UNIVERSIDAD AUTÓNOMA JUAN MISAEL SARACHO

FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
CÁTEDRA DE ANÁLISIS INSTRUMENTALQMC 031
PRACTICA # 3

CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

1.- FUNDAMENTO.-

La cromatografía es una técnica analítica que permite la separación de los componentes de una
mezcla de acuerdo a la diferencia en su distribución entre dos fases inmiscibles: la fase estacionaria
(generalmente sólida) y la fase móvil (líquida o gaseosa). La distribución de los componentes entre
las fases se realiza de acuerdo al grado de afinidad química entre las moléculas.
La afinidad química puede explicarse a través de la premisa de que “lo semejante disuelve lo
semejante”. Se dice que dos moléculas son afines si son capaces de establecer fuerzas
intermoleculares (electrostáticas, dipolo-dipolo inducido, dipolo inducido-dipolo inducido,
químicas, etc.). La similitud se extiende en algunos casos a moléculas de tamaño y forma
semejante.

Como en la cromatografía es condición esencial que la fase estacionaria sea totalmente inmiscible
con la fase móvil, los analitos interactúan con dos moléculas totalmente distintas entre si. Se habla
de cromatografía en fase normal, si la fase estacionaria es polar y la fase móvil es apolar.

La cromatografía es una técnica que permite separar mezclas de compuestos Estrechamente

relacionados. En las separaciones cromatográficas, la mezcla se disuelve en una fase móvil (FM,
gas o sólido) y se hace pasar a través de una fase estacionaria inmiscible (FE, sólido o líquido
sobre un soporte sólido).
Las fases se eligen de forma que los componentes de la mezcla se distribuyan de modo distinto
entre ambas. Esto es posible debido a la influencia de dos efectos contrarios:

Retención: por interacción de los componentes de la mezcla con la fase estacionaria FE.
Elución o Desplazamiento: por interacción de los componentes con la fase móvil FM.

En general, la mezcla se deposita sobre la fase estacionaria y el paso de la fase móvil a través del
sistema da lugar a un desplazamiento distinto de sus componentes. La separación depende del
balance de las interacciones entre los componentes de la mezcla y las dos fases.

Hay muchos tipos de cromatografía dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria, de la fase

móvil, del tipo de interacciones que se establecen, etc. (ver Tabla 1). Vamos a centrarnos en la
cromatografía de adsorción sólido-liquido en la que se utiliza una fase estacionaria sólida o
adsorbente (FE) de carácter polar (p. ej. sílica-gel, alúmina) y una fase móvil líquida o eluyente
(FM). Las interacciones suelen ser tipo dipolo-dipolo o puentes de hidrógeno.
Los eluyentes más utilizados suelen ser disolventes orgánicos o mezclas de disolventes. La
interacción eluyente-molécula depende fundamentalmente de la polaridad del eluyente que viene
determinada por el grupo funcional que posee. Los eluyentes aparecen ordenados en la llamada
serie eluotrópica y algunos de los más usados son (de menos a más polar):

Hexanos(mezcla) < cloruro de metileno < acetato de etilo < etanol < metanol < agua < ácido acético

En general en la separación la retención y la selectividad del proceso dependen de:

a) La naturaleza del adsorbente, en nuestro caso sílica-gel, un sólido polar.

b) La naturaleza del eluyente, un disolvente o mezcla de disolventes. Se puede modular la
separación cambiando el eluyente.
c) La polaridad del compuesto: viene determinada por el número, naturaleza y disposición
relativa de sus grupos funcionales:
 Los compuestos poco polares se desplazan con facilidad incluso con eluyentes
(FM) poco polares, ya que interaccionan débilmente con el adsorbente (FE).
 Los compuestos más polares necesitan eluyentes (FM) más polares ya que
interaccionan fuertemente con el adsorbente (FE) y se desplazan con dificultad. En
algunos casos la interacción es tal que se desplazan en forma de punta de flecha,
como por ejemplo los ácidos carboxílicos.
En este laboratorio se utilizará la cromatografía analítica de capa fina (CCF) para analizar
una mezcla y comparar compuestos con patrones. Una CCF implica:

I) Preparación de la placa depositando la cantidad adecuada de cada muestra. Si la cantidad es

excesiva el soporte se satura y la elución da manchas alargadas; si es escasa, no se verá bien la
composición de la muestra.
II) Elución: Es necesario elegir el eluyente que distribuya los compuestos en el centro de la placa,
ni pegados al frente (eluyente demasiado polar), ni en la parte baja (eluyente poco polar).
Los compuestos polares se eluyen bien con eluyentes polares, y los poco polares, con eluyentes
poco polares.

III) Visualización de los compuestos: si son coloreados, basta la luz visible y sin son activos a
la luz ultravioleta, se utiliza una lámpara UV (si las placas contienen un indicador fluorescente).
En los otros casos se necesita un reactivo (revelador) que reaccionará con los productos sobre la
placa dando manchas coloreadas.
Algunos ejemplos son:

Aplicaciones de la CCF: La CCF es muy útil para:

a) Comprobar la pureza de un compuesto, ya que es una técnica muy sensible.
b) Determinar los componentes de una mezcla (si la polaridad de los componentes es muy distinta,
se deberán hacer CCF con eluyentes de distinta polaridad).
c) Identificar un compuesto cuando se dispone del patrón correspondiente.
Si se sospecha que una muestra desconocida X es un compuesto conocido A y se dispone de un
patrón del mismo, se colocan en la placa muestras de X, A y una mezcla de los dos X+A. Se eluye,
y si se observa una sola mancha en los tres casos, los compuestos deben ser idénticos. Esto permite
diferenciarlos incluso si su polaridad es muy parecida. Para asegurarlo se pueden hacer CCF con
distintos eluyentes y confirmar que el resultado es siempre el mismo.

d) Seguir la evolución de una reacción: haciendo CCF de la mezcla de reacción M a intervalos de

tiempo. P.ej., supongamos que estamos llevando a cabo la transformación A  B. Con patrones de
A y de B (si se dispone) se puede observar la velocidad a la que se consume A y se forma B.
Limitaciones: No es fácil separar compuestos de polaridad muy similar.
El estudio y caracterización de las distintas biomoléculas (azúcares, lípidos, proteínas, ácidos
nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su aislamiento y purificación a partir de mezclas
complejas como son los preparados de cualquier material biológico. Una de las técnicas
bioquímicas más clásicas y utilizadas para dicho fin es la cromatografía. La cromatografía
incluye una amplia gama de técnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento
físico-químico en el que se basa la separación (cromatografía de adsorción, de reparto, de
cambio iónico, de filtración molecular, hidrofóbica y de afinidad), o al material sobre el que se
lleva a cabo (cromatografía en papel, capa fina, en columna y de gases).
Todas las técnicas intentan explotar las diferencias físicas, químicas y biológicas de las
distintas biomoléculas para llevar a cabo su separación y aislamiento.
Entre dichas propiedades podríamos citar:

i) Diferencias en solubilidad en diferentes solventes, tanto orgánicos como acuosos.

ii) Diferencias en tamaño y forma.
iii) Diferencias en carga.
iv) Diferencias en afinidad por otras biomoléculas.

Todas estas propiedades y, por tanto, la separación de diferentes compuestos están influenciadas
por las condiciones del medio de separación, pH, temperatura, fuerza iónica e hidrofobicidad.

Hay una amplia gama de métodos colorimétricos que permiten la determinación cuali- y
cuantitativa de aminoácidos. El más general y utilizado es el de la reacción con la ninhidrina.
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el grupo
amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del
reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y
otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una
coloración azul-púrpura, con la excepción de la prolina que da una coloración amarillenta.
2.- OBJETIVOS.-

 Realizar la separación de una mezcla de ácidos orgánicos con sustancias orgánicas

neutras no polares y revelarlas su avance con luz ultravioleta.
 Desarrollar la separación cromatográfica de una mezcla de aminoácidos y revelar la
placa con rociado con solución de ninhidrina.
 Cálculo del valor de Rf para cada uno de los compuestos. Justificación de las
diferencias en Rf de los distintos aminoácidos.
 Identificación de la naturaleza de compuestos desconocidos, comparando con el avance
de muestras patrón.

3.- MATERIALES.-

 Bote de vidrio (Cámara Cromatográfica) (2)

 Probeta 10 mL
 Papel aluminio
 Cuentagotas plástico + Puntas para CCF (2)
 Cuentagotas de vidrio
 Pinzas metálicas de disección
 Placas de sílice
 Secador (1 por mesa)
 Atomizador casero.
 Lámpara UV

4.- REACTIVOS.-

Disolventes

Hexanos - Acetato de etilo [1:2]

Etanol – amoníaco (1:3): [7:3]

Compuestos patrón

 m-dinitrobenceno
 dibenzalacetona
 Ác. salicílico
 Ác. Benzoico

 Glutamato.
 Glicina.
 Lisina.
 Prolina.
 Leucina.
 Solución problema de aminoácidos.

Otros:
 Etanol.
 Hidróxido amónico.
 Ninhidrina.

5.- PARTE EXPERIMENTAL.-

I. Preparación:
● Antes de comenzar compruebe que todo el material y la zona de trabajo estén perfectamente
limpios y secos.
● Tome con las pinzas una placa para cromatografía ya cortada y deposítela en una zona
limpia y seca de la mesa. Con un lápiz dibuje una línea horizontal a aprox. 1 cm del borde
inferior de la placa. Sobre esta línea marque suavemente tantas X como muestras a analizar con
especial cuidado en no acercarse a los bordes. Bajo cada X anote con lápiz el código que indique a
que muestra corresponde.
IMPORTANTE: las placas no deben tocarse con los dedos en la zona plana.
● Introduzca en la/s cubeta/s de cromatografía el eluyente (aprox. 8 mL) y tape la cubeta con papel
de aluminio o un vidrio de reloj para evitar la evaporación. El nivel de líquido debe quedar por
debajo de la línea de la placa para que no pueda tocar la/s muestra/s.
● Disuelva una pequeña cantidad de la/s muestra/s a analizar en un disolvente volátil
intentando que la disolución no esté ni muy diluida ni muy concentrada.

II) Toma de muestra y depósito en la placa:

Sumerja una punta para CCF en la disolución y una pequeña cantidad de líquido ascenderá por
capilaridad. Apoye suavemente la punta en la X correspondiente sobre la placa y deje que la
disolución descienda hasta formar un pequeño círculo. La mancha debe ser lo más pequeña posible
para una separación óptima (aprox. 2 mm) y nunca debe solaparse con las contiguas.
Deje secar al aire y compruebe si hay suficiente muestra mirando la placa a la luz UV. Se deben ver
círculos morados oscuros en los puntos donde se ha depositado la muestra. Si no hay suficiente
cantidad puede añadir de nuevo, pero dejando secar antes de eluir.
Para comparar con patrones se hace directamente la mezcla de la muestra y el patrón (Mixto) sobre
la placa. El líquido que contiene la punta suele ser suficiente para depositar un poco en la X de la
muestra y poner un poco también en la X del toque mixto.

III) Elución: con ayuda de las pinzas introduzca cuidadosamente la placa en la cubeta (deje que
la parte superior se apoye ligeramente en la pared). Tape la cubeta y deje que ascienda el eluyente
por capilaridad. Asegúrese de que el frente del disolvente sube igual en toda la placa, si sube torcido
saque rápidamente la placa y consulte al profesor/a.
Cuando el frente del eluyente llegue a aprox. 0,5 cm del borde superior, saque la placa, marque con
lápiz la línea del frente (altura a la que ha llegado el eluyente) y deje evaporar el disolvente al aire
en la vitrina.

IV) Visualización de los compuestos:

a).- Separación de mezclas de ácidos y compuestos neutros
Utilice la lámpara UV para visualizar los compuestos y marque con lápiz el contorno de las
manchas. Dibuje la placa indicando forma y aspecto de las manchas.

b).- Separación de una mezcla de aminoácidos.

Terminada la cromatografía se saca la placa, se marca la distancia recorrida por el eluyente, se
seca dentro de la campana de gases con la ayuda de un secador de aire y se rocía con un
pulverizador que contiene la solución reveladora de Ninhidrina 0,2% p/v (en la campana de
gases). La placa se secará haciéndole llegar aire caliente con el secador.

6.- CUESTIONARIO.-

1. Para llevar a cabo una cromatografía de capa fina (CCF) es necesario un adsorbente y un
eluyente:
a) ¿Que función tiene el eluyente?, ¿cómo actúa?
b) ¿Qué función tiene al adsorbente?, ¿cómo actúa?
2. ¿Cómo podemos observar cuál es el resultado de una CCF?
3. a) ¿Qué puede ocurrir si se pone demasiada muestra en la CCF?
b) ¿Y si se pone demasiado poca?
4. Ordene los siguientes eluyentes según su polaridad:
a) agua, cloruro de metileno, hexanos
b) etanol, acetato de etilo, cloruro de metileno
5. Ordene los siguientes compuestos según su polaridad
a) acetato de etilo, ciclohexanona, ácido benzoico.
b) éter etílico, benzoato de metilo, anilina (fenilamina).
6. En el proceso de separación, un estudiante ha obtenido un ácido desconocido AH y sospecha que
es el ácido benzoico AB por lo que quiere compararlo por CCF. Dibuje cómo se verá la CCF si el
compuesto es ácido benzoico según el eluyente sea:

G 5 – 1,3
G 6 – 2,4
G 1 – Leu, Val, Lys
G 2 – Gly, Glu, Lys
G 3 – Val, Glu, Lys