Bacterias Reductoras de Perclorato de Los Suelos Hipersalinos Del Caribe Colombiano

11/6/2019 Bacterias reductoras de perclorato de los suelos hipersalinos del Caribe colombiano
Int J Microbiol . 2019; 2019: 6981865. PMCID: PMC6398020

Publicado en línea el 201 de febrero de 17. doi: 10.1155 / 2019/6981865 PMID: 30906324
Bacterias reductoras de perclorato de los suelos hipersalinos del Caribe

colombiano
Rosa Acevedo-Barrios , 1, 2 Angela Bertel-Sevilla , 1 José Alonso-Molina , 3 y Jesús Olivero-Verbel 1
1Environmental and Computational Chemistry Group, School of Pharmaceutical Sciences, Zaragocilla
Campus, University of Cartagena, Cartagena 130015, Colombia

2Biological and Chemical Studies Group, School of Basic Sciences, Technological University of Bolívar,
Cartagena 130010, Colombia

3Research Institute of Water and Environmental Engineering, Universitat Politècnica de València, Valencia
46022, Spain
Corresponding author.
Jesus Olivero-Verbel: joliverov@unicartagena.edu.co
Academic Editor: Hidetoshi Urakawa
Received 2018 Sep 24; Revised 2018 Nov 24; Accepted 2018 Dec 11.
Copyright © 2019 Rosa Acevedo-Barrios et al.
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la Licencia de Atribución de Creative Commons, que
permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que el trabajo
original se cite correctamente.
Resumen
Perclorato (ClO 4 -) tiene varias aplicaciones industriales y se detecta con frecuencia en matrices
ambientales en concentraciones relevantes para la salud humana. Actualmente, las bacterias que
degradan el perclorato son estrategias prometedoras para la biorremediación en sitios contaminados. El
objetivo de este estudio fue aislar y caracterizar bacterias halófilas con el potencial de reducción de
perclorato. Se aislaron diez cepas bacterianas de los suelos de Galerazamba-Bolívar, Manaure-Guajira
y la Isla de Salamanca-Magdalena, Colombia. Los aislamientos crecieron en concentraciones de hasta
30% de cloruro de sodio. Los aislamientos toleraron variaciones de pH que oscilaron entre 6,5 y 12,0 y
concentraciones de perclorato de hasta 10000 mg / l. El perclorato fue degradado por estas bacterias en
porcentajes entre 25 y 10. El análisis de secuencia del gen 16S rRNA indicó que las cepas estaban
relacionadas filogenéticamente conVibrio , Bacillus , Salinovibrio , Staphylococcus y Nesiotobacter .
En conclusión, las bacterias aisladas halofílicas de los suelos hipersalinos del Caribe colombiano son
recursos prometedores para la biorremediación de la contaminación por perclorato.
1. Introducción
La contaminación por perclorato es un problema de impacto global porque tiene un efecto negativo en
los ecosistemas con una pérdida de calidad ambiental, que aumenta con la actividad antropogénica. El
perclorato es un contaminante emergente ubicuo producido a partir de fuentes naturales y
antropogénicas [ 1 ], particularmente presente en áreas asociadas con el uso y fabricación de cohetes y
municiones. Este compuesto es un potente disruptor endocrino que afecta principalmente la fijación de
yodo por la glándula tiroides, responsable de regular el metabolismo, el crecimiento y el desarrollo [ 2 ,
3 ], por lo que es peligroso para los bebés y niños pequeños [ 4 ]. Se ha demostrado que la exposición
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6398020/ 1/21
aguda a corto plazo afecta a los sistemas nervioso, respiratorio, inmune y reproductor [5 ]. También se
ha relacionado con el cáncer de tiroides y la teratogénesis durante el primer trimestre del embarazo [ 6
].
El perclorato está altamente distribuido en los ecosistemas y organismos; por lo tanto, se encuentra con
frecuencia en varias matrices, incluida la leche materna, los fertilizantes, las plantas, los alimentos y los
tejidos humanos. Este escenario ha llevado a la priorización de estudios que permiten la eliminación de
este contaminante de los sitios contaminados, ya que es extremadamente tóxico y persistente; por lo
tanto, se necesitan tratamientos eficientes para su degradación a fin de mantener la calidad de los suelos
de los puntos críticos de la biodiversidad. Existen diferentes técnicas fisicoquímicas comúnmente
utilizadas para la eliminación ambiental de este anión, como el intercambio iónico, pero no es selectivo
y el proceso generalmente solo separa el perclorato de las fuentes contaminadas [ 7 ], también genera
subproductos, lo que requiere un tratamiento posterior. [ 7]. El perclorato es persistente pero posee
biodegradabilidad [ 8 ]. Sin embargo, enzimas como la perclorato reductasa y la cloróxido de
superóxido llevan a cabo la reducción o eliminación del perclorato. Una enzima reductasa es
responsable de reducir el perclorato a clorato y clorato a clorito, mientras que la enzima superóxido
clorito cambia clorito a cloruro y oxígeno molecular. La reducción biológica mediante el uso de
bacterias degrada completamente los iones perclorato en Cl - y O 2 (ecuación ( 1 )) [ 9 - 11 ]. La ruta de
degradación del perclorato es la siguiente:
- - -
ClO4 ( perclorato ) ⟶ ( ClO3 ) ( clorato ) ⟶ ( ClO2 ) ( clorita )
-
(1)
⟶ Cl ( cloruro ) + O2
Los suelos marinos generalmente contienen especies bacterianas con versatilidad bioquímica y
capacidad para tolerar la sal, siendo un objetivo interesante para los investigadores debido a la posible
reducción del perclorato ambiental [ 10 ]. La razón para seleccionar este tipo de entorno es que la
degradación del perclorato puede llevarse a cabo utilizando bacterias tolerantes a la sal [ 12 ], aunque
este proceso de reducción del perclorato podría verse afectado al aumentar la salinidad [ 11 , 13 ].
Además, estos organismos están disponibles en diversos entornos, desde la Antártida, lagos salinos y
aguas termales, incluso en suelos hipertermofílicos e hipersalinos [ 10 , 11]. Además, los depósitos de
perclorato en estos entornos pueden formarse por reacciones químicas entre el cloruro de sodio de la
tierra o el mar y el ozono [ 14 ].
Las pruebas piloto de biotecnologías que utilizan bacterias reductoras de perclorato se han estudiado y
ajustado en suspensión, reactores de lecho fijo, fluidizado y biopelículas [ 15 , 16 ], evaluando la
efectividad de los tratamientos en suelos y agua contaminados con perclorato [ 15 ]. Hoy en día, se está
estudiando el uso de sistemas integrados, que combinan tratamientos fisicoquímicos y bacterias
halófilas reductoras de perclorato, para aumentar la eficiencia del tratamiento del agua, permitiendo el
manejo de flujos residuales con alta salinidad y grandes concentraciones de perclorato, que resuelven
simultáneamente el problema de la eliminación de desechos [ 17 ].
Colombia tiene una variedad de ecosistemas con diferentes características climáticas y biogeoquímicas,
lo que facilita el desarrollo de diferentes bacterias halófilas. El objetivo de este estudio fue la
caracterización de bacterias reductoras de perclorato recuperadas de suelos hipersalinos del Caribe
colombiano.
2. Materiales y métodos
2.1. Área de estudio y recogida de muestras.

Las muestras de suelo se obtuvieron de las minas de sal de Colombia, específicamente de
Galerazamba-Bolívar (10 ° 47′21 "N, 75 ° 15′41" W), Manaure-Guajira (11 ° 46′30 "N, 72 ° 26′40 ″
W), y suelos salinos ubicados en la Isla Salamanca-Magdalena (10 ° 56′00 ″ N, 75 ° 15′00 ″ W) (
Figura 1 ). Se empleó una espátula estéril para recolectar aproximadamente 100 g de suelo de la capa
superior de 1 a 10 cm en mayo de 2015. Todas las muestras se recolectaron en tubos Falcon de 50 ml,
se mantuvieron refrigerados a 4 ° C y se llevaron al laboratorio para su procesamiento. La salinidad y
el pH se registraron para cada muestra de acuerdo con Nozawa-Inoue et al. [ 18 ].
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Figura 1
Mapa de la región caribeña de Colombia que muestra la ubicación geográfica de los sitios de muestreo.
2.2. Aislamiento de cepas y condiciones de cultivo.

Las técnicas de aislamiento, purificación y preservación se utilizaron como describen Shimkets y
Rafiee [ 19 ]. Las muestras se trataron con anfotericina B (0,25 mg / ml) durante 3 h hasta la
inoculación (50 µl ) en el medio de aislamiento. Posteriormente, las muestras se incubaron en placas
de Petri que contenían agar esterilizado modificado Luria-Bertani en agua de mar (LB NaCl) [ 20 ] y se
incubaron a 37 ° C durante 24 h en condiciones aeróbicas [ 21 ]. El crecimiento bacteriano fue
monitoreado por observación de colonias. Para la preservación, una colonia bacteriana se transfirió a
un caldo LB modificado y se incubó aeróbicamente a 37 ° C durante 12 h, ajustando la densidad celular
a un estándar de turbidez de 0.5 Mc-Farland. Luego, 720 µL de cada cultivo se transfirió a un criovial
con 80 μ l de glicerol y se almacenó a -80 ° C.
2.3. Identificación molecular

2.3.1. 16S ARNr secuenciación de genes y análisis filogenético Para la amplificación del gen 16S
rRNA, se extrajo el ADN genómico utilizando un kit QIAamp® DNA Mini (Qiagen, CA, EE. UU.)
Como lo describe el fabricante. El gen 16S rRNA se amplificó a partir del ADN genómico total de las
cepas bacterianas mediante PCR utilizando el cebador directo PF (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-

3 ') y el cebador inverso 1492R (5'-ACCTTGTTACGACTT-3') [ 22 , 23 ] . La PCR se realizó con una
mezcla maestra AmpliTaq Gold® 360 (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Cada mezcla de reacción de 25 μ L contenía 0.4 μM de cada cebador y ∼100 ng de ADN
de plantilla. La amplificación se realizó de la siguiente manera: desnaturalización inicial durante 10
min a 95 ° C, 25 ciclos de desnaturalización durante 1 min a 94 ° C, recocido durante 1 min a 43 ° C y
extensión durante 1,5 min a 72 ° C, y Prolongación final de 5,5 min a 72 ° C. Todos los productos de
PCR se verificaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,2% (p / v) teñidos con bromuro de
etidio (10 mg / ml) y se analizaron utilizando un sistema de documentación de gel (IngGenius 3
System-Syngene).
El producto de PCR se purificó con un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen, CA, EE. UU.),
Siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuenciación automatizada del ADN fue realizada por el
Centro Nacional de Secuenciación Genómica (CNSG) (Medellín-Colombia) utilizando los cebadores
PF y 1492R. Las lecturas de secuencia se editaron y ensamblaron con el software CAP3 [ 24 ]. Las
secuencias del gen 16S rRNA resultantes se compararon con las cepas de referencia con nombres
válidos publicados utilizando el servidor EzTaxon-e ( http://www.ezbiocloud.net/eztaxon ). Después de
múltiples alineaciones de los datos a través de CLUSTAL_W, cuatro métodos, incluida la unión de
vecinos (NJ) [ 25 ], máxima verosimilitud (ML) [ 26 ], evolución mínima (ME) y parsimonia máxima
(MP) [ 27]], se utilizaron para realizar análisis filogenéticos. Los árboles filogenéticos se construyeron
con MEGA versión 6 [ 28 ]. Las distancias se calcularon utilizando la corrección de Kimura de una
manera de eliminación por pares [ 29 ]. Las topologías del árbol filogenético se evaluaron mediante el
método de remuestreo bootstrap descrito por Felsenstein [ 30 ] con 1000 repeticiones. Los números de
acceso de GenBank / EMBL / DDBJ para las secuencias del gen 16S rRNA de cepas aisladas BBCOL-
031, BBCOL-023, BBCOL-024, BBCOL-025, BBCOL-026, BBCOL-027, BBCOL-028, BBCOL-029,
BBCOL -032, y BBCOL-033 son KX821664-KX821673 , respectivamente.
2.4. Caracterización morfológica

Las cepas se incubaron en agar LB NaCl, y tanto el crecimiento como la morfogénesis se observaron
bajo examen microscópico de luz (microscopio Olympus BX41). La tinción de Gram se realizó
siguiendo el Manual Taxonomic Key [ 31 ] de Bergey y el Microbiológico Atlas de Koneman [ 32 ].
Las muestras se procesaron posteriormente mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) como
se describió anteriormente [ 33 ].
2.5. Caracterización bioquímica

Las características bioquímicas se investigaron utilizando el kit BBL Crystal ™ (Becton Dickinson
Microbiology Systems, Cockeysville, EE. UU.) Según lo descrito por el fabricante. Las pruebas de
catalasa y oxidasa se realizaron de acuerdo con los métodos informados [ 21 ].
2.6. Ensayo de susceptibilidad al cloruro

Todas las cepas se analizaron para determinar la susceptibilidad del perclorato en caldo LB en
presencia de NaCl (3.5, 5.0, 7.5 y 30% p / v) [ 20 , 34 ]. Los experimentos comenzaron a agregar 20 µl
de suspensión celular, OD = 0.6, en 5 ml de caldo LB. Los cultivos se incubaron a 37 ° C durante 24 h,
y después de eso, las cepas que muestran turbidez [ 35 ] se identificaron como resistentes al NaCl. Los
experimentos se llevaron a cabo por triplicado y se realizaron tres veces.
2.7. Ensayo de susceptibilidad al perclorato

Todas las cepas fueron analizadas para determinar la susceptibilidad al perclorato en caldo LB en
presencia de perclorato en concentraciones de 100, 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 2000, 3000, 5000,
7500 y 10000 mg / L [ 20 , 36 , 37 ]. Los experimentos se llevaron a cabo como se describe para el
ensayo de susceptibilidad al cloruro. Después del tiempo de incubación (24 h), se probó un cultivo de
cada aislado en agar LB a sus correspondientes concentraciones de KClO 4 para confirmar la viabilidad
celular y la pureza de cada una de las cepas bacterianas.
2.8. Evaluación de la reducción de perclorato por aislamientos

Los experimentos se llevaron a cabo utilizando una concentración de 10000 mg / L de KClO 4 en LB
con NaCl al 3,5%, inoculando los aislamientos como se describe en el ensayo de susceptibilidad al
cloruro e incubando durante un período de tiempo de 24 horas a 37 ° C. Después del tiempo de
incubación, la concentración final de KClO 4 se midió con un electrodo de perclorato Thermo
Scientific Orion 93 (Thermo Fisher Scientific Inc., Beverly, MA), utilizado de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. La diferencia en la concentración después y antes de la incubación se
empleó para calcular el porcentaje de reducción de perclorato provocado por cada cepa.
3. Resultados y discusión
3.1. Identificación molecular

Se obtuvieron secuencias genéticas de ARNr 16S casi completas de las cepas BBCOL-023 a BBCOL-
033 (números de acceso de GenBank: KX821664-KX821673 ). Los resultados del análisis filogenético
mostraron que estas cepas pertenecían a miembros de Bacillus , Vibrio , Salinivibrio , Nesiotobacter y
Staphylococcus . La cepa BBCOL-023 presentó una similitud del 99% con Nesiotobacter ; las cepas
BBCOL-024, BBCOL-028, BBCOL-029 y BBCOL-033 tenían una homología del 99% con las
especies de Bacillus ; y las cepas BBCOL-025, BBCOL-026, BBCOL-027 y BBCOL-031 tenían una
homología del 99% con los miembros de la familia Vibrionaceae, particularmente Vibrio yEspecies de
salinivibrio . La cepa BBCOL-032 presentó un 99% de similitud con Staphylococcus spp.
La secuencia del gen 16S rRNA tenía valores similares entre las cepas BBCOL-024, BBCOL-028,
BBCOL-029 y BBCOL-033, y las cepas de tipo Bacillus de nombre válido se calcularon utilizando el
servidor EzTaxon-e. Las cepas BBCOL-024 y BBCOL-028 mostraron altas similitudes en la secuencia
del gen 16S rRNA con Bacillus vallismortis DV1 -F-3 (T) (99.6 y 99.5%, respectivamente), Bacillus
subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429 (T) (99.6 y 99.4%, respectivamente), y Bacillus subtilis
subsp. spizizenii NRRL B-23049 (T) (99.6 y 99.4%, respectivamente).
Los niveles de similitud de la secuencia del gen 16S rRNA entre las cepas BBCOL-024 y BBCOL-028
y otros miembros actuales del género Bacillus fueron inferiores al 99,0%. En la unión de vecinos (
Figura 2 ) y los dendrogramas filogenéticos de evolución mínima basados en las secuencias del gen
16S rRNA, las cepas BBCOL-024 y BBCOL-028 se colocaron en un grupo en Bacillus y se demostró
que estaban estrechamente relacionadas con B. vallismortis , B. subtilis subsp. spizizenii TU-B-10, B.
vanillea y B. atrophaeus .

Figura 2
Árbol de unión vecino basado en las secuencias del gen 16S rRNA que muestran la posición filogenética
de las cepas BBCOL-024, BBCOL-028, BBCOL-029 y BBCOL-033 en comparación con los miembros
más estrechamente relacionados del género Bacillus. Los valores de Bootstrap basados en 1000 réplicas se
enumeran como porcentajes en los puntos de bifurcación. Los números de acceso se dan entre paréntesis.
Barra, 0,01 sustituciones de nucleótidos por posición de nucleótido.
La cepa BBCOL-029 comparte una alta similitud de secuencia con B. oryzaecorticis R1 (T), B.
haikouensis C-89 (T), B. aquimaris TF-12 (T) y B. vietnamensis 15-1 (T) con 98.2 , 97.9, 97.9 y 97.9%
respectivamente, y diferencias de nucleótidos de 20, 29, 30 y 29 nucleótidos, respectivamente. El
análisis comparativo de las secuencias del gen 16S rRNA y las relaciones filogenéticas mostraron que
la cepa BBCOL-029 se encuentra en un subclave en el árbol con B. marisflavi, B. aquimaris y B.
vietnamensis (respaldado por un valor de arranque del 77%) ( Figura 2)), con la que comparte la mayor
similitud de secuencia del gen 16S rRNA. La afiliación de la cepa BBCOL-029 y sus vecinos más
cercanos también fue apoyada por la máxima parsimonia y los algoritmos de máxima verosimilitud con
valores de arranque por encima del 70%. El análisis de búsqueda del servidor EzTaxon-e reveló que la
cepa BBCOL-033 está estrechamente relacionada con B. flexus FO 15715 (T) (99.7%, 16S rRNA de
similitud de secuencia de genes), B. paraflexus RC2 (T) (99%), B. megaterium NBRC 15308 = ATCC
14581 (T) (98.5%), y otros bacilos (<97%). Las similitudes de secuencia de la cepa BBCOL-033 con
B. flexus utilizando diferentes algoritmos de agrupamiento (100% en el árbol de NJ; 100% en el árbol
de ME y 100% en el árbol de ML) junto con el análisis del servidor EzTaxon-e indicaron queB. flexus
es el pariente más cercano.
Para la cepa BBCOL-023, se determinaron 1329 nt de la secuencia del gen 16S rRNA. El análisis
comparativo de la secuencia del gen 16S rRNA mostró que la cepa BBCOL-023 estaba más
estrechamente relacionada con los miembros del género Nesiotobacter. La cepa BBCOL-023 comparte
la mayor similitud de secuencia con Nesiotobacter exalbescens LA33B (T), Roseibium aquae DSG-S4-
2 (T) y Pseudovibrio hongkongensis UST20140214-015B (T) con 99.8, 95.9 y 95.7% y diferencias de
nucleótidos de 3 , 55, y 57, respectivamente. Las similitudes de la secuencia del gen 16S rRNA con las
cepas tipo de otros miembros de la familia Rhodobacteraceae con nombres válidamente publicados
fueron inferiores al 94%. En el árbol filogenético basado en el algoritmo NJ ( Figura 3), la cepa
BBCOL-023 formó un solo clado con Nesiotobacter exalbescens (respaldado por un valor de arranque
del 100% ( Figura 3 )), con el que comparte la mayor similitud de la secuencia del gen 16S rRNA. La
afiliación de la cepa BBCOL-023 y sus vecinos más cercanos también fue apoyada por los algoritmos
MP y ML con valores de bootstrap superiores al 90%.

figura 3
Vecino que se une al árbol filogenético basado en las secuencias del gen 16S rRNA que muestra las
relaciones de la cepa BBCOL-023 y los taxones relacionados. Los valores de arranque de porcentaje
basados en 1000 replicaciones se dan en los puntos de ramificación. El gammaproteobacterium Vibrio
furnissii ( X76336 ) se usó como grupo externo. Barra, 0,01 sustituciones por posición de nucleótido.
Las secuencias de ADNr 16S de las cepas BBCOL-025, BBCOL-026, BBCOL-027 y BBCOL-031
determinadas en este estudio comprendieron 1402, 1361, 1399 y 1389 nt, respectivamente, que
representan aproximadamente el 90% de la secuencia de ARNr de Escherichia coli 16S . Los
resultados del análisis filogenético de las secuencias del gen 16S rRNA revelaron que las cepas aisladas
se relacionaron filogenéticamente con miembros de la familia Vibrionaceae y pertenecen al grupo
filético definido clásicamente como el género Salinivibrio y Vibrio ( Figura 4 ). La cepa BBCOL-025
muestra una alta similitud en las secuencias del gen 16S rRNA con Salinivibrio costicola subsp.
vallismortis DSM 8285 (T) (98.4%), Salinivibrio costicolasubsp. costicola ATCC 33508 (T) (97,8%) y
Salinivibrio proteolyticus AF-2004 (T) (97,7%). Los niveles de similitud en la secuencia del gen 16S
rRNA entre la cepa BBCOL-025 y los otros miembros actuales del género Salinivibrio están por debajo
del 97%. En la unión del vecino ( Figura 4 ) y la evolución mínima de los dendrogramas filogenéticos
basados en las secuencias del gen 16S rRNA, la cepa BBCOL-025 se colocó en un grupo en el género
Salinivibrio y se demostró que está estrechamente relacionada con S. budaii y S. costicola subsp .
alcaliphilus (soportado por un valor de arranque del 75%). 16S rRNA secuencia secuencia de
comparación entre la cepa BBCOL-026 y otros miembros de laLa familia Vibrionaceae utilizando el
servidor EzTaxon-e indicó que la cepa estaba estrechamente relacionada con los miembros del género
Vibrio , mostrando una similitud de la secuencia del gen del 99.2% con V. antiquarius Ex25 (T), 99%
con V. alginolyticus NBRC 15630 (T), 98 % a V. neocaledonicus NC470 (T), y 98.9% a V. natriegens
DSM 759 (T). Del mismo modo, las cepas BBCOL-027 y BBCOL-031 muestran una alta similitud en
las secuencias del gen 16S rRNA con V. alginolyticus NBRC 15630 (T) (99.8 y 98.9%,
respectivamente) y V. antiquariusEx25 (T) (99.5 y 98.9%, respectivamente). Un árbol filogenético,
generado a partir del algoritmo de unión vecino, mostró que las cepas BBCOL-026 y BBCOL-031
ambas cayeron dentro de la radiación del grupo que comprende las especies de Vibrio y formaron un
grupo coherente que está respaldado por un análisis bootstrap a un nivel de confianza de 98 % (
Figura 4 ). Este grupo se une al clado filogenético que comprende V. alginolyticus y V.
parahaemolyticus , que está respaldado por un valor de bootstrap del 71%. Esta topología también se
encontró en árboles generados con los algoritmos ML y MP (no se muestra). Los árboles filogenéticos
NJ y ME basados en datos de la secuencia del gen 16S rRNA mostraron que la cepa BBCOL-027
forma un grupo coherente con Vibrio alginolyticus (un valor de arranque del 72%).

Figura 4
Árbol de unión vecino basado en las secuencias del gen 16S rRNA que muestran la posición filogenética
de las cepas BBCOL-025, BBCOL-026, BBCOL-027 y BBCOL-031 en comparación con los miembros
más estrechamente relacionados de la familia Vibrionaceae. Los valores de Bootstrap basados en 1000
réplicas se enumeran como porcentajes en los puntos de bifurcación. Los números de acceso se dan entre
paréntesis. Barra, 0,01 sustituciones de nucleótidos por posición de nucleótido.
Para la cepa BBCOL-032, se determinaron 1416 nt de la secuencia del gen 16S rRNA. El análisis
comparativo de la secuencia del gen 16S rRNA mostró que la cepa BBCOL-032 estaba más
estrechamente relacionada con la especie Staphylococcus . La cepa BBCOL-032 comparte la mayor
similitud de secuencia con Staphylococcus haemolyticus ATCC 29970 (T) (99.9%), Staphylococcus
petrasii subsp. pragensis NRL / St 12/356 (T), y Staphylococcus petrasii subsp . jettensis SEQ110 (T)
(99.2%). Las similitudes de la secuencia del gen 16S rRNA con las cepas de otros miembros de la
familia de las estafilococos son inferiores al 99%. En el árbol filogenético basado en el algoritmo NJ (
Figura 5), la cepa BBCOL-032 cayó dentro de un grupo coherente que comprende S. haemolyticus , S.
petrasii subsp. pragensis , S. petrasii subsp. jettensis , y S. lugdunensis . Las similitudes de secuencia
de la cepa BBCOL-032 con S. haemolyticus utilizando diferentes algoritmos de agrupamiento (100%
en el árbol NJ; 99% en el árbol ME; y 100% en el árbol ML) junto con el análisis del servidor
EzTaxon-e indicaron que S. haemolyticus es el pariente mas cercano.

Figura 5
Vecino que se une al árbol filogenético basado en las secuencias del gen 16S rRNA que muestran las
relaciones de la cepa BBCOL-032 y los taxones relacionados. Los valores de arranque de porcentaje
basados en 1000 replicaciones se dan en los puntos de ramificación. Se utilizó Bacillus subtilis (
AB016721 ) como grupo externo. Barra, 0,01 sustituciones por posición de nucleótido.
3.2. Caracterización microscópica y bioquímica.

Las colonias de cepas (BBCOL-023 a BBCOL-033) en agar LB eran circulares, convexas y lisas. Las
células eran anaeróbicas facultativas, con un crecimiento óptimo a pH 6,5 a 7,5. Las características
morfológicas se observan mediante SEM ( Figura 6 ), y las características bioquímicas de las cepas de
bacterias aisladas se muestran en la Tabla 1 . Las características morfológicas y bioquímicas detectadas
en la cepa aislada BBCOL-023 corresponden a la especie Nesiotobacter , como se informó
anteriormente [ 38 ]. Las cepas fueron capaces de utilizar lactosa, manosa, galactosa, sorbitol y
sacarosa como fuentes de carbono. El nitrato se redujo a nitrito. Las cepas fueron ONPG- y H 2 S-
negativo.

Figura 6
Morfología celular estudiada por SEM. Bacterias aisladas de suelos hipersalinos: (a) BBCOL-023; (b)
BBCOL-024; (c) BBCOL-025; (e) BBCOL-027; (f) BBCOL-028; (g) BBCOL-029; (h) BBCOL-031; (i)
BBCOL-032; (j) BBCOL-033 (SEM a 10000x).
tabla 1
Características morfológicas y bioquímicas de cepas aisladas.
Caracteristicas BBCOL-023 BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCO

024 025 026 027 028 029
Identificación Nesiotobacter Bacillus Salinivibrio Vibrio V. B. cohnii Bacillu
molecular sp. vallismortis costicola alginolyticus Harveyi spp.
Color de colonia Beige Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amaril
Morfología En forma de En forma En forma En forma de En forma En forma En form
varilla de varilla de vibrio vibrio de vibrio de varilla de varil
Longitud ( μ m) 1.56 1.60 1.45 0.86 0.15 1.53 3.90
Espesor ( μ m) 0.7 0.65 0.68 0.76 0.62 0.6 0.8
Motilidad - - + - - + +
Esfuerzo de gramo - + - - - + -
Endospora - + - - - + -
Posición de la + + + + + + +
espora
Oxidasa + + + + W + +
Catalasa - + - - - + +
Arabinosa - + + + + + +
Manosa + - - - - - -
Sacarosa + + + + + + +
Melibiosa + + + + + + +
Ramnosa + + + + + + +
Manitol - - + + + + +
Adonitol - - - - - - -
Galactosa + + + + + + +
Inositol - - - - - - -
pnp-fosfato - - + - + - -
pnp a- ß- V - - - + - V
glucósido
pnp- ß- + + + + + - +
galactosido
Prolinenitroanilida - - - - + - -
pnp bis-fosfato - - - - - - -
pnp-xyiloside + + + + + - +
pnpa-arabinósido + + + + + - +
pnp-fosforilcolina - - - - - - -
pnp- ß- - - - - - - -
+, reacción positiva; -, reacción negativa; W , reacción débilmente positiva; V , reacción variable.
Los resultados morfológicos microscópicos mostraron que los aislados BBCOL-024, BBCOL-028,
BBCOL-029 y BBCOL-033 corresponden al género Bacillus [ 39 ]. Cuando se cultivaron a 37 ° C
durante 24 h en LB, las células eran bacilos grampositivos, con un tamaño entre 0,6-0,7 μ my 1,6-1,7
μ m. Las endosporas eran elipsoidales. Las células fueron móviles, aeróbicas, anaeróbicas facultativas y
oxidasa y catalasa positivas. Las condiciones óptimas de crecimiento de BBCOL-024 fueron a pH 6.0–
6.5 y 37 ° C. Estos aislamientos mostraron actividad de reducción de Voges-Proskauer y nitrato. Sin
embargo, fueron ONPG y H 2 S negativos.
Las células de la cepa BBCOL-025, Salinovibrio costicola , fueron gramnegativas, móviles, no

esporuladas y curvadas, presentando un tamaño bacteriano promedio de 1.4 × 0.7 µm . Además, estos
fueron móviles, anaeróbicos facultativos y oxidasa y catalasa positivos. Las condiciones óptimas de
crecimiento para BBCOL-025 fueron a pH 6.0–6.5 y 37 ° C. Los aislamientos mostraron diferencias
morfológicas tanto en el tamaño como en el crecimiento de la curva. Estas diferencias pueden surgir
según las condiciones ambientales en el momento del muestreo, los procedimientos de laboratorio y las
técnicas de conservación, entre otras [ 40 , 41 ]. Estas cepas presentaron actividad positiva para Voges-
Proskeuer y reducción de nitratos y actividad negativa contra la producción de ONPG y H 2 S.
Los aislamientos BBCOL-026, BBCOL-027 y BBCOL-031 compartieron las propiedades principales

del género Vibrio . Eran móviles, curvos, facultativos, gramnegativos y oxidasa positivos y fueron
capaces de reducir el nitrato a nitrito. Estas bacterias también formaron colonias amarillas, según lo
informado por varios autores [ 42 , 43 ]. Las condiciones óptimas de crecimiento para BBCOL-025
fueron a pH 6.0–6.5 y 37 ° C. Los aislamientos mostraron una alta homogeneidad fenotípica, aunque se
observaron reacciones variables para la hidrólisis de aesculina, la actividad de N -acetil-
glucosaminidasa y la fermentación de galactosa y lactosa.
Las células de la cepa BBCOL-032 Staphylococcus spp. fueron grampositivas, móviles y no porosas,
presentando un tamaño bacteriano promedio de 1.28 × 0.68 µm . Las células fueron facultativas y
oxidase y catalasa positivas. Las condiciones óptimas de crecimiento para BBCOL-025 fueron a pH
6.0–6.5 y 37 ° C. Las cepas aisladas presentan actividad positiva para la reducción de prueba y nitrato
de Voges-Proskauer, y mostraron una actividad negativa en contra de ONPG y H 2 producción S, como
se informó anteriormente [ 44 , 45 ].
3.3. Ensayo de susceptibilidad al cloruro de sodio y perclorato

Todos los aislamientos mostraron crecimiento en el medio de cultivo con altas concentraciones de
NaCl, alcanzando una tolerancia de hasta el 30%. Las cepas BBCOL-023 a BBCOL-033 presentaron
características de bacterias moderadamente halófilas, según lo informado por Acevedo-Barrios [ 20 ].
La capacidad de los aislados para crecer y tolerar concentraciones de KClO 4 entre 100 y 10000 mg / L
se presenta en la Tabla 2 . Todos los aislamientos mostraron formación de biopelículas a la
concentración más alta. Esta barrera permite que las bacterias generen un gradiente de concentración
como medio de protección contra la toxicidad de este químico [ 2 ].
Tabla 2
Cepas bacterianas BBCOL-023 a BBCOL-033 expuestas a diferentes concentraciones de NaCl
y KClO 4 y cambios de pH.
Caracteristicas BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCOL- BB

023 024 025 026 027 028 029 031
Tolerancia 30 30 30 10 10 10 10 10
máxima de
NaCl (%)
Tolerancia 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 7.500 10,000 10,000 1
máxima al
KClO 4 (mg /
L)
tolerancia del 6.5-12 6.5-12 6.5-12 6.5-12 6.5-12 6.5-12 6.5-12 6.5-12 6
rango de pH
Otros aspectos que se evidencian en estas cepas son las asociaciones entre NaCl y la tolerancia a KClO
4 . Estos aislamientos se han convertido en objetivos interesantes para esta investigación, dada la
necesidad de identificar bacterias nativas con potencial biotecnología y versatilidad bioquímica,
capaces de degradar contaminantes ambientales como el KClO 4 .
3.4. Evaluación de la reducción de perclorato por aislamientos

Las bacterias reductoras de perclorato son filogenéticamente diversas, e incluyen alfaproteobacterias,
betaproteobacterias, gammaproteobacterias y clases de Deltaproteobacterias, siendo las
betaproteobacterias la clase más comúnmente detectada [ 46 , 47 ]. En este trabajo, las cepas
bacterianas BBCOL-023 a BBCOL-033 ( Figura 7 ) mostraron capacidad biológica para reducir las
concentraciones de KClO 4 en porcentajes entre 10 y 25.
Figura 7
Porcentaje de reducción de la concentración de KClO 4 de las bacterias BBCOL-023 a BBCOL-033 en

ambientes salinos en el Caribe colombiano. Efecto del tiempo de contacto de 48 h, la densidad óptica a OD
600 y el pH óptimo (7,0 ± 0,5).
Los géneros Nesiotobacter y Salinivibrio mostraron el porcentaje más alto (25%) de reducción de
perclorato, mientras que los géneros Vibrio , Bacillus y Staphylococcus presentaron una menor
proporción de reducción de KClO 4 , con 14, 12 y 10%, respectivamente. Estudios recientes han
demostrado que la cantidad de perclorato reducido puede ser inversamente proporcional al aumento de
la salinidad [ 13 , 17 ]. Se deben realizar estudios futuros para describir el papel de la salinidad en la
reducción de perclorato por estas cepas.
La capacidad de las bacterias para crecer en áreas contaminadas con perclorato está determinada por
sus enzimas degradantes [ 48 , 49 ]. La vía general de reducción metabólica ampliamente aceptada por
los investigadores [ 9 , 10 ] involucra la enzima reductasa, ya que es responsable de reducir el
perclorato a clorato y clorato a clorito, mientras que la enzima superóxido clorita cambia clorito a
cloruro y oxígeno molecular [ 9 , 46 , 50 ]. El rango de temperatura óptimo para la reducción de
perclorato es 28–37 ° C [ 46 , 51 , 52 ].
Las bacterias reductoras de perclorato son generalmente anaeróbicas y algunas facultativas, a pesar de
ser el oxígeno molecular producido como un intermedio de la reducción del perclorato microbiano [ 46
, 53 ], en un proceso que exuda nitrato [ 46 ]. En nuestro estudio, las bacterias reductoras de perclorato
aisladas también fueron anaeróbicas pero facultativas. Por lo tanto, aunque estos pueden sufrir procesos
de degradación en una amplia gama de condiciones ambientales, también es probable que algunas
cepas anaeróbicas críticas se hayan omitido durante el tratamiento aeróbico. En consecuencia, se deben
realizar experimentos adicionales en condiciones anaeróbicas, solo para enriquecer algunos
microorganismos activos que puedan mejorar la degradación del perclorato.
El perclorato es un contaminante ubicuo y persistente en el medio ambiente, que causa efectos tóxicos
en la biota y en los seres humanos. Por lo tanto, se han desarrollado diferentes tecnologías para
eliminar y eliminar este producto químico. Uno de los más prometedores, efectivos y económicos es el
uso de bacterias en sistemas biotecnológicos que son capaces de reducir y eliminar el perclorato. Las
tasas de reducción de perclorato obtenidas en este estudio fueron comparables a las reportadas por
Wang et al. [ 54 ], sugiriendo su posible aplicación en biorremediación de áreas contaminadas con
perclorato.
4. Conclusiones
Las cepas aisladas de Galerazamba-Bolívar, Manaure-Guajira y Salamanca Island-Magdalena,
Colombia, fueron organismos halotolerantes que pertenecen a los géneros Vibrio , Bacillus ,
Salinovibrio , Staphylococcus y Nesiotobacter . Estas cepas podrían reducir los niveles de KClO 4 en
soluciones acuosas de 10 a 25%. La remediación del perclorato mediada por bacterias es un proceso
adecuado para controlar la contaminación con este químico tóxico.
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen al Instituto de Ingeniería del Agua y Medio Ambiente de la Universidad
Politécnica de Valencia (España). Esta investigación recibió el apoyo de la Vicepresidencia de
Investigación de la Universidad de Cartagena; y Colciencias ‐ Universidad de Cartagena (Subvención:
RC-758-2011 / 1107-521-29360).
Abreviaturas
LB NaCl: Luria-Bertani en agua de mar
ML: Máxima verosimilitud
MP: Maxima parsimonia
YO: Evolución mínima
NUEVA JERSEY: Vecino de unirse
SEM: Microscopía electrónica de barrido
SOBREDOSIS: Densidad óptica.
Disponibilidad de datos
Los conjuntos de datos generados y / o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor
correspondiente a solicitud.
Conflictos de interés
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
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Bacterias Reductoras de Perclorato de Los Suelos Hipersalinos Del Caribe Colombiano

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11/6/2019 Bacterias reductoras de perclorato de los suelos hipersalinos del Caribe colombiano

Int J Microbiol . 2019; 2019: 6981865. PMCID: PMC6398020

Bacterias reductoras de perclorato de los suelos hipersalinos del Caribe

Campus, University of Cartagena, Cartagena 130015, Colombia

Cartagena 130010, Colombia

Copyright © 2019 Rosa Acevedo-Barrios et al.

2.1. Área de estudio y recogida de muestras.

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2.2. Aislamiento de cepas y condiciones de cultivo.

2.3. Identificación molecular

cepas bacterianas mediante PCR utilizando el cebador directo PF (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-

2.4. Caracterización morfológica

2.5. Caracterización bioquímica

2.6. Ensayo de susceptibilidad al cloruro

2.7. Ensayo de susceptibilidad al perclorato

2.8. Evaluación de la reducción de perclorato por aislamientos

3.1. Identificación molecular

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3.2. Caracterización microscópica y bioquímica.

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Caracteristicas BBCOL-023 BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCO

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+, reacción positiva; -, reacción negativa; W , reacción débilmente positiva; V , reacción variable.

Las células de la cepa BBCOL-025, Salinovibrio costicola , fueron gramnegativas, móviles, no

Los aislamientos BBCOL-026, BBCOL-027 y BBCOL-031 compartieron las propiedades principales

3.3. Ensayo de susceptibilidad al cloruro de sodio y perclorato

Caracteristicas BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCOL- BBCOL- BB

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3.4. Evaluación de la reducción de perclorato por aislamientos

Porcentaje de reducción de la concentración de KClO 4 de las bacterias BBCOL-023 a BBCOL-033 en

LB NaCl: Luria-Bertani en agua de mar

ML: Máxima verosimilitud

MP: Maxima parsimonia

YO: Evolución mínima

NUEVA JERSEY: Vecino de unirse

SEM: Microscopía electrónica de barrido

SOBREDOSIS: Densidad óptica.

2. Acevedo-Barrios R., Sabater-Marco C., Olivero-Verbel J. Evaluación ecotoxicológica del perclorato

5. Smith PN In: La ecotoxicología del perclorato en el medio ambiente BT-perclorato: ocurrencia

8. Nerenberg R., Rittmann BE, Najm I. Reducción de perclorato en un reactor de biopelícula de

26. Felsenstein J. Árboles evolutivos de secuencias de ADN: un enfoque de máxima probabilidad.

37. Gholamian F., Sheikh-Mohseni MA, Salavati-Niasari M. Determinación altamente selectiva de

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