UNIVERSIDAD TÉCNICA DEL NORTE

VICERRECTORADO ACADÉMICO

SISTEMA NACIONAL DE NIVELACIÓN Y ADMISIÓN

TEMA:

“CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE CULTIVOS TRADICIONALES Y

CULTIVOS ORGÁNICOS”

CARRERA: Ing. Biotecnología

AUTORES: Jhony Atiaja

Sebastián Benavides

Jostin Padilla

Santiago Toapanta

Rubén Quishpe

DOCENTE: Ing. Marco Lara

IBARRA- MAYO-2017
 INTRODUCCIÓN

Se ha tomado en cuenta el incremento en la preocupación por parte de la población con

respecto a la procedencia de los alimentos y como estos son cultivados puesto que en la
actualidad se ha incrementado esta nueva obsesión de las personas por conocer si un
producto fue cultivado orgánicamente o de la forma tradicional con la ayuda de químicos
desde este punto de vista, se ha iniciado esta investigación sobre el nivel de proteínas que
posee las frutas que se consume de forma cotidiana, para así dar a conocer por medio
de una curvatura de crecimiento, en la cual se graficará el nivel de proteína que el fruto
ha obtenido, en este caso se tomará como muestra las manzanas puesto es uno de los
productos agrícolas más consumidos y reproducidos de la forma tradicional y orgánica,
con el cual se llegara a determinar un protocolo para poder tomar una mejor resolución
en la toma de datos puesto que en el conteo de proteínas se conocerá la diferencia de
nutrientes que posee las dos formas de producción agrícola y así poder dar a conocer el
porcentaje de absorbancia y transmitancia que se obtuvo de las múltiples pruebas que se
desarrollaran a lo largo de la práctica, con estas pruebas la finalidad es poder saciar
con una respuesta concreta a los consumidores de que práctica agrícola es la mejor para
el consumo, esto es muy importante puesto que ya con un avalúo de estos frutos ya el
agricultor podrá ingresar estos datos para poder certificar su cultivo para poder exportar
en el producto si así lo deseara.

CAPITULO I
Planteamiento del Problema

Antecedentes de la Investigación

Dependiendo del tipo de material con el que se parte, de eso dependerá si la

cuantificación de proteínas es muy apta puesto que también se plantea una metodología
con el mejor método de cuantificación de proteínas, ya que existen varias formas de
obtener y llegar al mismo resultado pero lo que varía es el nivel de material con el que
se trabaja, por lo cual ya que se trabajará con los tipos de manzanas que son mayormente
consumidos en el mercado como lo son puesto que la que se consume en el mercado
internacional es la manzana verde (Granny Smith) y la roja (Gala).

Las proteínas, que son polímeros de aminoácidos, intervienen en una infinidad de

procesos biológicos, algunas de ellos tan decisivos para el mantenimiento de la vida
como el soporte celular, la tensión y la flexibilidad de los órganos, la estructura del
sistema inmune y las reacciones enzimáticas. (México, 2005)

Estimar la concentración de proteínas es necesario no solo en los laboratorios de

investigación, sino también en la industria alimenticia, farmacéutica y biotecnológica en
general, puesto que ha sido una inquietud desde el inicio la compresión de cuál es el
porcentaje de proteínas en los diferentes materiales orgánicos. (Duhalt, 1998)

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de

rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta,
cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el
diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos. (Emilio Fernández
Reyes y Aurora galvan Cejudo, 1998)

Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en la célula, ellas constituyen
más del 50% del peso seco de la célula. Cada tipo celular, tiene un rol específico
determinado por su composición proteica. Con la posibilidad de que 20 (o 22)
aminoácidos diferentes puedan estar unidos en cualquier orden para conformar
polipéptidos de cientos de aminoácidos, tienen el extraordinario potencial de producir
una gran cantidad de variantes en su conformación. (Qilmes, 2005)

Delimitación del Problema

Para poder dar una correcta apreciación a la cuantificación de proteínas a lo

largo del trabajo, se necesitará tomar datos dependiendo de cómo las muestras
reaccionen, para ello se tomará datos notando ciertas variables que puede existir puesto
que se tomaran las mejores muestras para realizar una curvatura final con los mejores
resultados de absorbancia de proteínas.

El gran número de variedades de manzana que se encuentran en el mercado y

con el limitado tiempo que se posee, este proyecto se encaminara en obtener el protocolo
útil para una óptima cuantificación de proteínas también con el trabajo de solo dos
variedades de manzanas como lo son la manzana verde (Granny Smith) y la roja (Gala).

Teniendo en cuenta la optimización de material ya que se plantea solo utilizar

2 g de material en total para descomponerlo en sobrenadante, se ha tomado como
propósito partir desde una optimización de sobrenadante, para así tomar el mejor método
de cuantificación para desarrollar la curvatura de crecimiento a lo largo del cultivo.

Objetivos de la Investigación

Objetivo General
 • Plantear un protocolo de eficiencia basado en tres métodos (Biuret, Bradford y
CBB) para la cuantificación de proteínas y así dar a conocer las diferencias de
proteínas que posee las manzanas agroquímicas y las orgánicas.

Objetivos Específicos

• Plantear la metodología para optimizar muestras y optimizar cuantificación de

proteínas
• Dar a conocer con la curvatura de crecimiento en los cultivos Agroquímicos y
orgánicos.
• Identificar la absorción y acumulación de proteínas de acuerdo con el tiempo del
cultivo.

Justificación

El incremento en el consumo de productos orgánicos es muy alto en la actualidad

por el aumento en la preocupación de las personas sobre la salud, para que la población
pueda estar conforme con los alimentos que se llega a consumir, por lo cual la
cuantificación de proteínas es muy importante la cuantificación para así poder conocer
la diferencia de los cultivos agroquímicos y orgánicas por lo cual se necesita una
cuantificación de proteínas puesto que aquí se puede conocer en qué estado se
encuentran los cultivos.

Con esta finalidad se puede llegar a una orden o certificado la calidad que pueda dar un
apoyo a los cultivos orgánicos que en la actualidad se desarrollan en pequeñas
comunidades, que se han estado desarrollado en los últimos años por el incremento
desenfrenado de los niveles de personas con problemas de salud por mala alimentación,
en sí esto nos permitirá garantizar que las personas estarán consumiendo una fruta con
altos niveles de proteínas, esto se podrá aplicar en un futuro para exportar frutas típicas
del Ecuador hacia el exterior con un sello de calidad demostrando la superioridad .
 CAPITULO II

2. Marco Teórico

2.1 Proteínas

Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en la célula, ellas
constituyen más del 50% del peso seco de la célula. Cada tipo celular, tiene un rol
específico determinado por su composición proteica. Con la posibilidad de que 20 (o 22)
aminoácidos diferentes puedan estar unidos en cualquier orden para conformar
polipéptidos de cientos de aminoácidos, tienen el extraordinario potencial de producir
una gran cantidad de variantes en su conformación. Esta variedad genera funciones tan
refinadas como las de las enzimas que están involucradas en el metabolismo celular. Una
bacteria puede tener cerca de 1000 proteínas diferentes, en una célula humana puede
haber más de 10.000 clases de proteínas distintas.

La composición proteica de las células en un determinado momento depende del

conjunto de genes que se estén activando y esto está relacionado directamente con las
señales que recibe la célula, de su micro ambiente y de las características celulares que
le son propias. Es decir que el patrón proteico de una célula vegetal será distinto al de
una célula animal, una célula hepática de un ratón será distinta de una célula hepática
de un humano, y a su vez una célula hepática de ratón será distinta a una neurona del
mismo animal (México, 2005)

Fig.1
 2.1.1 Uso de las proteínas

Las proteínas actúan en el mantenimiento, la reparación y el crecimiento de todas

las células. Son un gran componente para los músculos, tejidos y órganos. Y, además,
juegan un rol vital en todos los procesos del organismo como la digestión y el
metabolismo.

Las proteínas de origen vegetal y animal poseen las mismas características puesto que
las dos desarrollan la misma función en el cuerpo, así pues, podemos encontrar proteínas
que ayudan a tener un equilibrio en las funciones vitales del cuerpo.

2.1.2 Características Biológicas

Las cadenas polipeptídicas que forman una proteína se pliegan para formar una
macromolécula con una conformación o forma 3-D específica. Algunas cadenas
polipeptídicas forman largas fibras. Las proteínas globulares están plegadas de forma
muy compacta formando estructuras más o menos esféricas.

• Proteínas de transporte

Se encuentran en la sangre y su función consiste en transportar moléculas

específicas de un órgano a otro. Por ejemplo, la hemoglobina, presente en los glóbulos
rojos, se combina con el oxígeno cuando la sangre pasa a través de los pulmones, y lo
transporta a los tejidos periféricos. Una enfermedad genética, la talasemia, está causada
por un defecto genético en la estructura de esta proteína.

Las lipoproteínas, por su parte, transportan los lípidos ingeridos con la dieta desde el
hígado hasta otros órganos por medio de la sangre.

• Proteínas alimenticias y de reserva

 La ovoalbúmina se encuentra en la albúmina de los huevos y sirve para el
desarrollo del embrión de las aves, mientras que la caseína está presente en la leche (3%
de su peso) y tiene un gran valor nutritivo para los mamíferos.

• Proteínas para el movimiento

La actina y la miosina son proteínas filamentosas que se hallan en las células

musculares esqueléticas permitiendo su contracción y con ello el movimiento.

• Proteínas estructurales

Existen muchas proteínas que sirven de soporte a la estructura de los organismos.

El colágeno, por ejemplo, es una proteína con una gran capacidad elástica, presente en
tejidos tales como los tendones, los cartílagos y la dermis. Otra proteína estructural es
la elastina, que se encuentra en los ligamentos. Las plumas de las aves, las uñas, las
pezuñas y los cabellos están constituidos en su mayor parte por queratina, una proteína
muy resistente e insoluble en agua.

• Proteínas de defensa

Existe una categoría de proteínas cuya función consiste en proteger el organismo

de daños eventuales. Los linfocitos de los vertebrados producen anticuerpos, proteínas
altamente especializadas, capaces de reconocer y destruir los agentes patógenos
externos, tales como virus y bacterias.

El fibrinógeno y la trombina son, en cambio, proteínas que regulan la coagulación e

impiden una copiosa pérdida de sangre cuando se lesiona el sistema vascular. También
las proteínas tóxicas, como la bungarotoxina del veneno de cobra, tienen una función
defensiva.

• Proteínas de regulación

Regulan la actividad de las células e incluyen varias hormonas, como la insulina,

que regula el metabolismo de la glucosa y cuyo déficit provoca la diabetes, o la hormona
del crecimiento, que estimula el alargamiento de los huesos.

2.2 Extracción de Proteínas

La extracción de proteínas celulares comienza siempre con una ruptura celular o

lisis. Los métodos más utilizados se basan esencialmente en la homogenización de los
tejidos y la destrucción de los límites celulares por medio de diferentes procedimientos
físicos y/o químicos. Obteniéndose lo que se denomina extracto crudo. Los objetivos a
lograr en esta etapa son maximizar la liberación de las proteínas de interés, evitando la
degradación térmica o las alteraciones secundarias por oxidación, proteólisis, etc.

Se han desarrollado una amplia gama de técnicas de disrupción celular, que se

usan a escala de laboratorio que se pueden clasificar como: a) métodos físicos
mecánicos: agitación con abrasivos, homogeneización a alta presión o extrusión por
presión; b) métodos físicos no mecánicos: shock osmótico, ciclos de congelación
Introducción a la Biología Celular y Molecular 2 descongelación, sindicación o secado;
c) métodos químicos: tratamiento con álcali, solventes, detergentes, ácidos o sustancias
cao trópicas. (Qilmes, 2005)

2.2.1 Sobrenadantes

La solubilidad de una proteína está influenciada por los siguientes factores su

composición en aminoácidos (una proteína rica en aminoácidos polares es en general
más soluble que una rica en aminoácidos hidrofóbicos) su estructura tridimensional (las
proteínas fibrosas son en general menos solubles que las globulares) el entorno de la
propia proteína. (México, 2005)

2.2.2 Coloración de los Sobrenadantes

En este último sentido, podemos decir que los principales factores ambientales que
influyen en la solubilidad de una proteína son los siguientes: la temperatura, la constante
dieléctrica del medio, el pH del mismo, y la fuerza iónica. Esta práctica se va a referir
esencialmente a esta última.

La coloración que toma los sobrenadantes depende de la manipulación y el ambiente

puesto que en una temperatura alta se activan los fenoles produciendo así una tonalidad
de tono café, dependiendo del nivel de fenoles en el sobrenadante va de una sustancia
transparente como agua, y así se van desarrollando una gama de café hasta un tono café
oscuro.

2.2.3 Fenolización por el Clima

Para la extracción de sobrenadantes es necesario un clima frío puesto que al momento

de trabajar en un clima cálido se empieza a desarrollar la producción de fenoles por
parte del sobrenadante, puesto que esto es un mecanismo de oxidación que poseen las
proteínas al momento de ser extraída de las células.

2.3 Niveles de Proteína los investigadores pueden determinar la secuencia exacta

de aminoácidos de las moléculas de proteínas.

• La estructura primaria: siempre se representa en forma de “collar de perlas”

simple y lineal. Es la secuencia de aminoácidos de la proteína. Nos indica qué
aminoácidos componen la cadena polipeptídica y el orden en que dichos
aminoácidos se encuentran. La función de una proteína depende de su secuencia
y de la forma que ésta adopte.

• Estructura secundaria: como la hélice-a y la lámina plegada-b. Las

designaciones a y b se refieren simplemente al orden en el que estos dos tipos de
estructuras secundarias se descubrieron. La estructura hélice-a es la región
donde la cadena polipeptídica adquiere la forma de espiral helicoidal uniforme.
Esta estructura se forma y mantiene debido a la formación de enlaces de
 hidrógeno entre los aminoácidos de cada una de las vueltas o giros sucesivos de
la espiral.
• La estructura terciaria depende de interacciones entre cadenas laterales La
estructura terciaria de una molécula proteínica corresponde a la forma global
que toma por cada una de sus cadenas polipeptídica. Esta estructura 3-D está
determinada por cuatro factores principales, que implican interacciones entre los
grupos R (cadenas laterales) de la misma cadena polipeptídica. En estas
interacciones se incluyen tanto las débiles (enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos
e interacciones hidrófobas) como los enlaces covalentes fuertes.

• La estructura cuaternaria es la estructura 3-D resultante. Los mismos tipos de

interacciones que producen las estructuras secundaria y terciaria contribuyen
también a la estructura cuaternaria; entre ellas se incluyen los enlaces de
hidrógeno, enlaces iónicos, interacciones hidrófobas y puentes disulfuro

2.3.1 Niveles de absorción

Los niveles de absorbancia que posee las proteínas son de acuerdo a las formas de cultivo
a las que son sometidas puesto que ahí se puede conocer al momento de la extracción del
sobrenadante, empezando desde la coloración que tome hasta la forma con la que
reaccione con las sustancias cuantificadoras.
 2.3.2 Proteínas cuantificadoras es un colorante se emplea en la industria
alimentaria como aditivo capaz de teñir los alimentos de color azul,
su código es el E 133. Se emplea en la tinción de helados y en
repostería. Otros usos son en cosmética y en colutorios bucales. Su
visibilidad y baja toxicidad le convierten en un colorante indicado
en otras ocasiones en las que se requiera como trazador, tal y como
la investigación de corrientes acuíferas y solutos en substratos.2 A
veces se combina con tartrazina (E 102) para dar colorantes verdes.

2.4 Cultivo de Frutas

El suelo alrededor del tronco se debe mantener cubierto con una capa de pasto seco, paja
o aserrín para evitar el crecimiento de malezas y mantener la humedad del suelo.

En los primeros años, mientras las raíces van profundizando en el suelo, el árbol necesita
de mayores cuidados en el control de malezas y riegos

La fertilización se hace a comienzos de la primavera, incorporando superficialmente dos

a cuatro paladas de compost en toda la zona de la sombra de la copa.
Los frutales, por lo general, se forman en vaso con 3 ó 4 ramas principales, podándose
anualmente en invierno. Los citrus sólo necesitan podas leves para limpieza de ramas
secas o brotes muy vigorosos. Es un error podar excesivamente los frutales, porque
demoran su entrada en producción y se debilitan.

2.4.1 Cultivos Orgánicos

Cultivos orgánicos se llama a todos aquellos métodos de producción de alimentos pura y

exclusivamente naturales.

En éstos jamás podremos encontrar aditivos químicos o cualquiera otra sustancia que
contenta materiales sintéticos.

Estas producciones no sólo son beneficiosas para el alimento que logra un estado
completamente natural, sino que además beneficia el medioambiente evitando
contaminar y permitiendo la regeneración del suelo.

Además, los cultivos orgánicos en muchas oportunidades mantienen los nutrientes

esenciales de su naturaleza, elementos que en muchos casos se pierden con la
manipulación genética o utilización de agroquímicos.

Una posible desventaja de los cultivos orgánicos es que el tiempo de demora en su

producción, así como también los costos que demandan son elevados, por lo que
actualmente se trabaja en optimizar los mismos para poder competir con el mercado
actual.

2.4.2 Cultivos Desarrollados por Químicos

Para la producción agrícola se recurre mucho a los productos químicos que se utilizan
como fertilizantes y plaguicidas y para regular el crecimiento de las plantas. Los
plaguicidas se difunden a propósito en el medio ambiente para combatir los insectos, las
malas hierbas, las enfermedades de las plantas y otras plagas que afectan a la producción
agropecuaria, así como para combatir insectos que propagan enfermedades humanas.
Los plaguicidas cumplen una función de reconocida importancia en la agricultura y en
la esfera de la salud pública.

Las ventajas que se empleó reportan, en cuanto elevan el rendimiento económico y los
niveles de la salud y del bienestar humano, han hecho que esta tecnología química se
impusiera rápidamente en el mundo entero. Ahora bien: como su uso imprudente puede
acarrear problemas, es frecuente que en los países adelantados se reglamente y vigile su
empleo. Por desgracia, en muchos países en desarrollo se carece de la experiencia y de
los conocimientos especializados necesarios para resolver este tipo de problemas.
2.5 Reactivos

2.5.1 Reactivos blancos

Son todos aquellos reactivos o sustancias que se emplea para calibrar la longitud de onda
en el espectrofotómetro. Puesto a que siempre se utiliza un poco de reactivo cuantificador
o a su vez un poco de agua, para así notar la absorbancia y transmitancia de luz.

2.5.2 Reactivo Cuantificador de Proteínas

Son todas aquellas sustancias que permiten dar paso de una cierta cantidad de luz, y
dependiendo del método depende el nivel aceptación por parte de los sobrenadantes, en
este caso se utilizó varios compuestos.

2.5.3 Arena Sílice es un compuesto de silicio y oxígeno, llamado comúnmente sílice. Este
compuesto ordenado espacialmente en una red tridimensional (cristalizado) forma el
cuarzo y todas sus variedades. Si se encuentra en estado amorfo constituye el ópalo, que
suele incluir un porcentaje elevado de agua, y el sílex. Es uno de los componentes de la
arena.

2.5.4 Características del Buffer Tris Edta

La solución Buffer Tris-EDTA es una formulación de Tris-HCl 10 mM, EDTA di sódico

1 mM, pH 8,0.

Basándose en estudios de nucleasas de los años 80, el pH se ajusta normalmente a 7,5

para el ARN y 8,0 para el ADN. Se supone que las respectivas nucleasas de ADN y ARN
son menos activas a estos valores de pH, pero se puede usar con seguridad pH 8,0 para
el almacenamiento de ADN y ARN.
El EDTA inactiva adicionalmente las nucleasas, al unirse a los iones metálicos
requeridos por estas enzimas.

2.5.5 Coomassie Brillant Blue

Es el nombre de dos tintes de trifenilmetano similares que se desarrollaron para su uso

en la industria textil, pero ahora se usan comúnmente para la tinción de proteínas en la
bioquímica analítica. El Azul Brillante G-250 de Coomassie difiere del Azul Brillante
R250 de Coomassie por la adición de dos grupos metilo. El nombre "Coomassie" es una
marca registrada de Imperial Chemical Industries.

2.6 Equipos

2.6.1 Electrofotómetro

Es un instrumento usado en el análisis químico que sirve para medir, en función de la

longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos
a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se miden en
una muestra. También se utiliza en laboratorios de química para la cuantificación de
sustancias y microorganismo.

2.6.2 Centrífuga

Una centrifugadora es una máquina que pone en rotación una muestra para –por fuerza
centrífuga– acelerar la decantación o la sedimentación de sus componentes o fases
(generalmente una sólida y una líquida), según su densidad. Existen diversos tipos,
comúnmente para objetivos específicos.

2.6.3 Micropipetas

Es un instrumento de laboratorio empleado para succionar y transferir pequeñas volúmenes

de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas analíticas.

Los volúmenes captables por estos instrumentos varían según el modelo: los más habituales,
denominados p20, p200 y p1000, admiten un máximo de 20; 200 y 1000 μl, respectivamente.
 Capitulo III

3. Marco Metodológico

3.1 Tipo de investigación

3.1.1 Investigación de campo

Es el medio directo o lugar en donde se desarrolla la investigación, en donde se

pueden desarrollar y nos constituye en un proceso sistemático, para empezar una
recolección, tratamiento, análisis, y presentación de datos sobre el tipo de espécimen
, basado en una estrategia de recolección directa de la realidad de las informaciones
necesarias para la investigación.

Este tipo de investigación ayuda a la recolección de las muestras de café que se

desarrolla en los distintos cultivos cafeteros de la zona del litoral, también se
recolectan datos de la zona para tomar múltiples variables que pueden ser positivos
o negativos para la experimentación

3.1.2 Investigación Documental

Es la parte esencial de un proceso de investigación científica, que constituye una

estrategia donde se observa y reflexiona de forma sistemática ante las realidades
usando para ello diferentes tipos de documentos. En la cual se investiga, interpreta,
presenta datos e informaciones sobre un tema a tratar, utilizando para por lo cual se
utiliza, una metódica de análisis; teniendo como finalidad obtener resultados que
pudiesen ser base para el desarrollo de la creación científica.

 Este tipo de investigación ayuda a adquirir la información necesaria para poder

fundamentar y poder desarrollar de mejor manera los distintos pasos a seguir en
la investigación del proyecto.
3.1.4 Investigación Cuasi experimental

También llamada investigación fundamental o investigación pura, se suele llevar

a cabo en los laboratorios; contribuye a la ampliación del conocimiento científico,
creando nuevas teorías o modificando las ya existentes. Investiga leyes y principios

 Ayuda a continuar con el proyecto ya que se basa en anteriores investigaciones y

experimentaciones, para tomar múltiples medidas preventivas para un mejor
desarrollo del cultivo ante las distintas variaciones que se puede presentar a lo
largo de la germinación del embrión.

3.1.4 Investigación Experimental

Se presenta mediante la manipulación de una variable experimental no

comprobada, en condiciones rigurosamente controladas, con el fin de describir
de qué modo o por qué causa se produce una situación o acontecimiento
particular.

3.2 Materiales
3.2.1 Insumos y reactivos

 Coomassie Brillant Blue (

 Buffer Tris-EDTA
(Tris-HCl 10 mM, EDTA di sódico) (1 mM, pH 8.0) (750μL para la reacción)
 Arena Sílice
 Reactivos blancos “agua”
 (H2O) (500μL para calibración de Electrofotómetro)
 Muestras de manzanas tratadas con químicos y de la manera orgánica

3.2.2 Equipos

 Electrofotómetro
 Centrifuga
 Balanza
 Micro pipetas
  Cubetas
 Tubos Ependor
 Morteros
 Tubos para centrífuga
 Pinzas
 Bisturíes
 Espátulas
 Papel filtro
 Picetas

3.2.3 Descripción de procesos

 Como primer paso se toma las muestras de las manzanas de acuerdo al mismo
tiempo de cultivo, seleccionada las muestras se procede a extraer un fragmento
de las dos muestras y se las pesa, se trabaja con fragmentos de 10g. También es
necesario programar la centrífuga a 0ᵒ y 100 RPM (Revoluciones Por Minuto) y
30 min.

 Una vez obtenido los fragmentos se procede a pulverizar en los morteros, una
vez pulverizada colocamos 2g de arena sílice.

 Se pulveriza hasta que quede una pasta, llegado a ese punto procedemos a
colocar 250 μL de Buffer Tris

 Se coloca la mezcla en los tubos para centrífuga y se añade 500 μL de buffer tris
para que toda la muestra sea extraída del mortero, se realiza el mismo proceso
en las dos muestras, cabe decir que se trabaja a 24ᵒ en este ambiente frío se
evita la oxidación de las muestras.

 Ya una vez obtenida las muestras en los tubos de ensayo se pesan las canastillas
de la centrífuga, en el tiempo que demora la centrífuga se prepara el Coomassie
Brillant Blue (CBB)
 Se calibra el Electrofotómetro en una longitud de onda entre 250nnm a 520nnm,
de acuerdo a (Emilio Fernández Reyes y Aurora galvan Cejudo, 1998) es la
longitud de onda perfecta para la perfecta cuantificación de proteínas.

 Terminado el tiempo en la centrífuga se saca los tubos, para que con las micro
pipetas se pueda extraer el sobrenadante y colocar en las cubetas, es necesario
que el sobrenadante sea extraído sin restos de arena sílice, puesto que esto puede
hacer que el paso de luz no sea el adecuado y los datos que se obtenga no sean
los correctos.

 Ya obtenido el sobrenadante de las dos muestras, se calibra el Electrofotómetro

con un “blanco” que puede ser el CBB puro o como en este caso agua, ya que
ahí se podrá adquirir los datos de absorbancia y transmitancia de las muestras.

 Para la lectura de absorbancia y transmitancia se toma 250 μL de sobrenadante

y 250 μL de CBB, se coloca todo en las cubetas.

 Pasado la toma de datos con respecto a las lecturas en el Electrofotómetro, se

procede a almacenar las muestras en los tubos Ependor y en congelación para
que al final de todo el proceso se pueda realizar una diferencia entre muestras de
la misma muestra.

 Con los datos recaudados se procede a realizar el mismo proceso con muestras
del mismo cultivo pero de diferente tiempo, para así ir demostrando mediante una
curvatura de crecimiento la diferencia entre los cultivos químicos y naturales de
manzana.
3.4 Algoritmo Esquemático del proceso

Inicio

Extraer y pulverizar con

250 μL de Buffer Tris y 2g
de Arena sílice las muestras

No

¿La muestra está

completamente
pulverizada?

Si

Colocamos las muestras en

tubos y en la centrífuga
anteriormente programada

No No

¿Se obtuvo
sobrenadante?
 Si

Extraemos todo el
sobrenadante sin restos de
arena sílice
No

¿Quedaron
restos de
arena sílice?

Si

Colocamos en cubetas y
calibramos con agua la lectura
del Electrofotómetro y se realiza
dos lecturas de la misma muestra

No

¿Las lecturas
no coinciden?
 Si

Se toma datos y procesamos en

una tabla de valores para
desarrollar la curvatura de
crecimiento.