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Les Fascicules de

Biologie clinique
Institut Pasteur d’Algérie
Collection Techniques
Microbiologiques

Diagnostic
Bactériologique des
infections
Broncho-pulmonaires
N.Ramdani-Bouguessa
K-Rahal

Les éditions
Pirates

Année 2005
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Institut Pasteur d’Algérie

Techniques microbiologiques

Diagnostic
Bactériologique des
Infections
Broncho-Pulmonaires
N.Ramdani-Bouguessa

K.Rahal

Année 2005

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Plan
I-Introduction 03
II-Rappel anatomique : 04
III-Epidémiologie : 06
III.1- Dans le monde : 06
III.2-En Algérie 09
IV. Définition et manifestations cliniques : 12
V-Les agents étiologiques : 14
VI- Le diagnostic Bactériologique 20
VI.1-Les Prélèvements 20
VI.2-L’examen direct 25
VI.3-Culture 27
VI.4-Identification bactérienne : 33
VI.4.1- Streptococcus pneumoniae : 33
VI.4.2-Haemophilus 37
VI.4.3-M.catarrhalis : 38
VI.5-Recherche de Chlamydiae, Mycoplasmes et Legionelles : 39
VI.5-1-Les Chlamydiae 39
VI.5.2-Mycoplasma pneumoniae 46
VI.5.3-Legionella pneumophila : 51
VI.5-Bordetella (voir fascicule IPA 2004) : 55
Référence : 57
Annexes 60

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

I-Introduction :
Les infections respiratoires posent un problème de santé publique, elles
sont la deuxième cause de mortalité après les diarrhées chez l’enfant dans
les pays en développement.

Malgré leur origine virale dans environ 75% elles restent la première cause
de prescription d’antibiotiques.

L’épidémiologie des germes responsables est variable selon les pays.

L’infection respiratoire basse est définie comme une affection affectant le


territoire sous glottique de l’arbre respiratoire.

Le diagnostic au laboratoire n’est pas systématique, il est cependant


indiqué dans les cas suivants :

 Établir l’épidémiologie des agents pathogènes.


 Le diagnostic d’une infection respiratoire grave en milieu hospitalier
(nosocomiale ou communautaire).
 Infections respiratoires survenant en terrain particulier tel que :
mucoviscidose ou une pathologie immunosuppressive (hémopathie
maligne, Sida).

Les techniques diagnostiques sont diverses du fait de la multiplicité des


agents pathogènes, toutefois elles restent orientées par la clinique.

Les prélèvements font appel à des gestes invasifs (hémoculture, aspiration


bronchique) compte tenu de l’inaccessibilité du site infecté, ce qui est un
facteur limitant pour le diagnostic de routine de ces infections.

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II-Rappel anatomique :
Les voies aériennes inférieures sont représentées par l’arbre bronchique
dont l’extrémité proximale est représentée par la trachée qui se subdivise
en deux branches souches, chacune pénétrant le poumon droit et gauche.

Cet appareil est protégé par la cage thoracique.

A l’intérieur des poumons, chaque bronche se ramifie en bronches


secondaires et tertiaires, elle-même se subdivise ultérieurement en de plus
petits conduits, les bronchioles qui s’achèvent par des sacs aériens appelés
alvéoles.

Les poumons sont enveloppés par une fine membrane appelée la plèvre qui
est constituée de deux feuillets l’un viscéral et l’autre pariétal :

Le premier tapisse le poumon et le deuxième la paroi thoracique.

Une cavité virtuelle existe entre les deux feuillets dont la fonction est
d’assurer la lubrification de l’interface, en diminuant le frottement entre le
poumon et la cage thoracique.

À l’état normal l’espace pleural contient une faible quantité de liquide


stérile, évalué chez le sujet sain entre 1 et 20 ml.

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III. Épidémiologie :
III.1- Dans le monde :
Dans les pays développés S.pneumoniae, H.influanzae et M.catarrhalis sont
les 3 principales bactéries isolées dans les pneumonies.

Dans les pays en voie de développement S.pneumoniae, H.influanzae et


S.aureus sont prédominants alors que M.catarrhalis est rare.

Cette différence est liée aux conditions socio-économiques, au terrain sous


jacent notamment la malnutrition faisant le lit de pneumonies graves à
S.aureus et aux conditions climatiques.

Il a été noté que M.catarrhalis était plus retrouvée dans les régions froides,
la fréquence de cette bactérie peut être sous estimée en Algérie et donc non
identifiée par manque de moyens (Galerie NH).

D’autres agents étiologiques sont impliqués dans les pneumopathies


surtout en ambulatoire notamment Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia
pneumoniae et Legionella pneumophila, cette dernière survient surtout
chez les patients immunodéprimés alors que les deux premières sont
retrouvées chez l’enfant âgé de plus de 3 ans.

Les mycoplasmes sont responsables de 20 à 40 % des pneumonies


communautaires chez le grand enfant et Chlamydia pneumoniae de 2 à 20
%.

Dans les pays en développement S.pneumoniae, H.influanzae et S.aureus


sont les 3 principales bactéries impliquées dans les pneumonies. Les virus
étaient retrouvés dans 30 à 40 %.

La part des chlamydiae n’est pas très bien documentée dans ces pays
contrairement aux USA ou 30 à 35 % des pneumonies dans les 4 mois de vie
sont dues à C.trachomatis, en Argentine elle est impliquée dans 19.8 %, la
contamination se fait probablement lors du passage de la filière génitale
maternelle. En Suède C.pneumoniae est responsable de 45 % des
pneumonies.

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Les agents étiologiques sont différents en fonction du type de l’infection


respiratoire basse et du terrain du patient.

III.1.1-Pneumopathies communautaire :
Parmi les infections bactériennes > 90 % sont dues à :

 Streptococcus pneumoniae.
 Haemophilus influanzae.
 Mycoplasma pneumoniae.
 Legionella pneumophila.
 Chlamydia pneumoniae.

III.1.2-Pneumopathies nosocomiales :
Ces infections sont polymicrobiennes dans un tiers des cas. Les BGN sont
responsables dans 60 % et staphylocoques dans 40 %.

Pour les pneumopathies nosocomiales précoces survenant moins de 5


jours d’hospitalisation c’est la flore endogène du patient qui est impliquée
notamment :

 S.pneumoniae.
 H.influanzae.

Pour les pneumopathies nosocomiales tardives survenant après le 5ème jour


d’hospitalisation ce sont les bactéries hospitalières qui sont retrouvés :

 P.aeruginosa
 S.aureus.
 S.épidermidis.
 Klebsiella, Enterobacter, Serratia.
 Acinetobacter baumanii.
 Anaérobies.

III.1.3-Surinfection de bronchopathies chroniques


obstructives (BCPO) :
 Streptococcus pneumoniae.
 Haemophilus influanzae.
 M.catarrhalis.

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 S.aureus.
 K.pneumoniae
 P.aeruginosa.

III.1.4-Pneumopathie de l’immunodéprimé :
Germes déjà cités dans les autres pneumopathies et les germes
opportunistes :

 Pneumocystis carinii.
 Toxoplasma gondii.
 Cytomégalovirus CMV.
 Aspergillus.
 Candida.
 Cryptococcus.
 Mycobactéries.

III.1.5-Surinfections bronchiques au cours des


mucoviscidoses :
 Streptococcus pneumoniae.
 Haemophilus influanzae.
 S.aureus
 M.catarrhalis.
 K.pneumoniae
 P.aeruginosa.
 B.cepacia
 Mycobactéries.
 Nocardia
 Mycoplasmes.
 Coxiella
 Chlamydia.

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III.2-En Algérie
L’épidémiologie des infections respiratoires aigues (IRA) basses n’est pas
bien documentée microbiologiquement en Algérie.

Une étude réalisé sur les IRA basses virales entre 1983 et 1984 au CHU
Béni-Messous avait retrouvé que les IRA représentaient 49 % des motifs de
consultation avec une nette prédominance de la localisation haute dans 88
%, l’âge le plus touché est le nourrisson de moins de 24 mois.

Les étiologies virales des bronchiolites durant cette enquête n’ont été
recherchées que sur 64 couples de sérums par immunofluorescence
indirecte réalisée au service de virologie de l’IPA.

La fréquence des virus était de 31 % pour le virus parainfluanzae 3, de 66 %


pour l’adénovirus et de 3 % pour le virus respiratoire syncitial (VRS).

Le petit nombre d’effectif ainsi que l’absence de réalisation de


l’immunofluorescence directe expliquent que le VRS ne soit pas au premier
rang.

Une autre étude récente clinique et virologique réalisée sur les


bronchiolites du nourrisson entre novembre 98 et mars 99 dans 2 services
de pédiatrie (Bab el oued et Bologhine) et où l’immunofluorescence directe
a été réalisée sur 125 aspirations naso-pharyngées.

La fréquence des virus était de 68 % pour VRS, 2 % pour le virus influanzae,


de 1.5 % pour l’adénovirus et dans 1.5 % des cas une association de deux
virus a été retrouvée.

L’analyse clinique de cette même étude a montré que la tranche d’âge la


plus touchée était de 3 à 12 mois dans 76 % de la population infantile
étudiée et que 63 % des nourrissons avaient reçu au préalable un
antibiotique.

Une étude au CHU de Béni-Messous portant sur les étiologies bactériennes


des IRA basses chez l’enfant hospitalisé entre 1996 et 2000, a inclus 174
patients chez lesquels des hémocultures ainsi que des ponctions pleurales
pour la culture et la recherche des antigènes solubles ont été effectués.

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La preuve bactériologique a été portée dans 40 % des cas, S.aureus,


S.pneumoniae et H.influanzae étaient les plus fréquents (tableau 1).

Les cultures étaient positives dans 28,6 % des cas pour les hémocultures et
dans 64.5 % des cas pour les pleurésies.

Tableau1 : Répartition globale des germes retrouvés dans les


infections respiratoires basses chez l’enfant.
0-28 j 29 j-2 >2 - 5 ans > 5 ans Total
S.pneumoniae - ans
8 6 5 19
H.influanzae - 8 1 1 10
S.aureus 3 7 6 5 21
P.vulgaris - 1 - - 1
E.coli - 1 - - 1
Streptocoques 1 3 1 1 5
Anaérobies - - 2 - 2

Une autre étude portant sur les suppurations pleuro-pulmonaires


communautaires et nosocomiales, menée par le service des anaérobies à
l’institut pasteur d’Alger a recruté 108 prélèvements (95-96), dont la
majorité était des liquides pleuraux, 64 prélèvements étaient positifs.

L’infection était mixte dans 53.1 % des cas, les anaérobies étaient retrouvés
dans 39.5 % des bactéries totales isolées.

Cette étude n’a toute fois pas séparé les infections communautaires des
infections nosocomiales.

Quant aux pneumopathies nosocomiales, l’écologie microbienne dépend de


l’installation de la ventilation assistée.

Classiquement on distingue les pneumopathies acquises avant le 5ème jour


de ventilation et ou les germes responsables sont ceux de la flore endogène
et les pneumopathies acquises après le 5ème jour et qui sont dues aux
bactéries nosocomiales.

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Une étude au cours de l’année 2003 à 2004 par le service de


microbiologique du CHU Mustapha Bacha retrouve sur un nombre de 51
prélèvements distaux protégés (PDP) les bactéries suivantes.

Tableau 2 : Répartition des bactéries dans les pneumopathies


nosocomiales :
Nombre Pourcentage %
Entérobactéries 31 70.4
Pseudomonas 29 65.9
4
Acinetobacter 17 38.6
S.aureus 5 11.3
SCN 4 9
Haemophilus 3 6.8
Streptococcus 3 6.8

Les entérobactéries les plus fréquemment retrouvées étaient K.pneumoniae


et E.coli

60 % des cultures étaient mixtes, l’association Pseudomonas et


Acinetobacter était plus retrouvées (9 patients).

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IV. Définition et manifestations


cliniques :
L’infection respiratoire basse est définie comme l’infection de l’étage sous
glottique de l’appareil respiratoire.

Chez l’adulte les infections respiratoires basses se manifestent par des


bronchites, pneumonies ou pneumopathies, et des suppurations pleuro-
pulmonaires.

Chez l’enfant notamment le nourrisson la bronchiolite est de loin la plus


fréquente et est d’origine virale.

La pneumonie ou pneumopathie est le plus souvent bactérienne.

IV.1-Bronchites aigues :
C’est l’inflammation de l’arbre trachéo-bronchique secondaire à une
agression le plus souvent virale. Elle débute par une toux douloureuse non
productive puis associé à une expectoration avec parfois une fièvre.

IV.2-Exacerbation aigue d’une bronchite


chronique :
La bronchite chronique est définie par l’association d’une toux et d’une
expectoration 3 mois par an pendant au moins deux années consécutives.
Elle est caractérisée par l’augmentation du volume de l’expectoration, de sa
purulence et/ou de la dyspnée.

Les bactéries les plus fréquentes sont : H.influanzae, S.pneumoniae et


B.catarrhalis.

IV.3-Les pneumonies :
Sont caractérisées par l’absence d’infection associée des voies respiratoires
supérieures, la présence d’une polypnée > 25/mn et/ou d’une tachycardie >
100/mn et/ou d’une fièvre >37.8°C, la présence d’anomalies auscultatoires
notamment des râles crépitants.

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La pneumonie est dite communautaire lorsqu’elle est acquise en


extrahospitalier ou au cours des 48 premières heures d’hospitalisation.

L’agent causal reste méconnu dans plus de 50 % des cas, le pneumocoque


est le plus fréquent, H.influanzae à une fréquence plus faible avec
M.pneumoniae, C.pneumoniae, les legionelles impliquées dans moins de 5
% des cas en dehors des épidémies.

IV.4-Les suppurations pleuro-pulmonaires :


L’abcès du poumon : associe un tableau de pneumopathie aigue
fébrile avec douleur thoracique et altération importante de l’état
géneral.L’expectoration purulente est rarement massive et abondante mais
plutôt fractionnée.

La pneumopathie aigue suppurée : correspond à


l’apparition de foyers de nécrose au sein d’un pneumonique étendu, pas ou
insuffisamment traité ou traité par une antibiothérapie inadéquate.

Les suppurations pleurales (pleurésies purulentes ou


empyème), ce sont des infections de la cavité pleurale, caractérisées par la
présence entre les 2 feuillets de la plèvre, d’un épanchement franchement
épais ou crémeux ou d’un liquide simplement louche, voir clair mais
renfermant toujours des polynucléaires plus ou moins altérés,
caractéristiques du pus.

Les agents étiologiques les plus retrouvés sont les anaérobies dans plus de
la moitié des cas. D’autres bactéries sont impliquées, notamment les
entérobactéries, staphylocoques, Haemophilus et pneumocoques.

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V-Les agents étiologiques :


V.1-Les virus :
Sont responsables dans 75 % des infections respiratoires parmi les agents :

 Myxovirus : responsable de formes épidémiques.


 Virus respiratoire syncitial : qui occupe la première place chez
l’enfant.
 Virus influanzae A et B.
 Virus parainfluanzae 1.2.3.4.
 Adénovirus : responsable des formes sporadiques.
 Herpetoviridae : responsable des pneumopathies extensives graves
chez l’immunodéprimé dont : CMV qui est l’agent le plus important
suivi de HSV et VZV.

V.2-Les bactéries :
3 catégories sont distinguées.

Les pathogènes spécifiques facultatifs du fait de leur présence à l’état de


portage dans les voies respiratoires :

 S.pneumoniae.
 M.catarrhalis.
 H.influanzae.
 S.aureus.
 Anaérobies.

Les pathogènes spécifiques :

 M.pneumoniae.
 Chlamydia pneumoniae.
 Chlamydia trachomatis (nouveau né)
 Chlamydia psittaci.

Les pathogènes opportunistes du fait de leur existence dans le milieu


extérieur :

L.pneumophila

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Mycobactéries atypiques, ces derniers sont exclus de l’étude.

La fréquence de ces germes : varie en fonction de l’âge.

En effet chez l’enfant les pneumopathies ont pour étiologie quatre


bactéries essentiellement :

 S.pneumoniae
 H.influanzae.
 M.catarrhalis.
 S.aureus.
 Les bactéries atypiques à l’exception de Chlamydia trachomatis sont
retrouvées après l’âge de 3 ans et se situent après les quatre bactéries
sus citées.

Chez l’adulte la répartition des bactéries est par ordre décroissant :

 S.pneumoniae
 H.influanzae
 M.pneumoniae
 Ch.pneumoniae
 L.pneumophila
 Et plus rarement S.aureus, les bacilles gram négatif ainsi que les
bactéries anaérobies, ces dernières surviennent sur un terrain
particulier.

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V.2.1-Streptococcus pneumoniae :
Diplocoque gram (+), lancéolé, cultivé sur milieu au sang, présente une
hémolyse alpha et est sensible à l’optochine.

La capsule est le support de 90 sérotypes dont les plus fréquents 23.14.6.9


et le 19 dans les pays occidentaux.

Dans les pays en développement y compris l’Algérie, les sérotypes les plus
fréquents dans la pneumonie sont 1.5.7.

L’évolution des pneumocoques à sensibilité diminuée à la pénicilline est


croissante, cependant les plus faibles taux sont notés dans les pneumonies :
en Algérie il était en 2001 de 20 % pour la pénicilline et aucune résistance
n’a été retrouvée pour l’Amoxicilline et le Cefotaxime.

Dans le cadre du réseau de surveillance de la résistance bactérienne aux


antibiotiques le taux global de pneumocoques de sensibilité diminuée à la
pénicilline tous sites confondus, était de 45 % en 2004.

Le support de cette resistance chromosomique par modification des PLP,


les niveaux de resistance sont variables selon la molécule antibiotique
(selon NCCLS 2002).

Sensible Intermédiaire Résistant


Pénicilline < ou = 0.063 0.1 – 1 mg/l > ou = 2 mg/l
Amoxicilline < oumg/l
= 2 mg/l 4 mg/l > ou = 8 mg/l
Cefotaxime < ou = 0.5 1 mg/l > ou = 2 mg/l
mg/l

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V.2.2-H.influanzae :
Bacille à gram (-), polymorphe, exigent en facteurs de croissance (hémine et
extrait de levure), cultive sur milieu au sang cuit.

La plupart des souches responsables de pneumopathies possèdent


l’antigène capsulaire type b.

Dans les pneumonies par aspiration de la flore nasopharyngée, c’est


l’Haemophilus non b qui est le plus impliqué.

Le taux de résistance dans le monde d’H influanzae est de 20-30 % pour


l’ampicilline par sécrétion de B lactamase d’origine plasmidique et dans
moins de 2 % par modification de PLP ou par l’imperméabilité de la
membrane externe.

En Algérie il existe peu de données sur les résistances aux antibiotiques de


cette bactérie isolée des infections broncho-pulmonaires.

Une étude réalisée au CHU Mustapha durant l’année 2004 retrouve 33 % de


résistance à l’ampicilline par sécrétion de bétalactamase.

Dans le cadre du réseau national de la surveillance de la résistance


bactérienne aux antibiotiques le taux global (tous sites confondus) de
résistance d’H.influanzae à l’Ampicilline était de 24.7 % en 2004.

V.2.3- M.catarrhalis :
Bacille à gram négatif non exigent, résistant à l’ampicilline dans 90 %, par
sécrétion de Bétalactamase d’origine plasmidique.

Cette bactérie fréquente dans les pays développés est rare dans les pays en
voie de développement.

Elle est peut être sous-estimée par l’absence de moyens d’identification


(galeries NH).

V.2.3- S.aureus :
Cocci gram positif non exigent, ayant un pigment jaune, sécréteur de
pénicillinase dans plus de 90 % des cas.

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Des pneumonies nécrosantes à S.aureus méthicillino-résistant d’origine


communautaire ont été décrites en Europe et aux états unis, bien que rares
elles sont cependant graves à cause des lésions pulmonaires de nécrose
dues à la sécrétion d’une toxine appelée leucocidine de Panton Valentine.

V.2.4- Les Chlamydiae :


Bactéries parasites intracellulaires à cycle complexe.

C.psittaci retrouvé essentiellement chez les oiseaux et les mammifères,


l’homme est infecté lors du contact avec ces animaux.

C.trachomatis a un rôle limité dans l’infection respiratoire chez le nouveau


né alors que C.pneumoniae est un pathogène presque exclusivement de
l’homme responsable de bronchites et pneumopathies atypiques.

V.2.5- Les mycoplasmes :


M.pneumoniae, bactérie dépourvue de paroi, exigeante en milieu nutritif et
ont besoin pour leur croissance de vitamines et de stérols et d’acides gras à
longue chaine.

Cette bactérie occasionne des pneumopathies atypiques.

V.2.6- Legionella pneumophila :


Bacille à gram (-) exigent en milieu nutritif (Cystéine, extrait de levure et
charbon) responsable de pneumopathies atypiques survenant par
inhalation d’air conditionné ou d’eau chaude contaminée par cette bactérie
qui est un commensal des eaux.

Elle cultive en milieu légèrement acide, PH 6.9, la culture sur milieu « Buffer
Charcoal Yeast Extract » (BCYE) nécessite une incubation à 35°C sous CO2,
les colonies apparaissent entre 3 et 7 jours, elles sont grises, muqueuses et
polymorphes et présentent un aspect en verre brisé.

Il existe 39 espèces de Legionella correspondant à 59 sérotypes


antigéniquement distincts.

Dans le monde Legionella pneumophila de Sérogroupe 1 à 9 est


responsable de 85 % des légionelloses, le sérotype 1 est le plus fréquent.

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D’autres espèces sont aussi impliquées : L.micdadei, L.bozemanii, L.dumoffi


et L.longbeachae.

V.2.7- Les bactéries anaérobies :


Elles sont responsables de 20 à 25 % des pneumonies communautaires et
dans 80 % ds pneumonies par inhalation en milieu hospitalier.

Les bactéries les plus fréquemment isolées sont : les Cocci à gram (+) :
peptostreptococcus, les bacilles à gram (+) : Actinomyces et les bactéries à
gram (-) : Prevotella, Fusobacterium.

Ces bactéries sont souvent associées aux bactéries aérobies et aéro-


anaérobies facultatives.

V.2.8- Bordetella
C’est un petit coccobacille Gram négatif, à coloration bipolaire qui présente
une capsule.

Cette bactérie cultive en aérobiose sur milieu de Bordet et Gengou après 48


h les colonies apparaissent sous forme de gouttelettes de mercure.

Il existe 4 espèces :

Bordetella pertussis : agent de la coqueluche qui est une maladie


émergente, caractérisée par une toux coqueluchoide pouvant se compliquer
d’une broncho-pneumopathie.

D’autres espèces sont décrites notamment : B.parapertussis,


B.bronchoseptica et B.avium.

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VI-Le diagnostic bactériologique :


VI.1- Les prélèvements :
Plusieurs types de prélèvements peuvent être réalisés, leurs indications
dépendent de l’état du patient et du germe suspecté.

Tous ces prélèvements une fois réalisés doivent être acheminés dans
l’heure qui suit au laboratoire.

VI.1.1-L’expectoration :
Du fait de la contamination par la flore buccale, son rendement est amélioré
par une toilette buccodentaire, une émission après un effort de toux ou
après une séance de kinésithérapie sans traitement au préalable, ou après
une fenêtre thérapeutique de 48 h.

Le produit est recueilli dans un dispositif stérile et acheminé au laboratoire


dans l’heure qui suit. Il est indiqué devant une bronchite, pneumonie ou
pneumopathie communautaire bénigne.

VI.1.2-Méthodes invasives :
Protégé ou non, les aspirations bronchiques, le lavage broncho-alvéolaire et
le brossage bronchique sont plus fiables et impliquent un environnement
médicalisé.

Ils sont indiqués dans les infections graves ou récidivantes ainsi que dans
les pneumopathies nosocomiales sous ventilation artificielle.

VI.1.2.1-Le brossage bronchique protégé :


La technique de référence est le brossage télescopique sous fibroscopie
selon la technique décrite par Wimberley, par utilisation d’un dispositif
constitué d’une brosse de nylon fixée à l’extrémité d’un guide métallique.

Brosse et guide coulissent à l’intérieur d’un premier cathéter, lui même


placé à l’intérieur d’un second cathéter, obturé par un bouchon de
polyéthylène glycol.

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Cette brosse est glissée au travers d’un fibroscope et dirigée sous contrôle
de la vue dans une petite bronche de 4ème ordre drainant le territoire
pulmonaire radiologiquement suspect.

Le cathéter interne est poussé, expulsant le bouchon et permettant


d’avancer la brosse de quelques centimètres, pour réaliser le prélèvement
des secrétions.

Apres cela e dispositif est retiré, la partie externe du cathéter interne est
désinfectée à l’alcool 70°, puis une fois sortie la brosse interne est coupée
dans un tube stérile contenant 1 ml de soluté stérile isotonique afin d’éviter
sa déshydratation.

Ce tube est agité pendant 2 minutes.

On estime que la brosse ramène 0.01 ml de secrétions bronchiques. Le


prélèvement doit être traité dans l’heure qui suit.

VI.1.2.2--Le cathétérisme en double aveugle ou


prélèvement distal protégé (PDP) :
Cette méthode est utilisée chez les sujets sous ventilation mécanique ainsi
que chez les trachéotomisés, elle ne nécessite pas le recours au fibroscope.

Un double cathéter lié à une seringue est introduit par l’oropharynx ou par
l’orifice de trachéotomie et dirigé à l’aveugle vers les bronches, les
secretions bronchiques sont alors aspirées.

Les 3 à 5 cm distaux du double cathéter protégé, après avoir été purgé avec
1 ml de soluté salé isotonique sont coupés stérilement et placés dans un
tube stérile.

Le prélèvement reçu au laboratoire contient la suspension (liquide de purge


et sécrétion) et le cathéter.

Toutefois le cathéter est le plus souvent adressé au laboratoire sans


liquide, ce dernier sera rajouté au laboratoire.

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

VI.1.2.3- Le lavage broncho-alvéolaire :


Apres introduction du bronchoscope et son blocage dans une bronche
segmentaire ou sous segmentaire, 50 ml de sérum physiologique sont
instillés en 5 à 6 fois puis aspirés pour recueillir les secretions.

Le produit est recueilli dans un dispositif stérile, on estime que 20 à 60 %


du liquide injecté est recueilli.

Le lavage broncho-alvéolaire est surtout indiqué pour la recherche des


chlamydiae et pour le diagnostic des pneumopathies nosocomiales chez les
malades ventilés.ces prélèvements sont positifs dans 60 à 70 % des cas.

Ces prélèvements sont acheminé dans l’heure qui suit pour éviter la
pullulation des germes de la flore commensale, le clinicien doit noter si la
fibroscopie est protégée ou non pour faciliter l’interprétation
bactériologique quantitative.

VI.1.2.4-Aspiration endotrachéale :
Une sonde d’intubation est introduite au niveau de la trachée, les secrétions
sont ensuite aspirées à l’aide d’une seringue reliée à la sonde.

Cette méthode expose à a contamination par la flore bucco-salivaire, elle est


utilisée lorsque les autres techniques invasives ne peuvent être utilisées.

VI.1.3-Autres prélèvements :
VI.1.3.1-la ponction transtrachéale :
D’indication limitée bien que ces prélèvements soient de grande qualité
microbiologique, cependant des complications peuvent survenir telles que :
hémorragie et surinfections.

Le prélèvement se fait à l’aide d’une aiguille placée de façon à former 45°


par rapport à la surface cervicale désinfectée chez un sujet allongé, le cou
dégagé en mettant un support sous les épaules.

Un cathéter lié à une seringue est introduit à travers l’aiguille et les


secrétions ainsi aspirées.

22
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Cette méthode est impossible en cas de ventilation assistée, elle est


indiquée dans les pneumopathies nosocomiales chez les chez les
immunodéprimés, elle est toute fois remplacée par les prélèvements sous
fibroscopie, moins traumatiques.

VI.1.3.2-La ponction trans-trachéale à l’aiguille fine :


Cette méthode est actuellement d’utilisation exceptionnelle dans les
pneumopathies nosocomiales à cause des risques d’hémorragie et de
pneumothorax.

Elle consiste à introduire une aiguille à travers le thorax en passant par la


plèvre et aspirer le tissu pulmonaire.

Une radiographie est nécessaire auparavant afin de localiser la partie


infectée à prélever. Cette méthode est contre indiquée chez les insuffisants
respiratoires.

VI.1.3.3-Ponction pleurale :
La réaction pleurale n’est présente que dans 20 % lors des pneumopathies à
pneumocoque et dans 80 % dans les pneumopathies à staphylocoques. Elle
est d’une grande valeur diagnostique.

L’empyème peut être isolé ou associé à une suppuration pulmonaire.

Le prélèvement est recueilli par ponction à l’aiguille après une désinfection


de la région costale à l’aide d’une solution antiseptique.

L’acheminement du prélèvement doit être effectué dans l’heure qui suit.

VI.1.3.4-L’aspiration nasopharyngée :
Elle est indiquée pour le diagnostic de la coqueluche et réalisée par
l’intermédiaire d’une sonde nasopharyngée liée à une seringue.

Cette technique est aussi utilisée pour le diagnostic de la pneumonie


néonatale a Chlamydia trachomatis.

23
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

VI.1.3.5-Ecouvillonnage de l’oropharynx postérieur :


Est réalisé en frottant l’écouvillon au niveau de l’oropharynx postérieur
pour la recherche directe de C.psittaci et C.pneumoniae.

VI.1.3.6-L’hémoculture :
Elle est indiquée devant une fièvre ≥ 39°C accompagnant une pneumonie.

Le prélèvement est effectué aux pics thermiques après désinfection de la


surface à prélever et des mains du préleveur et en dehors de toute
antibiothérapie.

Une série d’au moins 03 flacons est prélevée dans des sites différents.

Le type de flacons est de préférence le milieu biphasique (Castanéda) ou 5 à


10 cc de sang sont inoculés par flacon.

Ces derniers sont acheminés immédiatement à température ambiante.

Le rendement de ces hémocultures est faible puisque seules 20 à 30 % des


pneumonies sont bactériémiques.

VI.1.3.7-Le sérum :
Prélevé à J1 après un intervalle de 2 à 3 semaines.

Cette sérologie est valable pour la recherche d’anticorps anti-chlamydiae,


anti-mycoplasme et anti-legionelles.

Les 2 sérums seront congelés avant d’être traités en même temps.

24
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

VI.2-L’examen direct :
VI.2.1-Examen après coloration :
Deux colorations sont nécessaires pour les prélèvements de crachats,
aspirations bronchiques, lavages broncho-alvéolaire, ponction trans-
trachéales et liquides pleuraux :

 Une coloration au bleu de méthylène ou au May Grunwald Giemsa


(MGG) permet d’apprécier la réaction cellulaire notamment la
présence de polynucléaires et de cellules épithéliales.
 Une coloration de gram pour apprécier la flore et sa prédominance.

Ces deux examens sont d’un intérêt capital, ils permettent lors d’un
prélèvement d’une expectoration de juger de sa qualité.

Ainsi devant la prédominance de cellules épithéliales, peu de polynucléaires


t une flore polymorphe le prélèvement est salivaire et n’a pas d’intérêt
bactériologique.

Par contre devant la prédominance de polynucléaires et une flore


prédominante, le prélèvement est alors mis en culture.

VI.2.2-Lecture et interprétation :
Pour l’expectoration, la coloration au bleu de méthylène ou MGG est
observée à l’objectif X100.pour que le prélèvement soit accepté pour la
mise en culture il faudrait que le nombre de cellules épithéliales soit <10
cellules / champ et que le nombre de polynucléaires soit > 25/ champ.

Le dénombrement est estimé en faisant la moyenne sur 10 champs.

Cellules par champ


Classe Epithéliales Leucocytes
1 > 25 <10
2 > 25 10-25
3 > 25 > 25
4 10-25 > 25
5 <10 > 25

25
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Les crachats de classe 1 et 2 sont fortement contaminés par la salive et ne


sont pas mis en culture.

Les crachats de class 3 et 4 ont un nombre de leucocytes qui témoigne


d’une réaction inflammatoire mais sont contaminés par la salive.

Les crachats de classe 5 sont les plus appropriés pour l’examen


bactériologique ; ceux de la classe 4 sont acceptables.

L’examen direct d’une aspiration broncho-pulmonaire après fibroscopie


montre des cellules bronchiques, macrophages et des polynucléaires.

Il est noté qu’en phase d’invasion de l’infection, les polynucléaires peuvent


manquer, c’est la culture qui confirmera le diagnostic.

Interprétation de l’examen direct :

 Absent : 0 bactérie et leucocyte.


 Rares : 1 bactérie ou 1 leucocyte pour 10 à 20 champs.
 Assez nombreux : 1 à 5 bactéries ou leucocytes par champs.
 Nombreux : 10 à 50 bactéries ou leucocytes par champs.
 Très nombreux : 150 à 200 bactéries ou leucocytes/champs.

Cet examen direct est aussi capital lors des ponctions pleurales et des
hémocultures.

26
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

VI.3-Culture
VI.3.1-Prélèvements broncho-pulmonaires :
Tous les prélèvements seront mis en culture après dilution pour une étude
quantitative à l’exception de la ponction trans-trachéale et la biopsie
pulmonaire qui seront directement ensemencées sur les milieux :

VI.3.1.1- Expectoration, aspiration trachéale,


aspiration bronchique non protégée :
Le produit pathologique est dilué volume à volume avec le digesteur
(Eurobio) afin de fluidifier les sécrétions.

Une agitation au vortex ou à l’agitateur pendant 20 mn est nécessaire,


certains auteurs préconisent de rajouter des billes de verre pour faciliter la
liquéfaction des secrétions.

Prélever 10 ul avec pipete et embout jaune stérile et les décharger dans 10


ml d’eau distillée stérile.

Mélanger à nouveau au vortex.

Prélever 10 ul et étaler au râteau stérile sur les milieux :

 Gélose au sang frais pour pneumocoques et autres streptocoques


incubés sous CO2.
 Gélose au sang cuit + polyvitex pour Haemophilus et Neisseria
incubée sous CO2.
 Gélose Columbia au sang frais pour les Anaérobies incubée en
anaérobiose.
 Gélose Sabauraud additionnée de Chloramphénicol.
 En cas d’aspiration bronchique rajouter un milieu pour recherche des
légionellas (BCYE).

La dilution finale ensemencée est estimée à 10 Bactéries/ml.

Lecture :

Dénombrer le nombre de colonies identiques d’une même espèce


bactérienne X 10 Bactérie/ml .

27
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Le seuil de positivité est ≥10 bactéries/ml pour l’expectoration.

Il est de 10 pour l’aspiration bronchique protégée.

NB : le prélèvement de crachat peut être ensemencé directement sans


dilution au préalable à l’aide d’une anse de 10 ul.

L’isolement se fera en cadrans, la flore prédominante ayant cultivé jusqu’au


3ème voir 4ème cadran sera prise en considération.

VI.3.1.2-Interprétation de la culture quantitative d’une


expectoration :
Cette interprétation est délicate, elle doit en même temps être confrontée à
la clinique et aux résultats de l’examen direct et de la culture.

1er cas : au gram

 Peu ou pas de polynucléaires.


 Nombreuses cellules épithéliales.
 Flore polymorphe.

Prélèvement salivaire sans intérêt bactériologique pas de culture.

2ème cas : au Gram

 Peu ou pas de polynucléaires.


 Peu ou pas de cellules épithéliales.
 Une forme bactérienne nettement prédominante ou exclusive.

A la culture : une espèce bactérienne exclusive ou nettement prédominante


présente en quantité significative : identification+antibiogramme et
compléter les renseignements cliniques (prélèvement fait en période
invasive de la maladie, la réaction inflammatoire n’a pas eu le temps de se
faire).

28
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

3ème cas : au gram

Nombreux polynucléaires.

Flore polymorphe.

Culture non significative : renseignements cliniques : malade sous


antibiothérapie.

29
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Recueil de crachat

Examen direct :

Bleu, Gram

= Appréciation de la qualité du prélèvement (cellules


épithéliales, polynucléaires)

Classe 1. 2. 3 Classe 4, 5

Contamination salivaire Fluidification ou ensemencement à


l’anse par la technique des quadrants

Demander un autre prélèvement


Mise en culture

 GSF
 GSC + Polyvitex
 Gélose pour BGN

Lecture

Seuil de pathogénicité= 10 Bactéries/ml

Flore dominante par culture pure

Identification et antibiogramme

30
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

VI.3.1.3- Prélèvement distal protégé : (PDP)


Est réalisé en réanimation par cathétérisme en double aveugle, le cathéter
est reçu dans un tube stérile.

 Ajouter 1 ml de soluté salé isotonique dans un tube, agiter au vortex


pour homogénéiser les secrétions.
 Ensemencer 10 ul de la suspension sur les milieux sus cités et étaler
au râteau.
 Apres incubation dénombrer les colonies.
 Le seuil de positivité est ≥10 UFC/ml soit 10 colonies sur une boite
d’une même espèce bactérienne.

VI.3.1.4- Lavage broncho-alvéolaire protégé :


 Centrifuger le prélèvement pendant 5 mn à 2000 tr/mn.
 Jeter le surnageant.
 Faire un gram sur le culot.
 Ajouter 1 ml d’eau distillée stérile.
 Homogénéiser au vortex.
 Ensemencer 10 ul et étaler au râteau stérile sur les mêmes milieux
cités précédemment.
 Lecture
 Nombre de colonies X 100.
 Le seuil de pathogénicité est ≥10 UFC/ml soit 10 colonies d’une
même espèce bactérienne.

VI.3.1.5-Brossage broncho-alvéolaire :
 Prélever à l’aide d’un écouvillon stérile une petite quantité des
secrétions pour le gram.
 Décharger la brosse dans 0.5 ml d’eau distillée stérile.
 Homogénéiser au vortex.
 Inoculer 10 ul de cette suspension et faire un étalement au râteau
stérile sur les mêmes milieux cités précédemment.
 Lecture : nombre de colonies X 100.
 Le seuil de positivité est ≥10 UFC/ml soit 10 colonies sur une
boite d’une même espèce bactérienne.

31
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

VI.3.1.6-Ponction trans-trachéale, biopsie pulmonaire :


Ces deux types de prélèvements seront ensemencés tels quels sans dilution
au préalable.

La culture est ensemencée sur les mêmes milieux sus cités, toute bactérie
qui pousse sera prise en considération.

VI.3.2-Ponction pleurale :
Mise en culture sur les mêmes milieux, un enrichissement en bouillon est
effectué pour les bactéries aérobies (Todd Hewitt ou BGT) et pour les
bactéries anaérobies (TGY).

VI.3.3-l’hémoculture :
Mise en culture dés 6 h d’incubation avec des repiquages systématiques à
18h, 72h et observation des flacons pendant 10 jours.

L’interprétation sera guidée par l’espèce bactérienne pathogène stricte ou


opportuniste, dans ce dernier cas le nombre de flacons positifs ainsi que le
contexte clinique (présence d’une pathologie sous jacente) guideront le
diagnostic.

32
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

VI.4-Identification bactérienne :
VI.4.1- Streptococcus pneumoniae :
Examen direct :

le pneumocoque est caractérisé par son aspect en diplocoque lancéolé en


flamme de bougie, parfois en courtes chainettes à gram positif.

La taille des Coccis est souvent plus importante à partir d’un prélèvement
qu’à partir de la culture.

Culture :

sous atmosphère enrichie en CO2 et après 24 h d’incubation sur gélose au


sang frais les colonies apparaissent grisâtres plates avec un centre
ombiliqué entourées d’une hémolyse alpha, parfois les colonies sont
grosses et muqueuses.

Sur milieu gélosé le pneumocoque doit être repiqué au bout de 48 h au delà


de ce délai il s’autolyse après.

La culture sur bouillon donne un aspect trouble homogène en 6 heures,


dépassé ce délai la bactérie s’autolyse et n’est plus viable.

33
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Identification :

Test à l’Optochine :

isoler une culture pure de pneumocoque sur gélose au sang frais, déposer
au niveau du premier cadran un disque d’optochine (ethylcupréine),
incuber sous CO2 pendant 24h, une zone d’inhibition > 15 mm permet
d’identifier le pneumocoque si le diamètre de cette zone est < ou = 15 mm ,il
est nécessaire de compléter l’identification par le test de lyse au
désoxycolate de sodium car il existe des streptocoques alpha hémolytiques
qui peuvent avoir un diamètre d’inhibition à l’optochine.

Test de lyse :

Sur milieu liquide :

Préparer 2 tubes de Kahn stériles.

Distribuer dans chaque tube 0.5 ml d’une suspension bactérienne (de


pneumocoque) de densité optique entre 0.5 et 1 mac Farland.

Une quantité égale (0.5 ml) d’une solution de désoxycolate de Na à 1 ou 2 %


(la bile) est ajoutée dans un tube alors que 0.5 ml d’eau physiologique est
rajoutée dans le deuxième tube. Incuber 2 heures à 35°C.

Une réaction positive indiquant la présence d’un pneumocoque, se


manifeste par un éclaircissement du tube contenant le désoxycolate de Na
alors que l’autre tube reste trouble.

Sur milieu solide

Déposer une goutte de désoxycolate de Na à 1 ou 2 % sur des colonies bien


isolées.

La boite est ainsi posée sur une surface plate, couvercle vers le haut,
pendant 15 mn soit à température ambiante, u incubée à 35°C en aérobiose.

Une réaction positive se manifeste par une disparition des colonies ou leur
aplatissement alors qu’une réaction négative laisse les colonies intactes.

Il faudrait éviter les excès de solution qui favorisent le glissement des


colonies ce qui pourrait être interprété comme positif par erreur.

34
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Sérotypage :

« Quellung réaction » ou gonflement de la capsule :

Le principe de ce tes est de mettre le pneumocoque en présence d’un pool


de sérums puis d’un sérum spécifique du sérotype ou Sérogroupe.

Une réaction positive se manifeste par un gonflement de la capsule visible


au microscope au contraste de phase.

Cultiver une souche de pneumocoque en bouillon (BGT) pendant 2 à 4 h.

Mettre sur une lame 10 ul de sérum, 10 ul de bouillon et 10 ul de bleu de


méthylène dilué au 1/10 : bien homogénéiser, recouvrir d’une lamelle et
laisser environ 15 à 20 mn.

Déposer sur la même lame un témoin négatif contenant 10 ul de bouillon et


10 ul de bleu de méthylène.

Observer au microscope à contraste de phase condensateur en position H


ou 5 et au grossissement 40.

Comparer toujours avec le témoin négatif ou on n’observe pas de


gonflement : la taille des bactéries est inchangée et la capsule invisible.

Une réaction positive se manifeste par une capsule bien visible autour du
corps bactérien lequel est coloré en bleu.

Procéder d’abord avec les pools de sérums, si la réaction est positive on


utilisera alors le monovalent correspondant.

35
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Agglutination au latex :

 Cette technique utilise des latex sensibilisés par des sérums. Il existe
des pools et des monovalents.
 Le même principe est utilisé que pour le gonflement de la capsule en
passant par les pools puis les monovalents correspondants.
 L’agglutination doit être immédiate.

36
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

VI.4.2-Haemophilus
Examen direct :

Coccobacille à gram négatif polymorphe, ce polymorphisme est


caractéristique surtout à partir du prélèvement.

Culture :

A partir de colonies suspectes brillantes parfois grisâtres et ne cultivant que


sur gélose au sang cuit, un gram et un réisolement sont effectués.

Effectuer les tests rapides de catalase et oxydase qui sont positifs, cette
dernière est tardive.

37
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Identification :

L’identification se fera soit par l’ensemencement d’une galerie Api Neisseria


Haemophilus NH soit par la recherche des exigences en facteurs de
croissance.

Réalisé à partir d’une culture fraiche une suspension riche dans l’eau
physiologique, déposer 3 spots larges dans une boite Mueller Hinton
simple, sur chaque spot déposer un disque contenant les facteurs de
croissance, facteur X, Facteur V et Facteurs V et X.

Incuber à 35°C pendant 24 H sous CO2 et l’humidité.

La lecture se fera en notant la présence ou l’absence de culture autour des


disques.

Ainsi H.influanzae ne cultive qu’autour du disque contenant les 2 facteurs V


et X.

Recherche du sérotype par agglutination au latex :

Il existe 9 sérotypes de a à f, le plus fréquent étant le b.

Le Sérotypage se fait à partir d’une culture de 24 h , prendre quelques


colonies et les mettre en contact d’une goutte de sérum spécifique, une
réaction positive se manifeste par une agglutination franche dans la minute
qui suit.

VI.4.3.M.catarrhalis :
 Les colonies sont grisâtres non pigmentées grosses sur gélose au sang
frais et cuit.
 La recherche de la catalase et l’oxydase est positive.
 L’identification sera confirmée par galerie Api NH

38
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

VI.5-Recherche de Chlamydiae, Mycoplasmes


et Légionelles :
VI.5-1-Les Chlamydiae
VI.5.1.1-Prélèvements :
Aspiration bronchiques ou lavages broncho alvéolaires ou alors
écouvillonnage oropharyngé seront réalisés.

Si une culture doit être effectuée le prélèvement est mis dans un milieu de
transport 2SP : tampon phosphate de potassium ou phosphate de sodium
0.02 M additionné de saccharose 0.2 M.

En attendant l’inoculation, le prélèvement peut être conservé à +4°C dans


un délai < 48 h, au delà duquel il doit être congelé à -80°C.

VI.5.1.2-Examen direct :
Le frottis est réalisé sur lame à partir du prélèvement et fixé à l’acétone, un
anticorps monoclonal marqué est rajouté, ainsi qu’un contre colorant, le
bleu d’Evans.

La sensibilité de cette technique est de 50 %.

VI.5.1.3-Isolement :
 Nécessité des cultures cellulaires telles que HeLa 229, HL, Hep2.
 Les inclusions cytoplasmiques sont mises en évidence après 72 h de
culture grâce à un anticorps monoclonal spécifique de l’espèce et du
genre.
 L’isolement des Chlamydiae par la culture reste difficile et peu
rentable ; la mise en culture est la méthode de référence.
 Ces prélèvements sont agités dans 1.2 ml de milieu de transport
liquide, 2SP : Phosphate de Potassium ou Phosphate de Sodium 0.02
M additionné de saccharose 0.2M.
 Si la culture ne peu être effectuée immédiatement, le flacon est
congelé à – 70°C pendant une durée maximum de 20 j.

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

 Si la culture a lieu dans les 2 heures qui suivent le prélèvement, le


flacon est conservé à +4°C.

Mode opératoire :
Entretien des cellules McCoy :

 Utilisation de flacons plastique Costar de 75 cm2.


 Les cellules sont maintenues à 37°C sous CO2 dans le milieu EAGLE.
 Lorsqu’un tapis cellulaire est constitué les cellules doivent être
trypsinées.
 La trypsinisation consiste à rejeter le milieu nutritif, laver les cellules
au milieu de Hanks avant d’ajouter 10 ml de Trypsine pendant une
minute.
 La trypsine est ensuite jetée puis on rajoute quelques ml de EAGLE
dans le flacon pour inactiver la trypsine.
 Les cellules sont mises en suspension par une agitation modérée et
peuvent être transférées dans un autre flacon.

Préparation des plaques pour l’isolement des Chlamydia :

 Mise en suspension des cellules dans le milieu de EAGLE après


trypsination.
 Dénombrement de ces cellules sur Malassez après avoir rajouté le
bleu de Trypan pour différencier les cellules mortes des vivantes.
 La concentration cellulaire est ensuite ajustée à 10 cellules par ml.
 Déposer 1 ml de cette solution dans chaque puis d’une plaque type
Costar de 24 puits contenant chacun une lamelle ronde en verre de 12
mm de diamètre.
 Incuber la plaque pendant 24 h à 37°C sous CO2, le temps d’avoir une
monocouche cellulaire sur les lamelles.

Inoculation des prélèvements :

 Les prélèvements congelés à -70°C seront décongelés comme suit :


 Rajouter 1 ml de milieu Eagle dans chaque flacon ainsi que quelques
billes de verres stériles.
 Agiter vigoureusement au vortex pendant 1 minute.
 Rejeter le milieu de culture contenu dans chaque plaque.

40
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

 Repartir chaque suspension infectieuse dans 4 puits à raison de 0.5


ml par puits.
 Centrifuger la plaque pendant une heure à 30° et à 1500 g.
 Incuber la plaque 2 heures à 37°C, sous 5 % de CO2.
 Aspirer l’inoculum et rajouter le milieu Eagle enrichi à raison de 0.5
ml par puits.
 Incuber à 37°C sous 5 % de CO2 pendant 48 heures.

Coloration :

C’est l’étape de révélation de la présence de Chlamydia dans les cellules


inoculés.

Au May-Grunwald-Giemsa (MGG):

 Prélever une lamelle par prélèvement.


 Laver dans une solution de PBS (phosphate Buffer Saline).
 La fixer pendant 10 mn à l’alcool méthylique.
 Colorer les cellules pendant 20 mn avec le mélange (MGG 1 ml,
Giemsa 2 ml, tampon Giemsa 17 ml).
 Rincer à l’eau distillée.
 Déshydrater la lamelle dans des bains successifs d’acétone, acétone
toluène et Toluène.
 Lecture au microscope à l’objectif X 40 ou X 100 à l’immersion.

En immunofluorescence directe :

 Technique plus sensible surtout lorsque le nombre d’inclusions est


peu élevé.
 Les lames sont recouvertes d’anticorps monoclonal anti-chlamydia
marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine.
 Lecture au X40 ou au X100 : les inclusions apparaissent en vert sur
fond rouge.

41
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Passage sur une nouvelle culture cellulaire :

Si le résultat est douteux après 48 h on réalise un second cycle.

 Recueillir les cellules restantes du prélèvement douteux.


 Jeter la moitié du milieu Eagle.
 Gratter les cellules des lames restantes avec une spatule métallique
stérile.
 Récupérer l’inoculum et l’agiter au vortex avec des billes.
 Traiter les cellules comme le prélèvement de départ et le contrôle
positif : il est possible d’introduire un contrôle positif dans chaque
série qui sera une souche de chlamydia de référence ou isolée d’un
malade.

Résultat :

 Apres lecture complète de la lame, la vue d’une seule inclusion signe


la positivité de la lame.
 Il est aussi important de vérifier l’emplacement de la lamelle positive
sur la plaque car des contaminations d’une série par une autre
fortement positive peuvent survenir.

Précautions à prendre :

 Prélèvement recueillis dans le milieu de transport 2SP.


 Vérifier la bonne qualité des transports plastiques pour la croissance
cellulaire.
 Vérifier la concentration de 5 % de CO2, une concentration
supérieure acidifierait trop les milieux et entrainerait une sensibilité
inférieure des cellules.
 Verifier l’humidification de l’étuve à CO2 pour qu’il n’y ait pas de
dessiccation des plaques.

42
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

VI.5.1.4-Diagnostic indirect : deux sérums prélevés à 3 semaines.


 Réaction de fixation du complément : elle est surtout indiquée pour
chlamydia psittaci mais elle est non utilisée pour chlamydia
pneumoniae car peu sensible.
 Micro-immunofluorescence indirecte avec un antigène d’espèce et du
genre, c’est une technique spécifique et sensible.
 Un taux ≥1/512 est évocateur d’une infection active.
 En primo infection les IgM ≥1/16 apparaissent rapidement, les IgG
apparaissent vers la 5ème semaine.
 En réinfection les IgG apparaissent rapidement, il n’ya pas d’IgM.
 Chez l’enfant il a été prouvé que les cultures positives n’étaient pas
toujours corrélées à une sérologie positive à chlamydia pneumoniae.

A-Immunofluorescence indirecte : c’est la technique de


référence :

Principe :

 Détecte les anticorps anti-Chlamydia trachomatis, pneumoniae et


psittaci de classe IgM et IgG.
 L’antigène de chlamydiae est soit entretenu au laboratoire sur culture
cellulaire ou sur œuf soit fixé sur des lames prêtes à l’emploi sous
forme de spot.
 Lorsque l’antigène est préparé sur œuf, la positivité d’une lame donne
un aspect de ciel étoilé, alors qu’il est sous forme d’inclusions, si
l’antigène est préparé par culture cellulaire.

Mode opératoire :

 Décanter le sérum du malade et le décomplémenter 30 mn à 56°, il


peut être conservé 2 jours à +4° ou congelé à -20°C.
 Diluer en demi en demi le sérum dans du PBS.
 Déposer à partir de la dilution 1/128 sur chaque spot d’une lame
séche.
 Incuber à 37°C pendant 30 mn en chambre humide.
 Laver deux fois 5 mn au PBS.

43
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

 Déposer, sans sécher, une globuline de chèvre anti-immunoglobuline


humaine Totale marquée à l’isothiocyanate de fluorescéine (dilution
au 1/100 dans du PBS + bleu d’Evans au 1/10000).
 Incuber les lames 30 mn à 37 °C en chambre humide.
 Laver 2 fois 5 mn au PBS.
 Lecture au microscope à fluorescence.

Lecture et interprétation :

Les résultats sérologiques doivent être confrontés à la clinique :

 Pour Chlamydia psittaci un titre d’IgG > 64 est considéré comme


positif.
 Pour les pneumopathies de l’enfant la recherche des IgM est
intéressante, la présence d’IgM à un taux ≥ 1/8 ou plus est considérée
comme positive et doit être confirmée par une 2ème sérologie.
 Chez le nouveau né en l’absence d’IgM, une réponse d’IgG 4 X
supérieure à celle de la mère démontre l’infection (Ch. Trachomatis).
 I est donc important d’avoir le sérum de la mère et du nouveau né en
même temps.
 Pour Ch. Pneumoniae, u titre en IgM ≥ 32, un taux d’IgG ≥ 512 sont en
faveur d’une infection récente .par contre u taux d’IgG≥ 32 sans
augmentation significative est témoin d’une infection ancienne. D’où
l’intérêt de suivre la cinétique des anticorps dans le temps.

Précaution :

 Risque de réaction faussement positive par un bruit de fond


fluorescent.
 Tester les conjugués et surtout l’IgM sur des sérums de référence ou
des sérums connus.
 Réaction faussement positives en IgM dues au facteur rhumatoïde ou
à des anticorps anti noyaux.
 Pour éviter la chute des anticorps suite aux congélations et
décongélation, il est préférable de conserver les sérums à +4°C
pendant de courtes périodes.

44
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

B-Autres techniques sérologiques :

Réaction d’immunopéroxydase : ne concerne que Ch. Trachomatis de


plus il peut y avoir des réactions croisées avec Ch. Psittaci et acinétobacter.

Réaction immunoenzymatique (ELISA) : ne détecte que les IgG de plus


les antigènes utilisés manquent de spécificité.

Amplification génique : la technique PCR est sensible et spécifique pour


Ch. Pneumoniae mais n’est pas encore généralisée.

45
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

VI.5.2-Mycoplasma pneumoniae
VI.5.2.1-Prélèvements :
 Les prélèvements les plus indiqués pour la mise en culture de
C.pneumoniae sont :
 Prélèvement naso-pharyngé ou expectoration : le 1 er cas (par
écouvillonnage) est préférable au second qui expose à la
contamination des milieux.
 Liquides d’aspirations bronchiques et lavages broncho-alvéolaires.
 Brossages endoscopiques.
 Liquides pleuraux et biopsies pulmonaires.

Les conditions nécessaire à tous ces prélèvements est qu’ils devraient


contenir des cellules compte tenu de l’adhérence des mycoplasmes aux
cellules.

L’acheminement au laboratoire est immédiat, s’il est différé le prélèvement


peut être conservé à +4°C pour une durée ne dépassant pas 24 h ou
quelques jours à -20°.

Un prélèvement de sang est nécessaire pour l’étude sérologique.

VI.5.2.2-Examen direct : Non pratiqué vu l’absence de paroi, les


technique d’IF n’ont pas donné de résultats concluants.

VI.5.2.3-La culture :
 La culture des mycoplasmes nécessite des milieux riches en éléments
nutritifs (sérums, extrait de levure, ADN).
 Il existe 2 milieux, le milieu d Hayflick liquide ou solide et le milieu
SP4 liquide ou biphasique : les résultats du milieu SP4 sont les
meilleurs.
 Ces milieux contiennent des inhibiteurs pour éliminer les bactéries de
contamination (Bétalactamines, polymyxines et Amphotericine B).
 Les prélèvements effectues sur des écouvillons sont étalés sur milieu
solide et déchargés sur milieu liquide.

46
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

 Les prélèvements liquidiens sont ensemencés directement sur milieu


solide et dilués au 1/10e avant d’être ensemencés par quelques
gouttes sur milieu liquide.
 L’incubation se fait à 37°C sous 5 % de CO2.l’observation des milieux
est quotidienne pendant 3 semaines, toute contamination doit faire
éliminer les cultures.
 Sur milieu gélosé, le développement de M.pneumoniae se traduit par
l’apparition après 5 à 7 jours de colonies de très petite taille visibles à
la loupe ou au microscope X10 et ayant un aspect « œuf sur plat ».
 La croissance en milieu liquide est visualisée par un virage du PH du
rouge au jaune ce qui témoigne de l’utilisation du glucose.

Culture de M.hominis.
Un gros plan montre les colonies en
« oeuf au plat »,

VI.5.2.4-Identification
En principe l’utilisation du glucose ainsi qu’une culture positive sur milieu
solide suffisent à l’identification de M.pneumoniae, toutefois l’identification
peut être confirmée par l’inhibition de a culture en présence d’un anticorps
spécifique ou par IFD sur culture, cette technique est de réalisation difficile.

47
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

VI.5.2.5-Avantages et inconvénients :
La culture st longue et fastidieuse, lorsqu’elle est positive elle confirme le
diagnostic alors que sa négativité n’exclut pas l’infection à M.pneumoniae.

Culture

 Elle n’est pas effectuée en routine car longue et peu sensible.


 Les milieux utilisés contiennent du cholestérol et de l’ADN et de
l’extrait de levure soit en milieu liquide SP4 ou gélosé Hayflick.
 En milieu liquide c’est le virage du PH qui témoigne d’une culture
alors qu’en milieu solde les colonies apparaissent en 5 à 7 jours avec
un aspect d’œuf sur le plat.

Techniques directes :

 Technique immunoenzymatique fondée sur la propriété d’adhésion


de la protéine P1 bactérienne et utilisant des anticorps anti protéine
P1 marquées à la peroxydase.
 L’amplification génique par PCR est sensible mais n’apporte pas un
diagnostic de certitude compte tenu de la présence de mycoplasme à
l’état de portage.

VI.5.2.6-Sérologie :
La technique de fixation du complément permet de poser un diagnostic
certain lorsque le taux d’anticorps augmente 4 fois entre deux sérums
prélevés à 15 j d’intervalle.

Les techniques immunoenzymatique permettent de détecter les IgM en 7 à


10 jours.

L’agglutination au latex :

2 sérums sont nécessaires le premier au début de la maladie et l’autre 2 à 4


semaines plus tard.

A-Recherche des agglutinines froides :


Leur présence s’explique par la production par le sujet infecté d’auto-
anticorps (IgM) dirigés contre ses propres hématies dont les antigènes de
surface sont altérés par les peroxydes libérés par M.pneumoniae.

48
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Ces agglutinines sont présentes entre 30 à 70 % et ne sont pas spécifiques,


leur recherche n’est plus pratiquée.

B-Réaction de fixation du complément :


Consiste en la recherche des anticorps dirigés contre les antigènes
glycolipidiques de la bactérie.

Elle détecte les anticorps totaux et demande de titrages de l’antigène, du


complément et des anticorps.

Les anticorps fixant le complément apparaissent le 7ème jour de la maladie


et persistent pendant plusieurs mois.

Le diagnostic d’une infection récente est posé devant une augmentation


significative des anticorps de 4 fois entre le premier et le 2ème sérum.

Un taux de positivité de 64 sur un seul sérum ne permet pas d’affirmer


l’infection récente.

Des réactions faussement positives ont limité l’utilisation de cette


technique.

C-Immunofluorescence :
L’antigène bactérien est utilisé soit directement soit sous forme de culot
lavé et fixé sur lame : cette technique permet de rechercher les IgM et IgG
mais sa principale difficulté réside dans le fait que des artefacts peuvent
être à l’origine de faux positifs étant donné que les mycoplasmes changent
de forme cellulaire, il est parfois difficile de les reconnaitre.

D.Technique ELISA :
Permet de rechercher aussi bien les IgG que les IgM, c’est une méthode
sensible et spécifique adaptée pour les analyses en série, détecte les
anticorps en 7 à 10 jours.

La technique est identique aux techniques ELISA.

E.Agglutination de particules de latex :

49
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Des particules de gélatine, sensibilisées par le composant de la membrane


cellulaire de la bactérie vont être agglutinées par des anticorps anti-
M.pneumoniae présents dans le sérum, la technique est réalisée sur plaque
en U.

 Le sérum est recueilli après centrifugation puis décomplementaté à


56°C pendant 30 mn.
 Reconstituer le lyophilisat de particules de latex sensibilisées et non
sensibilisées avec le diluant.
 Conserver au frais (2-10°) jusqu'à utilisation.
 Déposer 100 ul de diluant dans la cupule n°1, 25 ul dans les cupules
n°2 à 12.
 Ajouter 25 ul de l’échantillon à tester dans la cupule n°1
l’homogénéiser.
 Prélever 25 ul de l’échantillon dilué et le transvaser dans la cupule
n°2, continuer jusqu’à la cupule n°12 pour obtenir des dilutions de 2
en 2.
 Déposer 25 ul de solution de particules non sensibilisées dans la
cupule n°2 et 25 ul de solution de particules sensibilisées dans la
cupule n°3 à 12.
 Tester en parallèle de la même manière le sérum témoin positif.
 Agitation sur agitateur automatique pendant 1 mn.
 Couvrir la plaque et laisser incuber à température pendant 3 heures.

Lecture :

 Le contrôle négatif ne doit pas agglutiner.


 Les contrôles réactif, diluant et particules sensibilisées et non
sensibilisées doivent rester négatifs.
 Le contrôle positif doit titrer 320.
 Placer la plaque sur un visionneur ou sur une surface blanche.
 Une réaction positive est à partir d’un titre de 40 et plus.

Précautions à prendre :

 Eviter la contamination du sérum et des réactifs.


 Eviter les vibrations lors de l’incubation de la plaque.

50
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

VI.5.3-Legionella pneumophila :
VI.5.3.1-Prélèvement :
Différents prélèvements peuvent être effectués : l’expectoration ou le plus
souvent lavage broncho-alvéolaire (LBA) ou brossage, la biopsie
pulmonaire, et parfois la ponction pleurale.

L’acheminement au laboratoire est immédiat.

VI.5.3.2-Examen direct :
La technique d’immunofluorescence directe utilise un anticorps
monoclonal. Elle consiste à étaler le prélèvement sur lame et à révéler la
Legionella par des anticorps monoclonaux marqués à la fluorescéine.

Cette technique est sensible dans 75 % et spécifique dans 100 % mais ne se


positive qu’au bout de 4 à 6 semaines.

VI.5.3.3-Mise en culture :
Elle n’est pas systématique et tend à être remplacée par des techniques
rapides.

Les prélèvements effectués (LBA, expectoration, aspiration trachéale) sont


examinés au laboratoire.

Si le prélèvement est fluide l’ensemencement se fera directement sans


traitement préalable.

En présence de prélèvements plus épais il faudrait le fluidifier par un


digesteur (voir technique expectoration).

Pour les prélèvements contaminés tel que l’expectoration il est nécessaire


de décontaminer par acidification.

Le prélèvement est traité volume à volume par une solution tampon à pH =


2 (HCL 0.2 M, KCL) 30 minutes à température ambiante puis neutralisé par
une solution de KOH à 0.01 N à pH = 11 (exemple : 0.5 ml de prélèvement
sont rajoutés à 0.5 d’une solution à pH 2 , puis pour la neutralisation à 0.5
ml d’une solution à pH 11).

51
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

En cas d’échec de la décontamination par acidification seule, un chauffage


du prélèvement pendant 30 mn au bain marie à 50°C suivi d’une
acidification /neutralisation sont effectués.

La culture se fait par ensemencement de 0.1 ml de prélèvement par boite


par un étalement au râteau.

Deux boites du milieu BCYE (Buffer Chocolat Yeast Extract) sont utilisées
par prélèvement l’une contenant la cystéine et l’autre sans cystéine et
incubées à 35°C sous 2.5 % CO2.

Le milieu BCYE est additionné d’inhibiteurs en cas de prélèvement


contaminé (expectoration), polymyxine B (80 U/ml), cefamandole (4
ug/ml), anisomycine (80 ug/ml) ou le mélange céfalotine (4 ug/ml),
colistine (16 ug/ml) Vancomycine (0.5 ug/ml) et cyclohexemidine (80
ug/ml).

Si le laboratoire ne possède pas d’étuve à 2.5 % de CO2 une cloche avec une
bougie peut être utilisée ou alors une incubation à l’air.

Les cultures sont examinés quotidiennement jusqu’à 10 jours, les colonies


généralement apparaissent en 3 à 4 jours.

Les cultures sont examinées à l’aide d’une loupe binoculaire


(stéréomicroscope au grossissement 30) pour la recherche de legionelles.

Les colonies apparaissent sous l’aspect de verre fritté.

Elles seront repiquées sur milieu BCYE avec ou sans cystéine.

L’identification à partir de la culture est de 40 à 60 %.

Les colonies suspectes sont des bacilles à gram négatif qui ne cultive pas sur
milieu dépourvu de cystéine, la réaction catalase est positive, l’oxydase est
inconstante, la gélatinase est positive et l’immunofluorescence directe est
positive.

52
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Les tests biochimiques ont peu d’intérêt en dehors de l’hydrolyse de


l’hippurate.

VI.5.3.4-Diagnostic rapide :
Plusieurs techniques sont proposées pour la recherche d’antigènes dans les
urines.

La technique « Enzyme Immunoassay »(EIA) recherche l’antigène de


Legionella dans les urines (Biotest), donne un diagnostic précoce sensible et
spécifique.

Principe :

 Les anticorps monoclonaux regroupant tous les sérotypes sont fixés


au fond des cupules.
 Les urines du malade rajoutées dans les cupules contenant des Ag
vont réagir avec les anticorps.
 Apres des lavages, un anticorps anti- L.pneumophila marqué à la
peroxydase est rajouté.
 Le substrat est rajouté après des lavages ;
 Une réaction positive donne une coloration lue au
spectrophotomètre.

Matériel nécessaire :

 Pipettes de 100 ul.


 Incubateur 37°C.
 Laveur de microplaques.
 Spectrophotomètre 450 nm.
 Eau distillée.

Prélèvement :

Urine prélevée dans un dispositif stérile gardée à T° ambiante pendant 24 h


, peut être conservée 2-8°C pendant 14 jours ou congelée à -20°C.

Le test :

 Plaque contenant 12 cupules :1ère cupule : est le blanc, les cupules 2 et


3 : contrôles négatifs, cupule 4 : contrôle positif.
 Distribuer à partir de la cupule 2,100 ul de prélèvement.

53
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

 Incuber à 37°C, 1 heure.


 Lavage 3 à 5 fois par la solution de lavage.
 Rajouter 100 ul d’antilegionella à chaque cupule.
 3ème incubation 10 mn, T° ambiante et à l’obscurité.
 Rajouter 100 ul de solution d’arrêt dans chaque cupule, la coloration
bleue des prélèvements positifs doit virer au jaune, s’il y a coloration
verte il faut agiter les cupules jusqu’à sa disparition.

Lecture

 Lecture à 450 nm.


 La DO du blanc et du contrôle négatif doit être < à 0.100.
 DO du contrôle positif doit être > à 0.600.
 Si ces conditions ne sont pas réunies il faut refaire le test.
 Un prélèvement est positif si la DO est > à 0.600.

Précautions :

 Un traitement antibiotique peut diminuer le taux d’antigènes tout


comme un patient peut excréter l’antigène longtemps après sa
guérison.
 Une confrontation des résultats de la sérologie à la clinique est
nécessaire.

VI.5.3.5-PCR :
Non encore généralisée.

54
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

VI.5-Bordetella (voir fascicule IPA 2004) :


VI.5.1-Prélèvement : le meilleur prélèvement est l’aspiration
nasopharyngée.

VI.5.2-Culture :
Ensemencer deux boites de milieu de Bordet et Gengou une ne contenant
pas d’antibiotique et l’autre contenant 40 ug/ml de cephalexine.

Incuber à 35°C pendant 7 jours.

Au bout de 2 à 3 jours, les colonies peuvent apparaitre, elles sont de 0.2 à 1


mm arrondies à bords réguliers, surélevées à surface luisante et reflet
métallique et entourées d’un halot d’hémolyse.

B.pertussis a une culture plus lente que les autres espèces de Bordetella.

VI.5.3-Identification :
A partir de colonies suspectes effectuer des tests d’orientation à savoir, la
coloration de gram qui montrera des bacilles de gram négatifs, et les
réactions de catalase et oxydase qui sont positives.

Réisoler en nappe sur 4 boites de Bordet et Gengou : une boite pour doser
l’activité de l’adényl cyclase, l’autre pour la conservation de la souche, une
pour l’antibiogramme et une pour le sérotypage.

Isoler en stries une boite pour l’identification.

Ensemencer une galerie Api 20 E, incuber 24 h : les caractères les plus


importants sont l’absence d’acidification des glucides, absence de nitrate
réductase et d’uréase.

L’identification directe par immunofluorescence à partir d’une suspension


bactérienne peut être réalisée.

VI.5.4-Recherche de toxines et facteurs d’adhérence


bactériens :

55
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

À partir de culture bactérienne on effectue une suspension dense puis une


immunofluorescence directe en utilisant des anticorps monoclonaux.

VI.5.5-L’identification du sérotype :
Se fera par immunofluorescence directe en utilisant des anticorps
monoclonaux ou par agglutination.

Les sérotypes 1.2 et 3 sont les plus fréquents.

VI.5.6-Biologie moléculaire :
 La PCR est utilisée pour a détection directe de B.pertussis à partir du
prélèvement.
 Elle est aussi utilisée pour la recherche de la toxine.
 La caractérisation des souches épidémiques se fait par électrophorèse
en champs pulsé.

56
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Références :
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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

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25-Ramdani.N, Benachour A, Douar Y, Neggazi M, Ghorab T, Tazir M.


Bactériologie des pneumopathies nosocomiales. Poster P03, 15ème
Conférence de la région Afrique de l’UICT, Alger 9-12 février 2004.

26-Raymond J.Diagnostic bactériologique des infections réspiratoires


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59
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Annexes
Fiche technique Streptococcus pneumoniae :
I-Préparation du désoxycholate de sodium :
1-En milieu liquide :

Préparer deux tubes de Kahn stériles.

Distribuer dans chaque tube 0.5 ml d’une suspension bactérienne de


pneumocoque de densité 0.5 à 1 Mac Farland.

Une quantité égale (0.5 ml) d’une solution de désoxycolate de sodium à 2 %


(la bile) est ajoutée dans un tube alors que 0.5 ml d’eau physiologique est
rajoutée dans le deuxième tube. Incuber 2 heures à 35°.

Une réaction positive, indiquant la présence d’un pneumocoque, se


manifeste par un éclaircissement du tube contenant le désoxycholate de
sodium alors que l’autre tube reste trouble.

La solution de désoxycholate à 1% peut aussi être utilisée.

2-En milieu solide :

Déposer une goutte d’une solution de désoxycholate de Na à 10 % ou à 2 %


sur les colonies. La boite est ainsi posée sur une surface plate, couvercle
vers le haut pendant 15 mn soit à température ambiante ou incubée à 35°C
en aérobiose.

Une réaction positive se manifeste par une disparition des colonies ou leur
aplatissement alors qu’une réaction négative laisse les colonies intactes.

Il faudrait éviter les excès de solution qui favorisent le glissement des


colonies ce qui pourrait être interprété comme positif par erreur.

60
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

II-Les sérums et formule antigénique de


S.pneumoniae :
1-Les sérums pour le sérotypage des pneumocoques :
Pool Type ou groupe

A 1, 2, 4, 5,18*.

B 3, 6, 8, 19.

C 7, 20, 24, 31, 40.

D 9, 11, 16, 36, 37.

E 10, 12, 21, 33, 39.

F 17, 22, 27, 32, 41.

G 29, 34, 35, 42, 47.

H 13, 14, 15, 23, 28.

I 25, 38, 43, 44, 45, 46, 48.

*Les groupes mentionnés en gras contiennent des sérotypes qui sont cités ci-dessous.

61
Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

2-Désignation des sérotypes et formules antigéniques


des 90 sérotypes : (11)
Types Formules antigéniques Types Formule antigénique

1 1a 19C 19a, 19c, 19f, 7h.


2 2a 20 20a, 20b, 7g
3 3a 21 21a
4 4a 22F 22a, 22b
5 5a 22A 22a, 22c
6A 6a, 6b 23F 23a, 23b, 18b
6B 6a, 6c 23A 23a, 23c, 15a
7F 7a, 7b 23B 23a, 23b, 23d
7A 7a, 7b, 7c 24F 24a, 24b, 24d, 7h
7B 7a, 7d, 7h, 7e 24A 24a, 24c, 24d
7C 7a, 7d, 7f, 7g, 7h 24B 24a, 24b, 24h, 7h
8 8a 25F 25a, 25b
9A 9a, 9c, 9d 25A 25a, 25c, 38a
9L 9a, 9b, 9c, 9f 27 27a, 27b
9N 9a, 9b, 9c, 28F 28a, 28b, 16b, 23d
9V 9a, 9c, 9d, 9g 28A 28a, 28c, 23d
10F 10a, 10b 29 29a, 29b, 13b
10A 10a, 10c, 10d 31 31a, 20b
10B 10a, 10b, 10c, 10d, 10e 32F 32a, 27b
10C 10a, 10b, 10c, 10f 32A 32a, 32b, 27b
11F 11a, 11c, 11e, 11g 33F 33a, 33b, 33d
11A 11a, 11c, 11d, 11 e 33A 33a, 33b, 33d, 20b
11B 11a, 11b, 11f, 11g 33B 33a, 33c, 33d, 33f
11C 11a, 11b, 11c, 11d, 11f 33C 33a, 33c, 33 e
11D 11a, 11b, 11c, 11e 33D 33a, 33c, 33d, 33f, 3a
12F 12a, 12b, 12d 34 31a, 34b
12A 12a, 12c, 12d 35F 35a, 35b, 34b
12B 12a, 12c, 12c, 12 e 35A 35a, 35c, 20b
13 13a, 13b 35B 35a, 35c, 29b
14 14a 35C 35a, 35c, 20b, 42a
15F 15a, 15b, 15c, 15f 36 36a, 9e
15A 15a, 15c, 15d, 15g 37 37a
15B 15a, 15b, 15d, 15 e, 15h 38 38a, 25b
15C 15a, 15d, 15 e 39 39a, 10d
16F 16a, 16b, 11d 40 40a, 7g, 7h
16A 16a, 16c 41F 41a, 41b
17F 17a, 17b 41A 41a
17A 17a, 17c 42 42a, 20b, 35c
18F 18a, 18b, 18c, 18f 43 43a, 43b
18A 18a, 18b, 18d 44 44a, 44b, 12b, 12d
18C 18a, 18b, 18 e, 18g 45 45a
19F 19a, 19b, 19d 46 46a, 12c, 44b
19A 19a, 19c, 19d. 47F 47a, 35a, 35b
19 19a, 19c, 19 e, 7h 47A 47a, 43b
48 48a

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

3-Gamme de dilution pour les CMI et le screening test.


3.1-Gamme d dilution complète des CMI pour les
Bétalactamines en milieu solide :
Concentration initiale concentration intermédiaire concentration finale en
Solution Eau distillée boite
2000 mg/l (20 mg de poudre + 10 6.4 ml +3.6 ml 128 mg/l
ml d’eau distillée)

1280 mg/l 2 ml + 2 ml : 640 mg/l 64 mg/l


1 ml + 3 ml : 320 mg/l 32 mg/l
0.5 ml + 3.5 ml: 160 mg/l 16 mg/l
0.5 ml + 7.5 ml: 80 mg/l 8 mg/l
80 mg/l 2 ml + 2 ml : 40 mg/l 4 mg/l
1 ml + 3 ml : 20 mg/l 2 mg/l
0.5 ml + 3.5 ml: 10 mg/l 1 mg/l
0.5 ml + 7.5 ml: 5 mg/l 0.5 mg/l
5 mg/l 2 ml + 2 ml : 2.5 mg/l 0.25 mg/l
1 ml + 3 ml : 1.25 mg/l 0.125 mg/l
0.5 ml + 3.5 ml: 0.63mg/l 0.063mg/l
0.5 ml + 7.5 ml: 0.32mg/l 0.032mg/l
0.32 mg/l 2 ml + 2 ml : 0.16 mg/l 0.016 mg/l

Ces concentrations sont obtenus après dilution au 1/10ème des solutions intermédiaires dans le
Mueller Hinton additionné de 5 % de sang de mouton.

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

3.2-Gamme de dilutions pour le screening test de la


pénicilline
Concentration initiale Concentration intermédiaire Concentration finale en
Solution Eau distillée boite
16 mg de poudre + 10 ml d’eau 1600 mg/l
distillée

1600 mg/l 1 ml + 9 ml :160 mg/l


160 mg/l 1 ml + 2 ml :80 mg/l
80 mg/l 1 ml + 3 ml : 20 mg/l 2 mg/l
0.5 ml + 3.5 ml :10 mg/l 10 mg /l
0.5 ml + 7.5 ml :5 mg/l -
5 mg/l 1 ml + 3 ml :1.25 mg/l 0.125 mg/l
0.5 ml + 3.5 ml :0.63 mg/l 0.063 mg/l

Ces concentrations sont obtenus après dilution au 1/10ème des solutions intermédiaires dans le
Mueller Hinton additionné de 5 % de sang de mouton.

Pour la pénicilline, seules les dilutions 0.063-0.125-1 et 2 mg/l seront testées.

3.3-Gamme de dilutions pour le screening test à


l’Amoxicilline et du Cefotaxime (174).
Concentration initiale Concentration Concentration finale en boite
intermédiaire
20 mg de poudre + 10 ml d’eau 2000 mg/l -
distillée

2000 mg/l 1 ml + 9 ml -

200 mg/l 1 ml + 9 ml 2 mg/l

20 mg/l 2 ml + 2 ml 1 mg/l

10 mg/l 2 ml + 2 ml 0.5 mg/l

Ces concentrations sont obtenus après dilution au 1/10ème des solutions intermédiaires dans le
Mueller Hinton additionné de 5 % de sang de mouton.

Pour l’Amoxicilline et le Céfotaxime, seules les dilutions 0.5, 1 et 2 mg/l seront testées.

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Fiche technique Chlamydiae :


I-Diagnostic direct
1-Equipements :

 Flacons pastiques de 75 cm2 pour culture cellulaire (type COSTAR) ;


 Plaques de 24 puits pour culture cellulaire ;
 Lamelles rondes en verre de 1 cm de diamètre ;
 Billes de verre de 2 mm de diamètre ;
 Pipettes plastiques stériles de 1.5 et de 10 ml ;
 Seringues de 5 ml ;
 Agitateur de tubes type Vortex ;
 Centrifugeuse de plaques 24 puits, pouvant atteindre 1500 g ;
 Etuve à 37 °C et à atmosphère de 5-10% CO2 ;
 Microscope à équipement pour fluorescence ;
 Congélateur à -70°C ;
 Réfrigérateur à +4°C.

2-Réactifs et milieux de culture :

 Milieu EAGLE MEM (entretien des cellules) ;


 Milieu de HANKS ;
 Trypsine ;
 Cycloheximide solution mère (actidione) ;
 Glucose à 10 % ;
 EAGLE enrichi (après inoculation) ;
 Tampon 2SP ;
 Milieu de conservation des souches : « 4SP » ;
 Bleu de Trypan

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Fiche technique mycoplasmes


1-Composition des milieux de culture :
Milieu liquide SP-4
La base

 Mycoplasma broth base (Oxoid)………………………...3,5 g


 Tryptone (Difco)………………………………………………. 10 g
 Peptone (Difco)……………………………………………….. 5.3 g
 Glucose ………………………………………………………….....5g
 Rouge de phénol à 0.5 % …………………………………..20 ml.
 NaHCO3…………………………………………………………….2.2 g
 Levures à 25 % …………………………………………………35 ml
 Yeastolate (Difco) ……………………………………………..2g
 Eau distillé QSP …………………………………………………700 ml

Stériliser à 120 ° pendant 15 à 20 mn, pH=7.6

Suppléments stériles :

 Milieu CMRL 1066 (X10) Difco ………………………….50 ml.


 Glutamine (X100) ……………………………………………..5 ml
 Sérum de veau fœtal……………………………….. ……….170 ml
 Colimycine………………………………………………………. 500 000 UI/L
 Ampicilline………………………………………………………..1g
 Rouge de Phénol (0.1%)………………………………….. 20 ml

Le milieu diphasique a la même composition avec en plus 2 g d’agar purifié


(Oxoid), il faut distribuer 3 ml de SP-4 gélosé et après solidification rajouter
2 ml de milieu SP-4 liquide.

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Fiche technique Legionelles :


1. Composition du milieu de culture :
Buffer Charcoal Yeast Extract (BCYE):
 Extrait de levure 10 g
 Charbon active 2g
 Agar 17g
 Tampon Aces (Acide N2-acétamido-2-amino-éthane-sulfonique) 10 g
 L-Cystéine HCL,2 H2O 0.4g
 Pyrophosphate ferrique soluble 0.25g
 KOH 1N 40g
 Eau distillée 1000 ml

Filtrer (porosité 0.2) la cystéine et le pyrophosphate chacun séparément


dans 10 ml d’eau distillée stérile.

Autoclaver les autres composants dans 980 ml d’eau distillée.

Refroidir à 50°C et ajouter les composants filtrés.

Ajuster à pH 6.9 +/- 0.05

Milieu BCYE contenant des antibiotiques (BAB) :

La composition est celle du milieu BCYE auquel sont ajoutés trois


antibiotiques :

 Céfalotine 4 mg/l
 Colistine 16 mg/l
 Vancomycine 0.5 mg/l

Les antibiotiques dissous chacun dans 1 ml d’eau distillée stérile, sont


ajoutés dans le milieu prêt à être coulé après ajustement du pH.

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

2-Traitement des prélèvements contaminés par


acidification-neutralisation :
Acidifier par une solution HCL-KCL (0.2N), pH=2

 KOH 0.01N 10.7 ml


 Eau distillée stérile qsp 100 ml

3. Test à l’hippurate :
 A partir d’une culture de 24 à 96 heures de Legionella, réaliser une
émulsion dense dans 0.4 ml de milieu à l’hippurate stérile (hippurate
de sodium à 1% en eau distillée)
 Laisser 18 à 24 h à 35°C.
 Ajouter 0.2 ml de ninhydrine
 Lire après 20 mn
 Une coloration violette signe une réaction positive.

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Légionellose-Diagnostic direct et culture

(LBA, Aspiration bronchique, Brossage bronchique, expectoration, liquide pleural,


biopsie pulmonaire)

BCYE BCYE + antibiotiques

35°-37°C 48 H minimum

Aérobiose 2.5 % CO2

Colonies

Aspect macroscopique

Suspension en eau distillée stérile

BCYE
BCYE sans Cystéine

Culture
Absence de culture
Legionella

Immunofluorescence directe

Identification de l’espèce et du sérotype

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

Fiche technique Bordetella


1-Milieu de Bordet et Gengou : en g/l
1.1-Composition :
 Protéose peptone 10g
 Infusion de pomme de terre 4.5g
 Chlorure de sodium 5.5g
 Agar 16g
 PH final = 6.7 +/- 0.2
 QSP 1 litre d’eau distillée

1.2-Préparation :
Faire liquéfier le contenu de chaque tube, en ramener la température à 45°-
50°C

Ajouter stérilement :

 Sang de cheval = 10 à 15 %.
 Pénicilline = 10 unités

Bien mélanger sans faire des bulles et couler en boites de Pétri.

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

2-Identification des Bordetella :


Test B.pertussis B.parapertussis B.bronchoseptica B.holmesii B.hinzii B.trematum B.avium
Phase I / Phase IV Phase I / Phase IV Phase I/Phase IV

Hémolyse + - + - + - + - - - -

Croissance sur BGS + (3 à 4 j) + (2 à 3 j) + (1 à 2 j) +(2j) +(1j) + +

Croissance sur Mac Conkay - + + + + + + +

Oxydase + + + - + - +

uréase - + + - - - -

Nitrate réductase - - + - - +/- faible -

utilization du citrate - - +/- faible - + + +/- faible

Arginine Dihydrolase +/- - +/- - + +/-

Ornithine décarboxylase - - - - + -

acidification des carbohydrates - - - - - - -

Mobilité - - - + - + + +

Pigment sans brun sans brun sans jaunatre sans

G+C % 67.7-68.9 68.1-69 68.2-69.5 61.5-62.3 66-67 64-65 61.6-62.6

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Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires 2005

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