PRÁCTICA 1

BIOLOGIA MOLECULAR
EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN
La extracción de ADN genómico constituye el primer paso para la realización de análisis genéticos en el contexto
diagnóstico, en especial aquellas aproximaciones basadas en reacción en cadena de la polimerasa (PCR: Polymerase
Chain Reaction). Dicha extracción puede ser realizada a partir de cualquier célula nucleada, sin embargo, dada su
disponibilidad, las muestras más utilizadas para este fin son frotis de mucosa oral o sangre, a partir de las cuales es
posible obtener ADN de buena calidad y en cantidad suficiente.
En términos generales los protocolos de extracción de ADN incluyen tres etapas principales:
1. Lisis celular: mediante el uso de soluciones que contienen detergentes.
2. Eliminación de otros componentes celulares (proteínas y RNA): para lo cual se han descrito varios
métodos, tales como el uso de solventes orgánicos (fenol, cloroformo, entre otros), precipitación salina,
enzimas específicas (proteasas, RNAsas), cromatografía, entre otras. Muchos métodos utilizan
combinaciones de dichas estrategias.
3. Deshidratación y precipitación del ADN: para lo cual se utilizan alcoholes, siendo los más utilizados
isopropanol y etanol.

Calidad del ADN extraído

La calidad de la muestra obtenida se determina principalmente en función de su pureza y su integridad.
Para determinar la pureza del ADN se aprovecha la capacidad de la molécula de ADN para absorber luz UV, la cual
es conferida por la estructura cíclica de las bases nitrogenadas. El espectro de absorción del ADN muestra un pico
a 260nm, en contraste con el de las proteínas, contaminante común en las extracciones, el cual se encuentra a 280nm.
Teniendo en cuenta lo anterior la relación entre las absorbancias 260/280 se usa como un indicador de la pureza de
la muestra. Se considera óptimo un valor de ésta relación entre 1,8 y 2,0. Si hay contaminación con proteínas o
compuestos aromáticos utilizados durante el proceso de extracción el valor de la proporción es menor a 1,8 y si hay
contaminación por ARN la relación puede ser mayor a 2,0.
La integridad de la muestra se evalúa mediante electroforesis en gel de agarosa que permite asumir la cantidad del
ADN extraído según la intensidad de la banda observada, así como el grado de fragmentación del ADN cromosomal
correspondiente y la presencia o no de otras bandas o artefactos en el patrón de migración (Figura 1).

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Figura 1. Corrida electroforética de extracciones de ADN cromosómico. En los carriles 1,3,5,7 se observa ADN parcialmente
degradado. En los carriles 4,9, 10, 12, 14 y 15 se observan muy bajas cantidades de ADN. En los carriles 2,6,8,10,11,13 y 16
se observa ADN de cantidad y calidad adecuadas. Figura tomada de Monroy-Vaca, Ernesto Xavier et al. Evaluación de cuatro métodos de
extracción del ADN de Histoplasmacapsulatum y su uso en reacciones de PCR. Vaccimonitor [online]. 2014, vol.23, n.2, pp. 49-56. Disponible en:
<http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1025-028X2014000200003&lng=es&nrm=iso>. ISSN 1025-028X.

Cuantificación de ADN
Como se mencionó anteriormente la cuantificación de ADN se realiza mediante espectrofotometría mediante la
medición de la absorbancia de la muestra a 260nm, teniendo en cuenta que cumple la ley de Beer.
Para estimar la cantidad de ADN presente en la muestra se toma como referencia que una unidad de densidad óptica
(1 de absorbancia) corresponde aproximadamente a 50 µg/ml de ADN de doble cadena.
Este método puede utilizarse para cuantificar también moléculas de ARN, ADN de cadena sencilla y
oligonucleótidos, sin embargo, la relación para cada una de estas muestras es específica.

PRELABORATORIO
1. Cómo actúan cada uno de los reactivos utilizados en la práctica (Buffer lisis de glóbulos rojos, buffer de
lisis nuclear, cloroformo, etanol).
2. ¿Cómo funcionan las técnicas de purificación de ADN por cromatografía?
3. Revise algunas las diferencias entre el proceso de extracción de material genético entre células humanas,
bacterias y levaduras.
4. Mencione algunas ventajas y desventajas de la extracción de ADN utilizando solventes orgánicos.
5. Que cambios se realizarían al protocolo para extraer RNA.

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MATERIALES
Reactivos:

 Buffer de lisis de Glóbulos Rojos (Ajustar pH a 8,0 con NaOH 1M)

Tris-HCl 10 mM pH 7,6
Sacarosa 11 %
MgCL2 0,1%
Triton X-100 1 %
 Buffer de lisis nuclear (Ajustar pH a 8,0)
Tris HCl 10 mM
Citrato de sodio 11,4 mM
EDTA 1mM
SDS 1%
 Etanol 70% (mantener en hielo)

Equipos:

 Baño serológico
 Vórtex
 Microcentrífuga
 Espectrofotómetro
 Pipetas (10, 100 y 1000 µL)

Material:

 Viales 1,5mL
 Toallas de papel
 Puntas
 Agujas Venoject
 Camisa
 Tubos tapa Lila
 Algodón
 Torniquete
 Alcohol
 Guardián
Muestra:

 Sangre total anticoagulada con EDTA.

PROTOCOLO
Extracción de ADN genómico:
1. Tomar 1000uL de sangre con EDTA

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 2. Adicionar 1mL de buffer de lisis de glóbulos rojos
3. Mezclar y centrifugar 2 min a 7000rpm
4. Descartar el sobrenadante y repetir pasos 1-3 dos veces.
5. Adicionar 400µL de buffer de lisis nuclear
6. Adicionar 100µL de solución de NaCl saturada y 600µL de cloroformo. Mezclar bien y centrifugar 2 min
a 7000rpm
7. Pasar 400µL del lisado celular a un vial de 1,5mL nuevo marcado.
8. Agregar 300µL de etanol 70% frío, mezclar por inversión y dejar en hielo por 15 minutos.
9. Centrifugar a 13.000 rpm por 10 minutos.
10. Descartar el sobrenadante y dejar secar bien boca abajo sobre una toalla de papel (10 minutos)
11. Resuspender en 30µL de agua desionizada.
Cuantificación de ADN (nanogota):
1. Coloque 2µL de la suspensión de ADN en la microcelda de lectura.
2. Realice un espectro de absorción entre 230 y 300 nm.

3. Identifique la absorbancia de la muestra a 260 y 280 nm.

4. Calcule la relación correspondiente.
Cuantificación de ADN (espectrofotómetro):
1. Realice una dilución inicial de 1/100 de la suspensión de ADN en H2O desionizada.
2. Realice la lectura de la absorbancia de la dilución a 260nm. SI la absorbancia supera una lectura de 0.9 OD
realice una mayor dilución y repita la lectura hasta que la absorbancia detectada sea menor a dicho valor.
3. Realice un espectro de absorción entre 230 y 300 nm.
4. Identifique la absorbancia de la muestra a 260 y 280 nm.
5. Calcule la relación correspondiente.
INFORME DE RESULTADOS
En el informe de resultados incluya respuesta a las siguientes preguntas:
1. Realice el análisis de la pureza, integridad y cantidad del ADN extraído, indicando la idoneidad de la
muestra para realizar pruebas moleculares.
2. Realice un análisis de las dificultades que identificó durante la práctica y posibles soluciones.