Cultivos de células de insectos y mamíferos

INTRODUCCIÓN
La célula, considerada como la unidad estructural básica de la vida constituye a todos los
organismos vivos. Los organismos multicelulares superiores están formados por
diferentes tipos de células eucarióticas, las cuales tienen diversos tamaños, formas y
funciones especializadas, y, cuya coordinación y función específica lleva al desarrollo de
los mismos mediante la formación de tejidos y/u órganos, para dar como resultado un
organismo más complejo con capacidades mayores a las de sus componentes.
La sobrevivencia del organismo completo depende de la coordinación del metabolismo
de millones de células, las cuales individualmente llevan a cabo funciones específicas
tales como:
1) Nutrición, la cual se basa en la síntesis de sustancias primordiales para el metabolismo
primario a partir de los nutrientes obtenidos del exterior.
2) Relación intercelular, en la cual las células interaccionan y se comunican entre sí a
través de señales que determinan la función del tejido.
3) Reproducción, la cual permite la multiplicación a partir de una célula precursora
trayendo como consecuencia la obtención de células hijas con información genética
semejante a sus progenitoras. Esta última función se caracteriza por poseer memoria.
Estas similitudes fundamentales entre los diferentes tipos de células proporcionan un
marco común para la biología celular, permitiendo que los principios básicos puedan ser
extrapolados y generalizados a otros tipos de células. Es por ello que diversos tipos de
células y organismos son extensamente utilizados en cultivos celulares debido a su fácil
crecimiento y manipulación experimental.
Cultivo de células animales es el término general que se le ha dado al aislamiento de un
tipo específico de células provenientes de tejidos u órganos animales, que posteriormente
son colocadas en un ambiente artificial que favorece su división, crecimiento,
multiplicación y en algunos casos, diferenciación. El cultivo de células animales ha
permitido estudiar la actividad intracelular, los flujos metabólicos, las interacciones con
el medio ambiente, las interacciones célula-célula, la genética y la generación de
metabolitos de interés. Estos principios básicos han sido aplicados en muy diversas
disciplinas de las ciencias naturales, abarcando desde la biología celular, biología del
desarrollo y la fisiología (donde la generación de conocimiento básico está relacionada
con la estructura y función celular) hasta ciencias como la toxicología y farmacología
(donde el conocimiento es aplicado a las ciencias farmacéuticas).
Por otra parte, el uso de cultivos celulares animales dentro de la biotecnología
farmacéutica se ha incrementado en los últimos años, ya que éstos permiten la producción
de manera casi exclusiva de biológicos y biofármacos complejos (tales como vacunas
tradicionales y recombinantes, proteínas recombinantes glicosiladas, anticuerpos
monoclonales, vectores virales para terapia génica, etc.). Esto es debido a que brindan
dos características fundamentales para la actividad de un biofármaco como son el
plegamiento correcto de las proteínas y la glicosilación compleja, además de que es
posible que secreten el biofármaco al medio de cultivo. Además, la generación in vitro de
órganos y tejidos (ingeniería de tejidos) cuyo potencial económico está rebasando las
expectativas en los últimos años está marcando otra línea divisoria en el tratamiento de
transplantes y medicina reconstructiva.
Por ello, y dada la importancia de este tipo de cultivos dentro del área farmacéutica, en
esta revisión se presentan los aspectos fundamentales del cultivo de células, así como su
aplicación para la producción de biológicos y biofármacos de alto valor agregado.

MARCO TEÓRICO
I. Historia del cultivo de células animales en la producción de biológicos
y biofármacos
Los orígenes del cultivo de células animales se remontan a mediados del siglo XIX, donde
el desarrollo de las técnicas microbiológicas y del cultivo de bacterias empezaron a
ofrecer a los científicos de aquella época la posibilidad y la visión de realizar cultivos de
cepas específicas de manera aislada. No obstante, la historia “formal” de éste comenzó a
finales del siglo XIX cuando se hicieron los primeros intentos para promover el
crecimiento de órganos de diferentes animales sumergiéndolos en fluidos biológicos. Sin
embargo, no es hasta 1907 cuando se considera al cultivo celular como un método para
estudiar el comportamiento de las células animales independientemente de las variaciones
sistémicas. En estos años se realizaron los primeros experimentos exitosos para mantener
viables ciertos conjuntos de células no disgregadas o explantes de diferentes tejidos, pero
el crecimiento solamente se limitó a la migración de células desde el tejido con la
ocasional presencia de mitosis.
A partir de la década de 1920 se inició el subcultivo de fibroblastos, pero no es hasta 1943
cuando se estableció la primera línea celular continua de fibroblastos de ratón. En 1952
se generó la primera línea celular de origen humano (HeLa) a partir de un carcinoma
cervical derivado de la presencia del virus de papiloma serotipo 18 siendo actualmente
una de las líneas celulares mas ampliamente utilizada con diferentes fines. Lo anterior,
junto con el desarrollo de otras líneas celulares en cultivo, dio pauta para iniciar la
propagación viral en líneas celulares, culminando en la producción a gran escala de
vacunas tales como la de la polio (1954), y, posteriormente, las de la rabia y la rubéola
(1964-1969) entre otras aplicaciones. Dado que el cultivo de células a partir de un tejido
primario se usó ampliamente en esta época y por más de 50 años, éste recibió el nombre
genérico de “cultivo de tejidos”, aunque actualmente el uso del cultivo de células
dispersas de un solo linaje celular es mucho más utilizado. Innovaciones tales como el
desarrollo de medios de cultivo, el uso de antibióticos, las técnicas de tripsinización para
el pasaje de células y el suplemento con suero fetal bovino del medio de cultivo,
permitieron el desarrollo de cultivos de células animales de diferentes orígenes.
En los años 1960’s se establecieron las dos líneas celulares más utilizadas para la
producción de biofármacos en la actualidad, las cuales son las células CHO (Chinese
Hamster Ovarium) y la línea BHK21 (Baby Hamster Kidney), la cual proviene de riñón
de cría de hámster. Sin embargo, su uso para este fin fue explotado principalmente a partir
de los años 1980´s. El desarrollo de diferentes líneas celulares continuas de origen
linfoblástico empezó a reflejar los riesgos en el manejo de líneas celulares dándose a
conocer la posible contaminación cruzada con células HeLa en varios linajes celulares. A
partir de los años 1970’s y con los logros obtenidos manipulando el ADN, los métodos
que posteriormente conformarían lo que hoy conocemos como tecnología del ADN
recombinante, se realizaron los primeros ensayos de transferencia de ADN en células
animales. En esta década, también se desarrolló el primer linaje celular “artificial”
proveniente de células murinas denominado hibridoma, el cual fue diseñado
originalmente para la producción de anticuerpos monoclonales con aplicación
terapéutica. Sin embargo, la presencia de virus murinos endógenos en el sistema biológico
limitaron en aquella época esta aplicación, desarrollándose primeramente su uso como
herramienta diagnóstica la cual es explotada ampliamente hasta nuestros días. Asimismo,
se inició el estudio de la totipotencialidad de las células madre embrionarias, cuyo
desarrollo actual se ve de manifiesto en la Ingeniería de Órganos y Tejidos.
En los años 1980’s, el avance en investigación básica a lo largo de décadas de estudio se
puso de manifiesto cuando se identificaron los mecanismos de regulación de la expresión
genética, dándose a conocer la regulación del ciclo celular, y desarrollándose líneas
celulares especializadas así como los primeros cultivos para reconstitución de piel. En
esta época se llevó a cabo, por primera vez, la producción de la primer proteína
recombinante en células de mamífero, constituyéndose en el primer biofármaco
producido por ingeniería genética en este tipo de sistemas. A partir de la década de 1990,
el incremento en la producción de biofármacos utilizando la tecnología del cultivo de
células animales modificadas por medio de la tecnología del ADN recombinante aumentó
de manera exponencial debido a que las proteínas recombinantes generadas en sistemas
bacterianos, de levaduras ó por medio del cultivo de células vegetales no tenían la calidad
requerida por la industria biofarmacéutica en comparación con el producto generado por
medio del cultivo de células animales. En esta década, se ponen de manifiesto las ventajas
fundamentales que ofrece la generación de biofármacos por medio de esta tecnología
sobre otros sistemas de producción para la producción de proteínas de interés
farmacéutico. Tales ventajas son: el plegamiento correcto de la proteína (la proteína
traducida adquiere su estructura tridimensional correcta en el interior del retículo
endoplásmico y en el citoplasma); la glicosilación compleja (en el retículo endoplásmico
y aparato de Golgi de las células animales se agregan cadenas complejas de azúcar en
sitios específicos, produciéndose la O, la S ó la N glicosilaciones, lo que brinda actividad
a la proteína, dirige a sitios blanco y permite un mayor tiempo de vida media de ésta en
el torrente sanguíneo), y, la secreción del producto al medio de cultivo en la mayoría de
los casos (facilitando el proceso de purificación posterior). Así, el estudio de las
condiciones, parámetros y medios de cultivo para lograr que el sistema de expresión en
células animales fuera competitivo impulsó el conocimiento en el área de la bioingeniería,
ayudando al diseño de nuevos tipos de reactores y modos de operación que permitieron
incrementar las productividades, con lo cual los cultivos celulares se convirtieron en una
alternativa para la industria biofarmacéutica. Asimismo, el uso de células de insecto como
sistema de producción de proteínas recombinantes por medio de la infección con
baculovirus es al día de hoy una realidad como sistema de expresión recombinante.
Por otra parte, el cultivo de órganos, la ingeniería de tejidos y el cultivo de células
embrionarias eran ya actividades rutinarias a finales del siglo pasado a nivel de ciencia
básica. Ya en el siglo XXI, con la genómica y el desarrollo del Proyecto del Genoma
Humano, se ha despertado el interés por otras “ómicas”: como son la proteómica,
metabolómica, farmacogenómica, transcriptómica, glicómica, interactómica, etc. La
necesidad de cultivos de células animales como base ineludible de la ingeniería de tejidos,
de órganos y en terapia génica, impulsa a una reconceptualización de la medicina y de la
farmacia actuales. Dado que este tema marca todo un novedoso desarrollo, se considera
que es materia de otro artículo por lo que no se desarrollará ampliamente aquí. Es
necesario aclarar que aún cuando en la actualidad el cultivo de células animales ha
ofrecido las ventajas en la producción de proteínas glicosiladas complejas, también
presenta limitantes importantes al compararlo con otros sistemas de expresión de
biofármacos, tales como bacterias y levaduras recombinantes. Dichas limitantes son los
largos tiempos de cultivo, ocasionados por las bajas velocidades de crecimiento; el uso
de suplementos (tales como el suero de diferentes mamíferos) y medios de cultivo
costosos (principalmente aquéllos que son definidos); la fragilidad de las células a los
esfuerzos de corte por lo que los reactores utilizados tienen diseños especiales en los
sistemas de agitación y aireación, los cuales están en constante optimización. Si bien la
baja cantidad de producto obtenido por las bajas densidades celulares alcanzadas al día
de hoy es una limitante parcial debido a que con el uso de sistemas en perfusión se llegan
a obtener densidades celulares del orden de 1.5 X 107 cel/ml, todavía la cantidad de
proteína recombinante sigue siendo menor a la generada en bacterias recombinantes,
aunque el sistema de células de insecto-baculovirus es una buena alternativa cuando las
proteínas a obtener no requiere glicosilaciones complejas. Otra limitante parcial es la
potencial presencia de virus animales en los productos biofarmacéuticos, los cuales son
principalmente huéspedes endógenos de las líneas celulares productoras, al día de hoy,
este problema se ha resuelto mediante el uso de sistemas de detección viral confiables,
restringiendo el uso de suplementos potencialmente contaminados como es el suero de
origen animal y por la operación unitaria de inactivación viral al final del proceso de
producción.

II. Clasificación de cultivo celular

El cultivo celular se define como el conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento,
la supervivencia y/o multiplicación in vitro de células provenientes de órganos
específicos o de linajes celulares tratando de conservar al máximo sus propiedades
fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Una de estas propiedades es la capacidad de
adherencia a superficies, lo que permite que las células crezcan ya sea en monocapa o en
suspensión. Esta propiedad de adherencia está en general asociada con el tipo de célula
de la cual derivan y depende del tipo de proteínas presentes en su superficie. Se sabe que
muchos cultivos celulares se encuentran anclados a una superficie celular debido a que
sintetizan proteínas relacionadas con la matriz extracelular la cual está encargada de
mantener unidas a las células y posee un papel regulador sobre las mismas in vivo.
Algunas de las macromoléculas involucradas son la colágena, la fibronectina, la laminina
y el proteoglucano, las cuales establecen interacciones con las proteínas de la membrana
citoplásmica de la célula, denominadas integrinas, CAMs y cadherinas. Estas proteínas
además de mantener unidas a las células también participan en la transmisión de señales
del exterior hacia el interior de las células. En cultivos en monocapa, la interacción de
este conjunto de proteínas se da por medio de las adhesiones focales.
1. Los cultivos en monocapa: representan una de las formas de crecimiento in vitro
de las células provenientes de cultivos primarios o de líneas celulares
dependientes de anclaje. En general, las células que se desarrollan de esta manera
son estables genéticamente y tienen una naturaleza diploide normal. La monocapa
celular crece (confluencia) cubriendo la superficie de soporte hasta que se
establece contacto entre las células, lo que causa que éstas detengan su
crecimiento (quiescencia). Existen algunas líneas celulares que tienen la
capacidad de crecer tanto en monocapa como en suspensión (células de insecto,
BHK21, hibridomas), sin embargo son muy pocas las que tienen esta dualidad.
2. El crecimiento en suspensión se presenta en células cuya naturaleza es de ese
tipo como en el caso de células hematopoyéticas o en aquéllas que han perdido o
disminuido la síntesis de proteínas de anclaje y no desarrollan el proceso de
quiascencia como es el caso de algunas líneas celulares transformadas
artificialmente o de células procedentes de tumores. Las células que provienen de
cultivos primarios con requerimiento de anclaje a superficies pueden ser
adaptadas a crecer en suspensión después de ser sometidas a una serie de
subcultivos, al hacer modificaciones genéticas o cambiando el medio de cultivo.
Los cultivos continuo21 y de perfusión ofrecen ventajas económicas decisivas
cuando se trata de aumentar la escala de operación en células en suspensión.

3. Con los cultivos tridimensionales se busca mantener la arquitectura in vivo del

tejido de origen. En el caso del epitelio, los sistemas tridimensionales permiten
estudiar la proliferación, morfología e interacciones intra e inter celulares. De
igual forma se puede evaluar el efecto de sustancias que pueden afectar tales
interacciones. En este tipo de cultivo es posible mantener los tipos celulares
diferenciados y es por ello una buena réplica del tejido de origen, sin embargo, la
propagación celular es dependiente de las características de la biomatríz o soporte.
Por otro lado, el cultivo de células animales presenta principalmente tres morfologías
(Figura 1B) las cuales son linfoblástica, fibroblástica y epitelial (polihédrica). Estas
morfologías están relacionadas con el origen del tejido primario. Las líneas con
morfología linfoblástica crecen en suspensión mientras que las dos últimas crecen en
forma adherente. Sin embargo, la morfología de la célula propia depende de las
características también del soporte. Es decir, cuando las células se despegan, tienden a
formar esferas, sin embargo, en el momento que se adhieren vuelven a adquirir una forma
específica. En biotecnología, las líneas de origen linfoblástico, como son los hibridomas,
ofrecen grandes ventajas dada su facilidad de crecer en suspensión, ya que la
manipulación de ellas es mucho más sencilla. De hecho, a nivel industrial, el uso de líneas
modificadas genéticamente para subsanar el problema de la adherencia ha sido muy
socorrido en los últimos años permitiendo el desarrollo de líneas en suspensión con
crecimiento a altas densidades celulares.
Por otra parte, el mantenimiento a corto plazo de un cultivo celular se realiza por el
subcultivo del mismo en cual puede conducir a modificaciones genéticas que pueden
repercutir en su fenotipo, sin embargo, esto no siempre sucede. Además, estas
modificaciones también pueden ser inducidas por medio de la inserción de plásmidos
específicos, lo que da origen a cultivos con diferentes propiedades. Este cambio en el
fenotipo puede explotarse para un fin común considerando la maquinaria biológica de las
células, abarcando desde el análisis propio de la función biológica, el estudio de
enfermedades o el desarrollo de plataformas biotecnológicas para la producción de
proteínas recombinantes y vacunas. Los diferentes tipos de cultivos celulares se muestran
en la Figura 2.
III. Medios de cultivo
Tipo de medio Ejemplos Usos
Medios Fluidos plasma, suero, linfa, suero de
naturales biológicos cordón umbilical humano,
fluido amniótico
Extractos de Extracto de hígado, bazo,
tejidos tumores, leucocitos y médula
ósea, extracto de embrión de
vaca o de pollo
Coágulos coagulantes o coágulos de Forma la base de
plasma medios complejos
Medios Soluciones PBS, DPBS, HBSS, EBSS Cultivos primarios
artificiales salinas y diploides
balanceadas
Medios basales MEM DMEM Mantiene una
amplia gama de
células de
mamíferos
Medios RPMI-1640, IMDM Forma la base de
complejos medios complejos

1. Medios naturales
Los medios naturales consisten únicamente de fluidos que existen naturalmente. Los
medios naturales son muy útiles y prácticos para el cultivo de una amplia gama de células
animales. La principal desventaja de los medios naturales es su baja reproducibilidad
debido a la falta de conocimiento de su composición exacta.
2. Medios artificiales
Los medios artificiales o sintéticos se preparan agregando nutrientes (tanto orgánicos
como inorgánicos), vitaminas, sales, fases gaseosas de O2 y CO2, proteínas del suero,
carbohidratos, y cofactores.
Diferentes medios artificiales han sido diseñados para servir a uno o más de los siguientes
propósitos:
 Supervivencia inmediata (solución balanceada de sales, con pH y presión
osmótica específicos).
 Supervivencia prolongada (solución balanceada de sales complementada con
varias formulaciones de compuestos orgánicos y/o suero).
 Crecimiento indefinido.
 Funciones especializadas.
Los medios artificiales se agrupan en cuatro categorías:
A. Medios que contienen suero
El suero fetal bovino es el suplemento más común en los medios de cultivo de células
animales. Se trata de un complemento de bajo costo que proporciona un medio de cultivo
óptimo. El suero provee portadores o quelantes de nutrientes lábiles o insolubles en agua,
hormonas y factores de crecimiento, inhibidores de proteasas, y se une y neutraliza
sustancias tóxicas.
B. Medios libres de suero
La presencia de suero en el medio tiene varias desventajas y puede llevar a graves
malinterpretaciones en estudios inmunológicos. Se han desarrollado varios medios libres
de suero. Estos medios en general han sido diseñados específicamente para el cultivo de
un tipo celular en particular e incorporan cantidades definidas de factores de crecimiento
purificados, lipoproteínas, y otras proteínas, que de otra manera serían provistas por el
suero. Estos medios también son conocidos como “medios de cultivo definidos” ya que
sus componentes son conocidos.
C. Medios químicamente definidos
Estos medios contienen ingredientes orgánicos e inorgánicos ultra puros libres de
contaminación, y pueden contener también aditivos proteicos puros, como factores de
crecimiento. Sus componentes son producidos mediante ingeniería genética en bacterias
o levaduras con la adición de vitaminas, colesterol, aminoácidos específicos y ácidos
grasos.
D. Medios libres de proteínas
Los medios libres de proteínas no contienen ninguna proteína y sólo poseen componentes
no proteicos. Comparados con los medios complementados con suero, los medios libres
de proteínas promueven un crecimiento celular y una expresión proteica superior y
facilitan la purificación posterior de cualquier producto expresado. Formulaciones como
MEM, RPMI-1640 no contienen proteínas y pudiéndose utilizar un suplemento proteico
según se requiera.

IV. Componentes básicos del medio de cultivo

Los medios de cultivo contienen una mezcla de aminoácidos, glucosa, sales, vitaminas, y
otros nutrientes, y se encuentran disponibles comercialmente tanto en polvo como
líquidos. Los requerimientos de estos componentes varían entre líneas celulares, y estas
diferencias son en parte responsables del gran número de formulaciones de medios de
cultivo. Cada componente tiene una función específica, como se describe más abajo:
1. Sistemas de tamponado
La regulación del pH es crítica para establecer las condiciones óptimas de cultivo y en
general se logra mediante uno de los siguientes sistemas de tamponado:
2. Sistema de tamponado natural
En un sistema de tamponado natural, el CO2 gaseoso se equilibra con el contenido de
CO3/HCO3 del medio de cultivo. Los cultivos con sistema natural de tamponado
necesitan de una atmósfera con 5-10% CO2, generalmente mantenida por un incubador
de CO2. El sistema de tamponado natural es de bajo costo y no es tóxico.
3. HEPES
El tamponado químico que utiliza un zwitterión, HEPES, posee una capacidad de
tamponado superior en el rango 7,2-7,4 y no requiere de una atmósfera gaseosa
controlada. El HEPES es relativamente caro y tóxico para algunos tipos celulares a
concentraciones más altas.
4. Rojo de fenol
La mayoría de los medios de cultivo disponibles comercialmente incluyen un indicador
de pH que permite el control constante del pH. Durante el crecimiento celular el medio
cambia de color al cambiar el pH debido a los metabolitos liberados por las células. A
valores de pH bajos, el rojo de fenol torna el medio color amarillo, mientras que a valores
de pH superiores torna el medio color púrpura. El medio es de color rojo brillante a pH
7,4, el valor óptimo para el cultivo celular. Sin embargo, el uso del rojo de fenol tiene
algunas desventajas asociadas tal como se describe abajo:
 El rojo de fenol imita la acción de algunas hormonas esteroides, particularmente
del estrógeno. Por tanto, es aconsejable utilizar medios sin rojo de fenol en
estudios con células sensibles al estrógeno como el tejido mamario.
  La presencia del rojo de fenol en algunas formulaciones libres de suero interfiere
con la homeostasis del sodio y el potasio. Este efecto puede ser neutralizado por
la adición de suero o de hormona pituitaria bovina en el medio.
 El rojo de fenol interfiere con la detección en los estudios de citometría de flujo.
5. Sales inorgánicas
Las sales inorgánicas en el medio ayudan a mantener el equilibrio osmótico y a regular el
potencial de membrana al proporcionar iones de sodio, potasio y calcio.
6. Aminoácidos
Los aminoácidos son los bloques de construcción de las proteínas, y por tanto son
ingredientes obligatorios de todos los medios de cultivo conocidos. Se necesitan para la
proliferación celular y su concentración determina la densidad celular máxima
alcanzable. La L-glutamina, un aminoácido esencial, es particularmente importante. La
L-glutamina provee nitrógeno para el NAD, el NADPH y los nucleótidos y sirve como
una fuente de energía secundaria para el metabolismo. La L-glutamina es un aminoácido
inestable que, con el tiempo, se convierte en sustancias que no pueden ser utilizadas por
las células, y por lo tanto debe ser agregada al medio justo antes de su uso. Se debe tener
precaución a la hora de añadir más L-glutamina que la determinada en la formulación
original ya que su degradación resulta en la acumulación de amoníaco, y el amoníaco
puede ser perjudicial para algunas líneas celulares. La concentración de L-glutamina para
el cultivo de células de mamíferos puede variar entre 0,68 mM en el Medio 199 a 4 mM
en el Medio de Eagle modificado por Dulbecco. Los medios de cultivo de células de
invertebrados pueden llegar a contener 12,3 mM de L-glutamina. Suplementos como el
glutamax son más estables y pueden remplazar a la glutamina en el cultivo prolongado
de células de crecimiento lento. También se pueden añadir aminoácidos no esenciales al
medio de cultivo para reemplazar aquellos que han sido consumidos durante el
crecimiento. La suplementación de los medios con aminoácidos no esenciales estimula el
crecimiento y prolonga la viabilidad de las células.
7. Carbohidratos
Los carbohidratos en la forma de azúcares son la principal fuente de energía. La mayoría
de los medios contienen glucosa y galactosa, sin embargo, algunos contienen maltosa y
fructosa.
8. Proteínas y péptidos
Las proteínas y péptidos utilizados con mayor frecuencia son la albúmina, la transferrina
y la fibronectina. Son particularmente importantes en medios que no contienen suero. El
suero es una fuente rica de proteínas e incluye albúmina, transferrina, aprotinina, fetuina
y fibronectina. La albúmina es la proteína principal en la sangre que une agua, sales,
ácidos grasos libres, hormonas y vitaminas, y los transporta entre tejidos y células. La
capacidad de unión de la albúmina permite eliminar substancias tóxicas de los medios de
cultivo.
La aprotinina es un agente protector en los sistemas de cultivo, estable a pH neutro y
ácido y resistente a altas temperaturas y a la degradación por enzimas proteolíticas. Tiene
la capacidad de inhibir varias proteasas de serina tales como la tripsina. La fetuina es una
glicoproteína que se encuentra en mayores concentraciones el suero fetal y de los recién
nacidos que en el de los adultos. También es un inhibidor de proteasas de serina. La
fibronectina es un factor clave en adhesión celular. La transferrina es una proteína
transportadora de hierro que suministra hierro a la membrana celular.
9. Ácidos grados y lípidos
Son particularmente importantes en los medios libres de suero ya que generalmente se
encuentran presentes en el suero.
10. Vitaminas
Muchas vitaminas son esenciales para el crecimiento y la proliferación de las células. Las
vitaminas no pueden ser sintetizadas en cantidades suficientes por las células y son, por
tanto, suplementos importantes para el cultivo de tejidos. Nuevamente, el suero es la
principal fuente de vitaminas en los cultivos celulares, sin embargo, los medios son
enriquecidos con diferentes vitaminas, haciéndolos apropiados para una línea celular
particular. Las vitaminas del grupo B son adicionadas por lo general para la estimulación
del crecimiento.
11. Oligoelementos
Los medios libres de suero suelen suplementarse con oligoelementos. Oligoelementos
como el cobre, zinc, selenio y los intermediarios del ácido tricarboxílico son elementos
químicos que se necesitan en minúsculas cantidades para el correcto crecimiento celular.
Estos micronutrientes son esenciales para muchos procesos biológicos, por ejemplo, el
mantenimiento de la funcionalidad de enzimas.
12. Suplementos para medios
Los medios completos de crecimiento recomendados para ciertas líneas celulares
requieren de componentes adicionales que no se encuentran presentes en los medios
basales ni en el suero. Si bien suplementos como hormonas, factores de crecimiento y
substancias de señalización son requeridos para el normal crecimiento de algunas líneas
celulares, siempre es mejor tomar las siguientes precauciones: ya que la adición del
suplemento puede alterar la osmolalidad del medio de cultivo completo, lo que puede
afectar negativamente el crecimiento de las células, siempre es mejor comprobar
nuevamente la osmolalidad tras añadir el suplemento. Para la mayoría de las líneas
celulares, la osmolalidad óptima se encuentra entre 260 mOSM/kg y 320 mOSM/kg.
La caducidad del medio de cultivo cambia al añadir suplementos. Los medios completos
que contienen un complemento proteico suelen degradase más rápido que el medio basal
solo.
13. Antibióticos
Si bien no son necesarios para el crecimiento celular, los antibióticos suelen utilizarse
para controlar el crecimiento de bacterias y hongos contaminantes. No se recomienda el
uso rutinario de antibióticos para el cultivo celular ya que pueden enmascarar la
contaminación por micoplasma y bacterias resistentes. Además, los antibióticos pueden
interferir en el metabolismo de células sensibles.
14. Suero en los medios
El suero es una mezcla compleja de albúminas, factores de crecimiento e inhibidores del
crecimiento. El suero es uno de los componentes más importantes de los medios de cultivo
celular y sirve como fuente de aminoácidos, proteínas, vitaminas (particularmente
vitaminas liposolubles como la A, D, E y K), carbohidratos, lípidos, hormonas, factores
de crecimiento, minerales y oligoelementos. El suero de ternero o feto bovino suele
utilizarse para propiciar el crecimiento de células en cultivo. El suero fetal es una fuente
rica en factores de crecimiento y es apropiado para el clonado celular y el crecimiento de
células delicadas. El suero de ternero se utiliza en estudios de inhibición por contacto ya
que promueve menos el crecimiento. Los medios de crecimiento normales suelen
contener 2 a 10 % de suero:

 El suero proporciona los nutrientes básicos para las células (tanto en solución como
unidos a proteínas).
 El suero provee varios factores de crecimiento y hormonas involucradas en
promover el crecimiento y funciones celulares especializadas.
  Proporciona varias proteínas de unión como la albúmina y la transferrina, las cuales
pueden transportar otras moléculas a la célula. Por ejemplo: la albúmina transporta
lípidos, vitaminas, hormonas, etc. hasta las células.
 También proporciona proteínas, como la fibronectina, que promueve la adhesión
celular al substrato. También provee factores de extensión que ayudan a las células
a extenderse antes de comenzar a dividirse.
 Proporciona inhibidores de proteasas que protegen a las células de la proteólisis.
 También proporciona minerales, como Na+, K+, Zn2+, Fe2+, etc.
 Aumenta la viscosidad del medio y, por tanto, protege las células del daño
mecánico durante la agitación de cultivos en suspensión.
 También actúa como tampón.

Debido a la presencia tanto de factores de crecimiento como inhibidores, el papel del

suero en el cultivo celular es muy complejo. Desafortunadamente, aunque sirve para
varias funciones, el uso de suero en el cultivo de tejidos tiene varios inconvenientes.
Ventajas del suero en los medios Desventajas del suero en los medios
El suero contiene varios factores de Falta de uniformidad en la composición del
crecimiento y hormonas que estimulan suero
el crecimiento y funciones celulares.
Ayuda en la adhesión de las células En necesario analizarlo para mantener la
calidad de cada lote previo a su uso
Actúa como un factor de extensión Puede contener alguno de los factores de
inhibición
Actúa como agente tamponador y Aumenta el riesgo de contaminación
ayuda a mantener el pH del medio de
cultivo
Funciona como proteína de unión La presencia de suero en el medio puede
interferir con la purificación y el
aislamiento de productos del cultivo celular
Minimiza los daños mecánicos
causados por viscosidad

V. Cultivo de células de mamífero

1. Aislamiento de células
Las células pueden ser aisladas de los tejidos para cultivos in vitro de muchas
maneras. Las células pueden ser purificadas con facilidad de la sangre, sin embargo,
sólo los leucocitos son capaces de crecer en cultivo.
Las células mononucleares se pueden liberar de los tejidos blandos
mediante hidrólisis enzimática con enzimas como la colagenasa, tripsina o pronasa,
que degradan la matriz extracelular. Como alternativa se pueden colocar trozos de
tejido en medio de crecimiento, y las células que crecen son aptas para el cultivo.
Este método es el conocido como cultivo de explantos.
Las células que se cultivan directamente desde un sujeto se conocen como células
primarias. A excepción de algunos derivados de tumores, la mayoría de los cultivos
celulares primarios tienen un periodo de vida limitado. Después de un cierto número
de divisiones las células entran en el proceso de senescencia y dejan de dividirse,
generalmente manteniendo la viabilidad.
2. Mantenimiento de células en cultivo
Las células se cultivan y mantienen a una apropiada temperatura y mezcla
de gases (habitualmente, 37°C, 5% CO2 y 95% O2) en un incubador celular. Las
condiciones de cultivo varían ampliamente para cada tipo celular, y la variación de
las condiciones para un tipo celular concreto, puede dar lugar a la expresión de
diferentes fenotipos.
Además de la temperatura y la mezcla de gases, el factor más comúnmente variado
en los sistemas de cultivo es el medio de crecimiento para cultivo celular. Las recetas
para los medios de crecimiento pueden variar
en pH, concentración de glucosa, factores de crecimiento y la presencia de otros
componentes nutritivos. Los factores de crecimiento usados para suplementar a los
medios derivan a menudo de sangre animal, como el suero bovino. Estos ingredientes
derivados de la sangre plantean una potencial contaminación con virus o priones de
los productos farmacéuticos derivados. En la actualidad se tiende a minimizar o
eliminar el uso de estos ingredientes cuando sea posible. Estrategias alternativas de
abastecimiento involucran la sangre de los animales procedentes de países con un
riesgo mínimo de encefalopatía espongiforme bovina, como Australia y Nueva
Zelanda, y el uso de nutrientes purificada concentrados derivados de suero en lugar
de suero animal entero para el cultivo de células.
Las células pueden crecer en suspensión o de manera adherente. Algunas células
viven de forma natural sin adherirse a una superficie, como las que existen en el
torrente sanguíneo. Otras necesitan una superficie, como la mayoría de células
derivadas de tejidos sólidos. A las células que crecen sin unirse a una superficie se
las llama cultivos en suspensión. Algunos cultivos celulares adherentes pueden
crecer en plástico para el cultivo de tejidos, que puede estar recubierto con
componentes de la matriz extracelular para aumentar sus propiedades de adhesión y
proporcionar otras señales necesarias para el crecimiento y diferenciación. Otro tipo
de cultivo adherente es el cultivo organotípico que consiste en cultivar las células en
un ambiente tridimensional a diferencia de las placas de cultivo bidimensionales.
Este tipo de cultivo 3D es bioquímica y fisiológicamente similar al tejido vivo. Sin
embargo presenta dificultades técnicas debido a varios factores (por ejemplo:
difusión).
3. Manipulación de las células en cultivo
Al estar generalmente las células en continua división durante el cultivo, es normal
que crezcan hasta ocupar toda el área o volumen disponible. Esto puede generar
varios problemas:Agotamiento de los nutrientes del medio

 Acumulación de células apoptóticas o necróticas

 Inhibición de la división celular por contacto: los contactos entre células pueden
desencadenar un arresto del ciclo celular
 Diferenciación celular promiscua provocada por los contactos intercelulares
Estos problemas pueden afrontarse mediante métodos de cultivo celular
en esterilidad. El objetivo de estos métodos es evitar la contaminación
con bacterias o levaduras que competirían por los nutrientes y/o podrían infectar y
así eliminar las células.
 Toda manipulación se lleva a cabo, típicamente, en una campana de flujo
laminar para evitar la entrada de microorganismos contaminantes. También pueden
añadirse antibióticos al medio de cultivo.
Entre las manipulaciones más comunes llevadas a cabo en cultivos celulares, se
encuentran los cambios de medio, el pase de las células y la transfección.
4. Cambios de medio
El objetivo de los cambios de medio es renovar los nutrientes y evitar la acumulación
de productos metabólicos potencialmente tóxicos y de células muertas. En el caso de
las suspensiones celulares, las células se separan del medio
mediante centrifugación y se resuspenden en medio fresco. En los cultivos
adherentes, el medio puede eliminarse directamente mediante aspiración y
reemplazarse por el fresco.
5. Pase de las células
El pase de las células supone transferir un pequeño número de células a un nuevo
continente. Las células pueden cultivarse más tiempo si se pasan regularmente, ya
que así se evita la senescencia asociada a situaciones prolongadas de alta densidad
celular. Con cultivos en suspensión el pase se hace fácilmente, tomando una pequeña
cantidad de cultivo que contenga unas pocas células y diluyéndola en un volumen
mayor de medio fresco. En cultivos adherentes, las células han de ser inicialmente
despegadas; esto se efectúa comúnmente con una mezcla de tripsina y EDTA,
aunque actualmente existen otras mezclas de enzimas para esto. Un pequeño número
de las células despegadas pueden sembrarse en un nuevo continente.
6. Transfección y transducción
Otro método común en la manipulación de las células es la introducción de un DNA
externo por transfección. Esto se lleva a cabo a menudo para conseguir que las células
expresen una proteína de interés. Más recientemente, la transfección de RNA
interferentes se han llevado a cabo como mecanismos adecuados para suprimir la
expresión de un particular gen.
El DNA también puede ser introducido en las células usando virus, en métodos
llamados transducción, infección o transformación. Los virus, como agentes
parásitos, son adecuados para introducir DNA en células, ya que esto forma parte de
su ciclo normal de reproducción.
7. Líneas celulares humanas establecidas
Las líneas celulares originadas a partir de tejido de seres humanos presentan
controversias bioéticas, ya que pueden sobrevivir a los organismos parentales y ser
utilizadas para el descubrimiento de tratamientos médicos muy lucrativos después
del fallecimiento de las personas que las produjeron. Una decisión pionera en este
aspecto fue el fallo de la Suprema Corte de California que en 1990 determinó que los
pacientes no tienen derechos propietarios sobre las líneas celulares derivadas de
órganos retirados con su consentimiento. Se estima que aproximadamente el 20% de
las líneas celulares humanas no corresponden al tipo de células que generalmente se
asume que son. Esto se debe a que algunas líneas celulares crecen más rápido que
otras y pueden contaminar cultivos de otras líneas celulares y, con el tiempo,
sobrecrecer y desplazar a las células originales. El contaminante más común es la
 línea celular HeLa. Este hecho no es significativo cuando se estudian la propiedades
generales del metabolismo celular pero es muy importante en la investigación
médica enfocada en un tipo específico de células. Los resultados de tales
investigaciones contendrán errores, si no están completamente equivocados en sus
conclusiones, con posibles consecuencias para los desarrollos terapeúticos basados
en ellos.
8. Generación de hibridomas
Es posible fusionar células normales con una línea celular inmortalizada. Con este
método se produce anticuerpos monoclonales. Brevemente, los linfocito aislados
del bazo o médula ósea de un ratón inmunizado se combinan con una línea celular de
mieloma inmortalizada (células del linaje B) para producir un hibridoma el cual
posee la especificidad de anticuerpos de los linfocito primarios y la inmortalidad de
la línea celular de mieloma. Las células de mieloma sin fusionar se seleccionan en
un medio de cultivo selectivo (HA o HAT), de esta manera los linfocitos primarios
mueren rápidamente y solamente las células fusionadas sobreviven. Los hibridomas
productores del anticuerpo deseado se seleccionan a partir de grupos hasta llegar a
colonias individuales.

VI. Cultivo de células de insecto

El cultivo de células de insecto consiste en la manutención de líneas celulares de insecto
en condiciones controladas de laboratorio. Se trata de un cultivo celular especial, cuya
principal aplicación consiste en el cultivo de baculovirus de cara a la expresión y
purificación de proteína recombinante.
1. Líneas celulares

 Sf9: deriva de las células IPLB-Sf21-AE de Spodoptera frugiperda. Las células

Sf9 se adaptan al cultivo en suspensión en medio X‐press para la expresión
transitoria o mantenida de proteína recombinante. Su tiempo de duplicación es
de 18-30 h. hasta una densidad máxima de 8-12 × 106 células/ml. Se mantienen
en cultivo en suspensión para la propagación de baculovirus y producción de
proteínas recombinantes o cultivo en monocapa para cotransfección o ensayos
en placa para la purificación de baculovirus recombinantes. Pueden ser
criopreservadas.

 Tni: las células High Five (BTI-TN-5B1-4) derivan de la línea celular

de Trichopulsia ni. Estas células son utilizadas para la obtención de proteínas
recombinantes cuando se usa el sistema de expresión basado en baculovirus.
Además, al igual que las Sf9, pueden crecer en medio X‐press en cultivos en
monocapa, y menos eficientemente en suspensión.
2. Cotransfección (baculovirus)
Con el fin de conseguir baculovirus recombinantes se realiza la cotransfección de
células Sf9 con el plásmido pAcGP67-C (este plásmido contiene la secuencia señal
gp67 que permite su liberación extracelular), que contiene el gen de interés
insertado, junto al DNA del virus linealizado. Para ello se sigue el protocolo de
transfección BD BaculoGold. Las propiedades de los baculovirus generados son:
  Modificaciones post-traduccionales. La elevada producción de proteína en
ocasiones reduce su nivel de modificación postrascripcional.
 Altos niveles de expresión (hasta 50%)
 Realización de splicing
 Expresión simultánea de múltiples genes
 Localización de las proteínas como la original
 Simplicidad
 Permite insertos largos
 La proteína recombinante está bien plegada y es funcional.
 La purificación es sencilla si es extracelular: ausencia de proteínas en el medio
(6xHis)
Después de la cotransfección o de la purificación de virus, el baculovirus
recombinante debe ser amplificado para obtener un elevado título de virus en la
disolución que permite la adecuada infección de las células de insecto y expresión
de proteína recombinante en dichas células.
3. Producción de VLPs
Una aplicación importante en la producción de proteínas recombinantes es la
obtención de partículas virales que carecen de material genético y por lo tanto no
son infectivas (partículas similares a virus o VLPs).
Se ha descrito la obtención de partículas virales del virus de la hepatitis C en células
de insecto mediante la inserción del cDNA de la proteína del core o envuelta (C) y
de las glicoproteínas de la superficie E1 y E2. Las tres aparecen seguidas en el
genoma de RNA del virus que codifica para una poliproteína que se escinde por
diversas proteasas celulares dando lugar a las diferentes proteínas aisladas. Las tres
forman parte de las denominadas proteínas estructurales junto con p7.
La cotransfección con la construcción que contiene las tres proteínas en presencia
o ausencia de p7 revelan los mismos resultados: aparición de partículas virales
detectables por anticuerpos contra las tres proteínas así como por sueros de
pacientes HCV positivos. Por microscopía electrónica se observa la localización de
estas partículas en vacuolas. El aislamiento y purificación de las VLPs mediante
gradiente de sacarosa permite la obtención de partículas puras que facilitan el
estudio detallado de la estructura de estas proteínas en su conformación nativa así
como los posibles mecanismos de fusión que median la capacidad infectiva de los
virus. Además, se ha detectado presencia de RNA en el interior de estas estructuras,
lo cual revela la capacidad de formación de partículas virales con su
correspondiente información genética.
CONCLUSIONES
La aplicación del cultivo de células animales dentro de la biotecnología farmacéutica se
ha incrementado en los últimos años ya que las ventajas ofrecidas por éste son permitir el
plegamiento correcto, brindar una glicosilación compleja adecuada y totalmente
relacionada con la actividad farmacológica y en el caso de su producción, secretar los
productos al medio de cultivo. En la actualidad, estas ventajas permiten hacer del cultivo
de células un sistema competitivo a nivel productivo en los países desarrollados ya que
por medio de él es posible obtener vacunas, anticuerpos monoclonales y proteínas
recombinantes cuyo valor agregado es considerable. En México, debido a la apertura por
parte de las empresas farmacéuticas para la generación de productos de origen
biotecnológico es necesario brindar información básica a la comunidad farmacéutica del
desarrollo de este tipo de cultivos a lo largo de la historia, así como de su clasificación y
usos más importantes, para facilitar la comprensión de procesos farmacéuticos que
utilicen este tipo de sistemas.

REFERENCIAS
1. http://www.labome.es/method/Cell-Culture-Media-A-Review.html
2. http://www.scielo.org.mx/pdf/rmiq/v6n3/v6n3a3.pdf?fbclid=IwAR0ZSOIPFYn
GJi5JI7TOZBJeUux6sQSerQKxoPWXQx2oFJl5ZGF0d7C2wx4
3. http://www.redalyc.org/pdf/579/57912962006.pdf