540 nm
0 0 0.271 0.624 0.667 0.474

Azúcar reductor (µmoles/2.0mL) 0 0 7.8464 19.3823 20.7875 14.4803

Velocidad (unidades de invertasa) 0 0 0.5230 1.2921 1.3858 0.9653

 Tabla 1.5. Efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de reacción.

 Tubos

Testigo P1 P2 P3 P4 P5 P6

Absorbancia λ = 540 nm 0 0.095 0.516 0.304 0.394 0.576 0.680

Azúcar reductor (µmoles/2.0mL) 0 2.0947 15.8529 0.9248 11.86 0.5145 21.2124

Velocidad (unidades de invertasa) 0 0.1396 1.0568 0.5949 0.7906 0.0343 1.4141

Conc. de la enzima (µg/2.0 mL) 0 1 2 3 4 5 6

 Tabla 1.6 Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de reacción.

Tubos

Testigo P1 P2 P3 P4 P5 P6

0.5 0.05 0.10 0.15 0.30 0.50 0.80

Absorbancia ---- 0.154 0.214 0.387 0.630 0.858 1.176

λ=540nm

Velocidad 0 0.8045 1.1967 2.3274 3.9156 5.4058 7.4843

(unidades de
invertasa)

Azúcar 0 4.0228 5.9836 11.6372 19.5784 27.0294 37.4215

reductor
(µmoles/2.0ml)

Conc. De 0 5 5 5 5 5 5
sustrato

(moles/L=M)
  Tabla 1.7 Efecto de la concentración de los inhibidores sobre la velocidad de reacción.

Tubos

Testigo P1 P2 P3 P4 P5 P6

0.5 0.05 0.10 0.15 0.30 0.50 0.80

Absorbancia ---- 0.158 0.274 0.412 0.543 0.661 0.811

λ=540nm

Velocidad 0 0.8307 1.5888 2.4908 3.3470 4.1183 5.0986

(unidades de
invertasa)

Azúcar 0 4.1535 7.9444 12.4542 16.7352 20.5915 25.4934

reductor
(µmoles/2.0ml)

Conc. De 0 5 5 5 5 5 5
sustrato

(moles/L=M)

CÁLCULOS
 Por efecto de pH:

(𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎) 𝑦 = 𝑎 + 𝑏 𝑥 (𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛) … (1)

De la práctica anterior (Curva tipo de azúcares reductores) tenemos la ec. y = 0.0306 x + 0.0309, por lo que
sustituimos los valores de a y b en la ecuación (1), despejando x, la cual será la concentración de azúcares
reductores (AR), obteniendo:
𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎−0.0309
𝐴𝑅 = 0.0306
… (2)

Ejemplo para P4:

0.667 − 0.0309
𝐴𝑅 = = 20.7875 µmoles
0.0306
Para calcular la velocidad, tenemos la siguiente fórmula:
µmoles
𝑣0 = 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 = 𝑚𝑖𝑛
= 𝑈 …(3)

Ejemplo para P4:

 20.7875 µmoles
𝑣0 = = 1.3858 𝑈𝐼
15 𝑠

 Por efecto de la concentración

Para calcular los azúcares reductores utilizamos igual la ec. (2) y po steriormente para calcular
la velocidad la ec. (3) como se hizo anteriormente.

Ejemplo para P3:

0.304 − 0.0309
𝐴𝑅 = = 8.9248 µmoles
0.0306
8.9248 µmoles
𝑣0 = = 0.5949 𝑈𝐼
15 𝑠

Para calcular la concentración de la enzima, se utiliza la siguiente relación (ejemplo para P3):

10 µg enzima ------------- 1mL

x--------------0.3 mL

x= 3 µg/2.0 mL

Nota: Para el resto de las actividades experimentales, se realizaron los mismos cálculos que
anteriormente se describieron.

GRÁFICAS

1.6
y = 0.283x - 0.6382
1.4

1.2

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 1.2. Gráfica de Velocidad (unidades de invertasa) contra pH.

 1.6

1.4

1.2

0.8

0.6 y = 0.1x + 0.3216

R² = 0.1243
0.4

0.2

0
0 1 2 3 4 5 6 7

Figura 1.3. Gráfica de Conc. de la enzima (µg/2.0 mL) contra Velocidad (unidades de invertasa).