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Analyse biochimique

L’analyse biochimique : Le prélèvement

1-Introduction :

La biochimie clinique est le domaine de la Biologie médicale qui est en général concerné par
l'analyse des molécules contenues dans les fluides corporels (sang, liquide céphalo-
rachidien, urines, etc.) et l'interprétation des résultats de ces analyses par un biologiste
médical dans le but de caractériser l'origine physiopathologique d'une maladie.

La biochimie clinique se cantonne à la recherche ou au dosage des molécules pouvant être


impliquées dans une pathologie.

Le travail du biologiste médical spécialisé en biochimie clinique consiste en l'interprétation


des résultats en fonction du reste du bilan biologique et avec l'aide du clinicien. Cette
interprétation prend en compte les caractéristiques physiologiques de l’animal (âge, sexe,
poids...) et les symptômes repérés par le clinicien dans le but d'aboutir avec lui (à l'aide, si
besoin, de tests supplémentaires) au diagnostic de la pathologie.

2- La place de la biochimie clinique en médecine vétérinaire :

En médecine vétérinaire, le recours aux épreuves de laboratoire est aussi important pour le
clinicien que les commémoratifs et l’examen clinique de l’animal. Dans certains cas, de telles
épreuves sont même plus importantes, car les résultats peuvent fournir une preuve absolue
de l’altération physiologique résultante d’un état pathologique. L’appréciation correcte de
l’état physiologique d’un animal dépend de la combinaison des résultats des examens de
laboratoire, des examens cliniques et des commémoratifs.
En résumé, l’intérêt évident des dosages biochimiques est de permettre au clinicien de
diagnostiquer des affections que les autres méthodes de diagnostique révèlent difficilement.

3- Les différentes étapes d’une analyse biochimique


3. a-Demande d’examen :
Cette procédure commence avec le formulaire de demande d’examen qui doit
comporter les éléments suivants :

 L’espèce, le nom ou le numéro d’identification de l’animal, âge, le sexe


 Identification du propriétaire de l’animal et du demandeur (vétérinaire)
 Diagnostic- caractéristiques cliniques
 Examen demande
 Nature du prélèvement
 date du prélèvement
 Traitement médicamenteux en cours

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Il est indispensable de fournir suffisamment d’information pour l’identification de l’animal.


Des données cliniques précises et la nature des traitements suivis, notamment
médicamenteux ou même l’état physiologique de l’animal doivent paraitre dans le
formulaire afin de permettre aux biologistes d’apprécier les résultats dans le contexte
clinique. Les médicaments sont susceptibles d’interférer in vitro avec les méthodes
analytiques, ou de provoquer des modifications in vivo, simulant un processus pathologique.
Par exemple les œstrogènes augmentent la thyroxine binding globuline (TBC) et de ce fait la
concentration totale en thyroxine augmente.

3.b-Le recueil des échantillons biologiques : le prélèvement

Le prélèvement fourni doit être adapté à l’examen demandé. La plupart des analyses
biochimiques sont réalisées sur le sang et l’urine. Mais dans des conditions
particulières, le praticien pourra prélever d’autres liquides tels que, le lait, le liquide
céphalorachidien, liquide d’épanchement ainsi que des fragments tissulaires.
La plupart des analyses peuvent être réalisées indifféremment sur sérum ou plasma
mais dans certain cas, il est très important de prendre en considération la nature du
milieu. Par exemple, le sérum est nécessaire pour l’électrophorèse des protéines.

4- Le prelevement sanguin :
Le sang est un liquide rouge ,visqueux,circulant dans les artéres et les veines sous l’action de
la pompe cardiaque. Le volume sanguin est constitué par des cellules (erythrocytes,
leucocytes, plaquettes) et par le pasma. Ce dernier est le composant liquide du sang,dans
lequel les cellules sanguines sont en suspension. Il constitue 55 % du volume total du sang.

4.a-Modalité de prélèvement : la plupart des prélèvements sont réalisées par ponction


veineuse de la veine, le sang artériel est réservé à des dosages particuliers tels que : gaz du
sang et l’équilibre acido-basique. Chez les carnivores domestiques, la ponction est réalisée
sur une veine périphérique de calibre moyen (veine saphène ou radiale), pour des animaux
de petite taille ou chez le chat , il est préférable d’effectuer le prélèvement à la veine
jugulaire dont le calibre permet le recueil d’une plus grande quantité de sang et un
écoulement facile de celui-ci.Le volume recueilli est d’environ 5ml. Chez l’’oiseau, le volume
du sang total représente de 7 a 10 % de son poids corporel, de ce fait la quantité prélevée
est comprise entre 0,5 a 2 ml, en utilisant une aiguille à insuline dans la veine alaire ou la
veine jugulaire droite. Le sang capillaire convient pour des analyses cytologiques, prélevé au
niveau des vaisseaux capillaires, par une piqure franche à l’oreille, la première goutte n’est
pas recueillie.

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4. B-Nature de l’échantillon :

 Le plasma : lorsque le dosage porte sur le plasma, le prélèvement se fait sur un


anticoagulant, le sang est ensuite centrifugé à 3000g pour séparer les globules
rouges et éviter l’hémolyse.
Au sein du plasma le fibrinogène n’est pas consommé, ce dernier y sera présent en plus des
sels minéraux, des protéines, du glucose, des lipides, des vitamines…

Les anticoagulants utilisés :


Par définition, les anticoagulants sont des substances qui s’opposent à la coagulation du
sang.
Selon leurs mécanismes d’action on distingue :
- Les anticoagulants qui complexent le calcium :
Les oxalates : les oxalates (sodium, lithium, potassium) empêchent la
coagulation du sang en se combinant avec le calcium. Les oxalates
conviennent pour le dosage du fibrinogène et des facteurs de
coagulation.
Les citrates : il fixe également le calcium, utilisé pour la détermination
de fibrinogène, des facteurs de coagulation ou pour la réaction de
sédimentation
EDTA : l’éthylène diamine tétra acétique complexe le calcium et inhibe
la coagulation. Il est réservé en particulier en hématologie.
Anticoagulant de choix car sa qualité première est de respecter
l’intégrité et la morphologie des cellules sanguines. L’EDTA interfère
avec le dosage de nombreuses enzymes sériques.

- Les anticoagulants inhibant les enzymes de la glycolyse :


Fluorure de sodium : le fluorure de sodium agit en inhibant la
glycolyse, il est souvent associer a l’oxalate
- Les inhibiteurs d’enzymes de la coagulation :
L’héparine : mucopolysaccharide, anticoagulant par inhibition de
transformation de la prothrombine en thrombine et de la conversion
du fibrinogène en fibrine. L’héparine présente peu d’inconvénient. Il
est l’anticoagulant de choix pour les dosages biochimiques.

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CHOIX DES TUBES DE PRELEVEMENT

ANALYSE Couleur du bouchon anticoagulant


biochimie vert Héparine
glycémie gris Fluorure de sodium
hématologie violet EDTA
Vitesse de sédimentation noir Citrate de sodium
hémostase bleu Citrate de sodium
Sérologie, hormonologie, rouge Absence
pharmacologie, toxicologie d’anticoagulant
Tube sec

 Le sérum : si le dosage porte sur le sérum, le prélèvement se fait sur tube sec. Le
fibrinogène est alors consommé. Le sérum renfermera donc tous les éléments
contenus dans le plasma à l’exception du fibrinogène. Bien que le dosage de la
plupart des paramètres biochimiques puisse être effectue sur sérum, le dosage
différé du glucose sanguin doit impérativement être réalisé sur du sang conservé sur
un anticoagulant inhibiteur de la glycolyse (fluorure de sodium). Le sérum est
recommandé pour le dosage des protéines et la réalisation du protéinogramme, ainsi
que le dosage des acides biliaires. Le sérum est obtenu après recueil du sang sur un
tube sec et rétraction du caillot sanguin dans le tube conservé à température
ambiante (20°C) en position verticale. Une centrifugation immédiate entraine parfois
la formation d’un énorme coagulum rendant le recueil du sérum difficile.

Choix sérum ou plasma :


Certaines analyses ne peuvent être effectuées que sur du sérum ou du plasma ou du sang
total. En pratique la préparation d’un plasma est plus rapide, permet de récupérer un
volume supérieur à celui du sérum et limite notablement l’hémolyse dans les espèces dont
les globules rouges sont fragiles comme le chien ou le mouton. Par ailleurs, pendant la
coagulation, certains constituants fuient des cellules (enzymes, potassium…) et modifient
légèrement la composition du sérum.
Cependant, sérum et plasma ne sont pas utilisables indifféremment pour toutes les analyses.
Par exemple, le sérum doit être utilisé pour l’électrophorèse des protéines en raison de
l’interférence du fibrinogène avec les betas globulines.

4. c- Conservation et transport du prélèvement :


L’objectif de la conservation est de permettre la stabilité de l’analyte. Un analyte est dit
stable en fonction du temps lorsque sa concentration ne varie pas ou peu dans le spécimen
Les modifications possibles des analytes (cellules ou paramètres biochimiques) sont
nombreuses :- la dégradation de certains constituants par action d’enzymes du plasma ou de
cellules sanguines (par exemple le glucose perte de plus de 7% par heure) ;- la libération à

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partir de cellules de constituants intracellulaire (par exemple le potassium chez les espèces
comme le chat ou le chien ayant une forte concentration intra érythrocytaire de cet ion) ;-
l’instabilité à la lumière de la bilirubine ; - la volatilité (gaz du sang)
Le sang total ne peut pas être conservé plus de 4 heures même à 4°C. En hématologie, le
sang total prélevé sur EDTA conservé à 4°C en position verticale, permet d’obtenir après 24
heures des valeurs correctes des numérations cellulaires, l’hématocrite étant quant à lui
légèrement augmenté. La conservation des paramètres sanguins à 4°C sur Le plasma ou le
sérum diffère en fonction du substrat. (Voir tableau ci-dessous).
Durée de conservation des paramètres sanguins
Paramètres Sang total Sérum ou Sérum ou Sérum ou
plasma plasma plasma
T˚ ambiante 4˚C Congelé
Protéines 7 jours 30 jours Stable
Urée Tube sec : quelques minutes 1 jour 3 jours Stable
Héparine :< 8 heures
EDTA : < 8 heures
Créatinine Tube sec : quelques minutes 1 jour 1 jour Stable
Héparine :< 8 heures
EDTA : < 8 heures
Glucose Tube sec : quelques minutes 45 minutes 2 jours Stable
Héparine : < 10 minutes
EDTA : < 10 minutes
Fluorure : stable
Bilirubine Tube sec : quelques minutes 2 jours Quelques jours 90 jours
Héparine : < 2 heures (obscurité)
cholestérol Tube sec : quelques minutes 7 jours 7 jours Stable
Héparine : < 8 heures
EDTA : < 8 heures
GGT Tube sec : quelques minutes 7 jours 7 jours
Héparine : < 8 heures
PAL Tube sec : quelques minutes 2 jours 7 jours Stable
Héparine : < quelques
minutes
ALAT et ASAT Tube sec : quelques minutes 8 heures 3 jours Stable
Héparine :< 1 heure
CPK Tube sec : quelques minutes 2 jours 7 jours Stable
Héparine : < 8 heures
LDH 7 jours instable Instable
Calcium Héparine : 3 jours 7 jours stable Stable
Phosphore 4 jours 7 jours Stable
Magnésium Tube sec 7 jours 7 jours Stable
Potassium Héparine 14 jours 30 jours Stable
Oxalate : < 1 heure
Tub sec
Sodium Héparine 14 jours 30 jours Stable
Oxalate : < 1 heures
Tube sec
Chlorure Héparine 7 jours 7 jours Stable
Oxalate :< 1 heure

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4.d-Les sources d’erreurs : des erreurs peuvent survenir à différentes phases du processus
analytiques :
 A la phase préanalytique : en dehors du laboratoire

- Thérapeutique suivie par l’animal.


- L’heure de prélèvement, le non respect du jeun.
- La position du patient (animal agité ou actif).
- L’hémolyse
- Le non respect du ratio sang/anticoagulant (un excès d’EDTA peut
provoquer un rétrécissement des hématies, les tubes de prélèvement
doivent être remplis complètement).
- Le prélèvement sur un anticoagulant inadéquat.
- La mauvaise homogénéisation de l’échantillon.
- Un matériel de prélèvement inadéquat.
- Un délai de transmission prolongé des prélèvements.

 A la phase analytique, dans le laboratoire avec par exemple une erreur humaine ou
analytique.
 A la phase post analytique, avec une mauvaise transcription des résultats.
Les résultats : après des efforts considérables, des résultats apparaissent (des chiffres sur
papier), la plupart des résultats sont quantitatives. Les concentrations sont exprimées en
mm/L, en g/L, en UI/L. il est d’une importance cruciale de comprendre ce que les valeurs
des paramètres sanguins une fois obtenus signifient. Un résultat doit être validé par
comparaison avec la valeur attendue chez des individus homologues et en bonne sante.
Influence de l’hémolyse : l’hémolyse est l’une des principales causes d’erreur analytique
autant en hématologie qu’en biochimie. L’hémolyse peut être la conséquence pathologique
de différentes affections, mais elle est le plus souvent due aux difficultés rencontrées lors de
la réalisation du prélèvement sanguin. Certains animaux peuvent présentés une certaines
fragilité érythrocytaire comme chez les carnivores ou les moutons, toute fois on reconnait
que les causes principales de l’hémolyse sont artefactuelles.
L’hémolyse devient visible après centrifugation chez le chien lorsque la concentration en
hémoglobine dans le sérum ou le plasma atteint et dépasse 0,1g/dl.
L’hémolyse produit trois types d’effets induisant des erreurs de dosage :
- La libération de constituants intra érythrocytaires peut augmenter de
manière significative le dosage plasmatique ou sérique de ces derniers
- Inversement, l’hémolyse a un effet de dilution pour le dosage de
constituants essentiellement sériques (calcium, sodium)
- L’hémolyse interfère sur le plan analytique en augmentant la densité
optique une lecture entre 540 et 590nm ou en modifiant le pH de
certaines réactions enzymatiques.

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Causes principales d’hémolyse in vitro :


- Conservation trop longue d’un sang non centrifugé
- Aspiration ou éjection forcée à travers l’aiguille
- Agitation trop vigoureuse du tube
- Inadéquation volume du vide et calibre veineux
- Utilisation de matériel humide ou souillé par des détergents.

5-L’urine : l’urine constitue le produit final d’un processus physiologique complexe et


délicatement équilibré. De nombreux mécanismes physiologiques ou pathologiques peuvent
avoir une influence sur ces composants. L’urine est modifiée non seulement par les maladies
atteignant les reins mais de nombreux troubles extrarénaux en provoquent des
modifications qui peuvent avoir une signification diagnostic.
5- a-Techniques de prélèvement : trois techniques permettent de prélever de l’urine.
 Miction spontanée ; l’inconvénient majeur de ce mode de prélèvement est
le contact de l’urine avec l’appareil génital externe et de la peau à l’
origine des débris cellulaires et de germes dans l’urine émise. Elle doit
être proscrite pour un examen bactériologique. L’analyse physicochimique
sur des urines est couramment admise ; il semble préférable dans ce cas
de privilégier les urines de milieu de miction
 Sondage urétral : ce geste permet une évaluation simple de la lumière
urétrale. Cependant, l’urine ainsi prélève est souvent modifiée par les
microtraumatismes induits par celui-ci (sang, cellules). Il est à signaler
que l’altération de l’urothelium associée au non-respect des règles
d’asepsie est une cause fréquente d’infection du tractus urinaire.
 Cystocentése : il s’agit de prélever directement les urines dans la vessie au
moyen d’une ponction transabdominale à l’aiguille fine. Elle est réalisée
sur animal vigile ; un guidage échographique peut faciliter la localisation
de la vessie (animaux gras, vessie de petite taille). Il est préférable d’éviter
cette technique de prélèvement sur des vessies très distendues. Cette
technique permet un recueil d’urine parfaitement stérile. En revanche,
elle induit fréquemment une hématurie microscopique.

5.b-L’analyse urinaire : il est préférable de prélever les urines du matin, ce qui permet
de s’affranchir d’une dilution occasionnée par une consommation d’eau importante.
Le prélèvement urinaire doit être réalise avant tout traitement qui pourrait altérer la
fiabilité des analyses. Les urines doivent être analysées immédiatement après le
recueil ou conservées au maximum pendant 6 heures à 4°C. Une alcalinisation et une
cristallisation in vitro sont fréquemment observées sur des urines dont le délai de
conservation a été trop long.