Tema 3 Métodos de Separación

INSTRUMENTACIÓN PARA
CROMATOGRAFÍA DE
GASES
“Es la técnica a elegir para la separación de
compuestos orgánicos e inorgánicos térmicamente
estables y volátiles”
Gas Portador
• Debe ser químicamente inerte: He, Ar, N2, CO2, H2
• Su elección normalmente está determinada por el tipo de detector
• Se suministra por medio de reguladores de presión y se mide su flujo por

medio de manómetros y medidores de flujo.
• Antes de ingresar al CG pasa por un tamiz molecular (eliminar agua e

impurezas)
• Presión de entrada: 10 a 50 psi
• Caudal: - 25 a 150 mL/min en columnas de relleno

- 1 a 25 mL/min en columnas capilares
Curva de Van Deemter para diferentes gases
Velocidad lineal cm/s

Sistema de inyección
 La eficacia de la columna requiere que la

muestra sea de un tamaño adecuado.
Volumen de inyección: 1-20 μL
 La inyección lenta de muestras provoca

ensanchamiento de picos y mala resolución.
La muestra es inyectada con una

microjeringa a través de un septum de
goma a una cámara de vaporización
de vidrio donde es vaporizada
instantáneamente (T° 250 °C) y
transportada por el gas al interior de
la columna.
Sistema de inyección
El modo de separación más

extendido en la actualidad se
basa en el empleo de columnas
capilares. Estas columnas
requieren muy pequeños
volúmenes de muestra.
Esto se logra empleando un
inyector que incorpora un divisor
de flujo (split). Normalmente se
introduce en la columna un 1%
Cuando las sustancias a separar
se encuentran a muy bajas
concentraciones se realiza
inyección sin división (splitless)
Configuraciones de Columna y Hornos
Horno termostatizado
T° desde ambiente hasta
400°C
Mejora la resolución
de los picos
Efecto de la
temperatura sobre
la resolución
La temperatura depende
del p.eb. del analito y del
grado de separación
requerido
Columnas cromatográficas
Columnas capilares Columnas Empacadas

Fases estacionarias en cromatografía de gases
No polar
Polar
Usos de columnas en general
Para análisis muy complicados (muestras con mas de 100

componentes): columnas largas (50-60 m) de 0,20 a 0,32
mm de d.i y entre 0,3 y 1 micras de espesor de fase
Para análisis no excesivamente complicados (menos de 100

componentes): longitudes entre 15 y 30 m y d.i de 0,25 a
0,32 mm
Para análisis poco complicados (menos de 30 componentes)

y muestras sucias: usar columnas semi-capilares por
resistencia y facilidad.
Analitos Polares: Alcoholes, ácidos orgánicos y aminas
Analitos de Polaridad media: éteres, cetonas y aldehídos
Analitos No polares: hidrocarburos saturados
Identificación de los componentes separados
• Selección de detectores adecuados que permitan el análisis

cualitativo.
• La selección de un detector está relacionada con la

naturaleza de las sustancias a determinar.
• Los componentes de una muestra se identifican por su

tiempo de retención.
• Se pueden emplear técnicas que aporten una mayor

información sobre la naturaleza de los componentes:
Acoplamiento con Espectrometría de Masas.
DETECTORES
Sistemas de detección
Detector de ionización de llama
Este detector añade hidrógeno al
(FID)
eluyente de la columna.
La mezcla pasa a través del
conducto de un mechero, donde se
mezcla con aire externo y luego
arde.
Cuando entra en la llama material
ionizable del eluyente de la columna
Se quema y la corriente aumenta
notablemente.
Este detector es ideal para compuestos
oxidables.
No responde a los compuestos de
carbono totalmente oxidados, como
carbonilos o carboxilos y grupos éster
 Detector universal (el más usado)
 Resistente y fácil de utilizar
 Destructivo de la muestra
Cromatograma obtenido con detector de ionización
de llama (FID)
Muestra: aguardiente
Detector de espectrometría de masas (MS)
-Los compuestos son ionizados y

fragmentados.
- Los iones resultantes se dirigen a

través de un cuadrupolo y se
ordenan en función de su masa.
- Permite obtener el espectro de

masas del compuesto que ha eluido.
-Detector universal para la mayoría

de los compuestos conocidos.
- Requiere alto vacío

Cromatograma y espectro de masas
Cromatograma y espectro de masas
Cromatografías en
las que la fase móvil
es un líquido:
 Cromatografía de
reparto (especies
polares)
adsorción (Liquido-
sólido)-Especies no
polares
 Cromatografía iónica
(especies iónicas de
bajo PM)
exclusión por tamaños
(geles)-PM > 10000
Cromatografía Líquida de Alta
Eficiencia (HPLC)
Introduction to High
Performance Liquid
Chromatography
HPLC Analysis Parameters
Mobile Phases
Flow Rate
Composition
Injection Volume
Column
Oven Temperature
Wavelength
Time Constant
37
CROMATOGRAFIA DE REPARTO
 Para compuestos polares de baja o moderada masa molecular (< 3000)
1. Cromatografía liquido-liquido (fase estacionaria líquida soportada)-poco

uso por pérdida fácil de fase estacionaria.
2. Cromatografía con fases unidas químicamente: compuestas por sílice y

enlazadas con grupos C8 o C18 (la más utilizada)
Fase Normal Fase Reversa
- Fase estacionaria Polar - Fase estacionaria No Polar

- Fase móvil No Polar - Fase móvil Polar
FASES ESTACIONARIAS PARA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
Polisiloxanos En Fase Reversa

R = - C8 (n-octilo)
- C18 (n-octadecilo)
Elución: disolventes polares (agua, metanol,

acetonitrilo)
En fase normal
- polar
R = -C2H4CN (ciano)
-C3H6OCH2CHOHCH2OH (diol)
-C3H6NH2 (amino)
-C3H6N(CH3)2 (dimetil amino) + polar
Elución: disolventes no polares (etiléter,

cloroformo y n-hexano)
Efecto de la longitud de la cadena en la eficiencia con
fase reversa
R = CH3 R = C8 R = C18
Recipientes para la fase movil
 Recipientes de vidrio, capacidad 500 mL
 Poseen un sistema para eliminar gases disueltos (filtros de poro muy pequeño),
elimina gases y materia en suspensión.
 Elución: - Una mezcla constante de solventes (elución isocrática)
- Variación de la mezcla de solventes (elución en gradiente)
2 ó mas solventes de polaridad diferente

Sistemas de
Se mezclan mezcladores Se va variando la
durante la cantidad de solventes
elución de forma programada
(continua o escalonada)
Efecto del gradiente
Metanol/Agua 40:60
Y aumentando la concentración
de metanol 8%/min
Metanol/Agua 50:50
Sistemas de bombeo
 Deben generar presiones por encima de 6000 psi
 Generar un flujo libre de pulsaciones
 Intervalo de caudales de 0,1 a 10 mL/min
 Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable o

teflón)
 Existen tres tipos: - Bombas recíprocas (las mas utilizadas)

- Bombas de desplazamiento
- Bombas neumáticas
Columnas HPLC
 Tamaño de partícula: 3, 5 y 10 μm
La columna más utilizada: 25 cm de longitud, 4,6 mm de d.i y tamaños de
partículas de 5μm, da 40000 a 60000 platos/metro
Columnas de alta resolución: HPLC rápida. Hasta 100000 platos/m. Ventaja:

rapidez y mínimo consumo de solvente
Horno
En algunos casos se trabaja a temperatura ambiente
El control de la temperatura permite obtener mejores

cromatogramas ( no subir a más de 50 °C)
Los cromatógrafos continenen hornos para controlar la T°

(desde ambiente hasta 150°C)
DETECTORES
DETECTOR UV-Vis
 Volúmen de
muestra: 1 a 10 μL
 Longitud de la
cubeta: 2 a 10 mm
 Presiones no
mayores a 600 psi
Detectores de absorbancia UV con filtros
- Fuente: lámpara de mercurio, filamento de tungsteno

- El filtro permite aislar la línea mas intensa, 254 nm (otras líneas: 250,
313, 334 y 365 nm)
- Aplicación restringida a analitos que absorben en esas longitudes de
onda
 Detectores de absorbancia UV con monocromadores
- Abarcan la radiacion UV y visible

- Se pueden elegir varios modos operacionales
- Se puede elegir una longitud de onda para cada pico o para todo el
cromatograma
DETECTOR DE FLUORESCENCIA
 Alta sensibilidad
 Análisis de materiales farmacéuticos, productos naturales,

muestras clínicas y productos del petróleo.
 Analitos no fluorescentes pueden tener esta propiedad

haciéndolos reaccionar con reactivos que originan derivados
fluorescentes- DERIVATIZACIÓN (Ej. Cloruro de Dansilo
reacciona con aminas , aminoácidos y fenoles)
DETECTOR DE INDICE DE REFRACCIÓN
Mide la diferencia entre el índice de refracción de la muestra y el

índice de refracción del solvente
 Responde a casi todos los solutos (detector universal)
 Fiable y no depende del caudal
Desventajas: - Sensible a la T° (debe ser constante)

- Baja sensibilidad
- No se pueden utilizar en elución con gradiente
Detector de arreglo de diodos
56
Separación
La separación se basa en la migración
Injector
diferencial entre la fase estacionaria y la
fase móvil.
Mixer Fase estacionaria – la fase que
permanece fija en la columna e.g. C18,
Silica
Pumps Fase Movil – Trasnporta la muestra a

través de la fase estacionaria con forme
avanza por la columna.
Column
Detector
Waste
Solvents
High Performance Liquid Chromatograph

58
Separations Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Start Injection time
Column
Detector
Solvents
High Performance Liquid Chromatograph

59
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
60
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
61
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
62
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
63
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
64
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
65
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
66
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
67
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
68
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
69
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
70
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
71
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
72
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
73
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
74
Cromatograma
to – tiempo de elución de un pico no retenido

tR- tiempo de retención- determina la identidad de la muestra
tR
tR
mAU Area or height is proportional
to the quantity of analyte.
to
Injection time
75
How can We Analyze the Sample?
Carbohydrates
1. fructose
2. Glucose
3. Saccharose
4. Palatinose
5. Trehalulose
6. isomaltose 5
2
3
Zorbax NH2 (4.6 x 250 mm) mAU
4
70/30 Acetonitrile/Water 1
6
1 mL/min Detect=Refractive Index
time
76
HPLC Applications
Bioscience
Chemical proteins
peptides
polystyrenes nucleotides
dyes
phthalates
tetracyclines
Pharmaceuticals corticosteroids
antidepressants
barbiturates Consumer Products
lipids
antioxidants
sugars
Environmental
polyaromatic hydrocarbons Clinical
Inorganic ions amino acids
herbicides vitamins
homocysteine
77
Comparison of HPLC and GC
Volatilidad de la muestra Polaridad de la muestra
HPLC HPLC
• No requiere voltilidad • Separa compuestos
polares y no polares
• La muestra debe ser
Soluble en la fase movil. • Iones inorganicos.
GC GC
• Las muestras son no
• La muestra debe
polares ó polares
ser volátil
79
Labilidad Térmica de la Muestra Peso Molecular de la Muestra
HPLC HPLC
• El análisis puede
• No hay límite
llevarse a cabo
a temperatura
• Practicamente la
ambiente.
solubilidad es el límite.
GC GC
capaz de soportar la • Normalmente
alta Tº del puerto de < 500 g/mol
injection y la columna.
80
Preparación de la muestra Tamaño de la muestra
HPLC HPLC
filtrada • El tamaño de la muestra
esta basado en el d.i de
• La muestra debe estar la columna.
en el mismo disolvente
como fase móvil
GC GC
• El solvente debe ser • Generalmente 1 - 5 L

volátil y generalmente
tener menor punto de
ebullición que los
analítos.
81
Mecanismo de Separación Detectores
HPLC
• Tanto la fase HPLC
estacionaria como la • El más común es UV-Vis
fase movil intervienen • Amplio rango de
detectores no destructivos
GC GC
• El mas común es FID,
•La fase movil es universal para
simplemente un compuestos orgánicos
transportador • Menores LD
82
Estado, cantidad y preparación de muestras
• Los líquidos que sean acuosos o miscibles en el agua se pueden
analizar directamente.
• Los líquidos, sólidos y gases inmiscibles en agua deben ser

extraídos o disueltos antes del análisis.
• Dilución y filtración.
• Se requiere extracción para muestras no acuosas
• Preconcentración para muestras diluidas.
• Derivatización precolumna en algunos casos.
• Volumen de inyección: de 1 a 200 µL

Análisis Cuantitativo basado en la integración del área bajo los
picos.
 Calibración con patrones o estándares: Realizar una recta
de calibrado y posteriormente el análisis e integración de
una muestra de concentración desconocida.
Método del Estándar
Externo
Método del estándar interno
Método de la Adición Estándar

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INSTRUMENTACIÓN PARA

• Debe ser químicamente inerte: He, Ar, N2, CO2, H2

• Su elección normalmente está determinada por el tipo de detector

• Se suministra por medio de reguladores de presión y se mide su flujo por

• Antes de ingresar al CG pasa por un tamiz molecular (eliminar agua e

• Presión de entrada: 10 a 50 psi

• Caudal: - 25 a 150 mL/min en columnas de relleno

Velocidad lineal cm/s

 La eficacia de la columna requiere que la

 La inyección lenta de muestras provoca

La muestra es inyectada con una

El modo de separación más

Columnas capilares Columnas Empacadas

Para análisis muy complicados (muestras con mas de 100

Para análisis no excesivamente complicados (menos de 100

Para análisis poco complicados (menos de 30 componentes)

• Selección de detectores adecuados que permitan el análisis

• La selección de un detector está relacionada con la

• Los componentes de una muestra se identifican por su

• Se pueden emplear técnicas que aporten una mayor

-Los compuestos son ionizados y

- Los iones resultantes se dirigen a

- Permite obtener el espectro de

-Detector universal para la mayoría

- Requiere alto vacío

1. Cromatografía liquido-liquido (fase estacionaria líquida soportada)-poco

2. Cromatografía con fases unidas químicamente: compuestas por sílice y

Fase Normal Fase Reversa

- Fase estacionaria Polar - Fase estacionaria No Polar

Polisiloxanos En Fase Reversa

Elución: disolventes polares (agua, metanol,

Elución: disolventes no polares (etiléter,

 Recipientes de vidrio, capacidad 500 mL

 Elución: - Una mezcla constante de solventes (elución isocrática)

- Variación de la mezcla de solventes (elución en gradiente)

2 ó mas solventes de polaridad diferente

 Deben generar presiones por encima de 6000 psi

 Generar un flujo libre de pulsaciones

 Intervalo de caudales de 0,1 a 10 mL/min

 Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable o

 Existen tres tipos: - Bombas recíprocas (las mas utilizadas)

Columnas de alta resolución: HPLC rápida. Hasta 100000 platos/m. Ventaja:

En algunos casos se trabaja a temperatura ambiente

El control de la temperatura permite obtener mejores

Los cromatógrafos continenen hornos para controlar la T°

- Fuente: lámpara de mercurio, filamento de tungsteno

 Detectores de absorbancia UV con monocromadores

- Abarcan la radiacion UV y visible

 Análisis de materiales farmacéuticos, productos naturales,

 Analitos no fluorescentes pueden tener esta propiedad

Mide la diferencia entre el índice de refracción de la muestra y el

 Responde a casi todos los solutos (detector universal)

 Fiable y no depende del caudal

Desventajas: - Sensible a la T° (debe ser constante)

Pumps Fase Movil – Trasnporta la muestra a

High Performance Liquid Chromatograph

Start Injection time

High Performance Liquid Chromatograph

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time