MANUAL DE LABORATORIO DE BIOCOMBUSTIBLE

Beleño Gutiérrez María José

Cala López Caty Felisa
Cañas Baquero Paola Mildred
Guerra Tamara Berenice Paola
Gutiérrez Benavides Bryan Andrés
Morales Castro Maria Alejandra
Pabón Ocampo Lizeth
Ramírez Martínez Diana
Sierra Rangel Enrique Elías
Venegas Camelo Diego Andrés

ING. JUAN GUILLERMO REALES ALFARO

 CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN.

1.1. Elementos de laboratorio.

2. OBTENCIÓN DE BIODIESEL

2.1. Aspectos generales del biodiesel.

2.2. Materias primas para la producción de biodiesel.

3. PROCEDIMIENTO DE LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL

3.1. Objetivo
3.2. Equipos y materiales
3.3. Reactivos
3.4. Procedimiento
3.4.1. ESTERIFICACIÓN DEL ACEITE.
3.4.1.1. condiciones
3.4.1.2. cálculos:
3.4.1.3. pasos
3.4.2. TRANSESTERIFICACIÓN DEL ACEITE.
3.4.2.1. condiciones
3.4.2.2. cálculos:
3.4.2.3. pasos

4. OBTENCIÓN DE BIOETANOL

4.1. Aspectos Generales

5. PROCEDIMIENTO DE LA OBTENCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE

AZUCARES FERMENTABLES.

5.1. Objetivo
5.2. Equipos y materiales
5.3. Reactivos
5.4. Procedimiento
5.5. Cálculos
6. PROCEDIMIENTO DE LA OBTENCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE
ALMIDONES (ALMIDÓN DE YUCA).

6.1. Objetivo
6.2. Equipos y materiales
6.3. Reactivos
6.4. Procedimiento
6.4.1. Activación de la levadura
6.4.2. Procedimiento general
6.5. Cálculos

7. PROCEDIMIENTO DE LA OBTENCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE

MATERIAL LIGNOCELULOSICO (BAGAZO DE CAÑA).

7.1. OBJETIVO
7.2. EQUIPOS Y MATERIALES
7.3. REACTIVOS
7.4. PROCEDIMIENTO
7.4.1. Tratamiento del Material lignocelulosico
7.4.2. Determinación del tamaño de la partícula
7.4.3. Pretratamiento químico del bagazo de caña

8. ANEXOS (A1)

8.1. DENSIDAD
8.2. ÍNDICE DE ACIDEZ
8.3. ÍNDICE DE YODO

9. ANEXO (A2)
9.1. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR METODO-
DNS (ACIDO 3,5-DINITROSALICÍLICO).
9.2. CUANTIFICACIÓN DE ETANOL POR DICROMATO DE POTASIO
9.3. CUANTIFICACIÓN DEL GRADO DE ALCOHOL PROBABLE POR
REFRACTÓMETRIA

10. REFERENCIAS
 1. INTRODUCCIÓN

El objetivo general del trabajo de laboratorio de biocombustibles es familiarizar al

estudiante con las principales técnicas que se aplican para la obtención de biodiesel,
bioetanol y biogás. Además, que el alumno compruebe los principios teóricos
aprendidos en la asignatura, al igual que los conocimientos obtenidos en las
distintas asignaturas como, Química I, Química II, Química analítica y Química
instrumental.

La experiencia exige tiempo, paciencia y ante todo observación, capacidad

interpretativa y razonamiento inductivo y deductivo.

El estudiante debe descubrir por sí mismo que es lo que ocurre, observar e

interpretar y finalmente saber tomar una decisión frente al producto, teniendo en
cuenta la normativa exigente en el país.

Es de vital importancia, que antes de realizar cualquier trabajo en el laboratorio, el

alumno tenga bien claro las normas de seguridad en el laboratorio, para evitar
cualquier accidente. Sobre todo tener claro el trabajo con los reactivos a utilizar, es
decir, el cuidado que se debe tener al momento de utilizar dicho reactivo. Por tal
motivo se recomienda buscar la ficha técnica del reactivo e identificar la clase de
peligro y como se puede evitar.

Se recomienda al alumno que antes de trabajar en el laboratorio lo prepare y busque

con anticipación los reactivos, materiales y equipos a utilizar para sacar mejor
provecho de él.

Este manual está elaborado con base a conocimientos obtenidos en la asignatura y

revisiones de artículos concernientes al tema de importancia.
1.1. ELEMENTOS DE LABORATORIO

NOMBRE DEL
CLASIFICACIÓN UTILIDAD
MATERIAL DIBUJO

Vaso de Se usa como recipiente y

precipitados también para obtener
precipitados. No es
aparato e medida pero da
un valor aproximado del
líquido que lo puede
contener. Con pico para
verter.

Cristalizador Puedo realizar

cristalizaciones. El
solvente se evapora y el
soluto queda cristalizado.
Con pico para verter.
Mucha superficie y poca
Material de vidrio capacidad porque así
facilita la evaporación.

Cápsula de Petri Misma funcionalidad que

el cristalizador pero como
no es de vidrio pirex, no
se puede calentar; se
evapora al aire libre. Es
además para aislar
sustancias, bacterias,
sistemas, etc.

Tubo de ensayo Se emplea para realizar

los ensayos o pruebas de
laboratorio. Puede ser de
vidrio común o vidrio
templado. Para
reacciones exotérmicas
se usa vidrio templado.
 De diversas formas que
se emplean en el
laboratorio para calentar
líquidos cuando hay
peligro de pérdida de
Matraz vaporización, o para titular
Erlenmeyer en el análisis cuantitativo.
Mucha capacidad y poca
superficie. Limita o
condiciona a esa
superficie la evaporación.
Además lo puedo tapar
para anular la
evaporación.

Con valor aproximado.

Impide del paso del
Embudo de contenido. Permite
separación o separar un sistema
ampolla de material formado por
decantación. líquidos no miscibles (que
no se mezclan)

No es de pirex. Colocar
sustancia sólidas;
observar sus
propiedades.
Vidrio de reloj

Para la presión al vacío.

Con embudo buhne que lo
conecto a la bomba de
vacío y extraigo el aire
Matraz Kitasato
contenido dentro del
matraz Kitasato.
Disminuye la presión.
 Se emplea para realizar
electrólisis de soluciones
iónicas.
Voltámetro de
Hoffman

El extractor Soxhlet o
simplemente Soxhlet (en
honor a su inventor Franz
Extractor von Soxhlet) es un tipo de
Soxhlet material de vidrio utilizado
para la extracción de
compuestos,
generalmente de
naturaleza lipídica

Instrumento de vidrio de
cuello largo y angosto, se
usa para preparar
soluciones.

Matraz Aforado
o Fiola

Es un recipiente de vidrio
pirex, que sirve para
Balón preparar soluciones o
reacción química.
 Aparato de Kipp Se utiliza para la
preparación de gases
mediante reacción
química.

ELEMENTOS IMPORTANTES A UTILIZAR

2. OBTENCIÓN DE BIODIESEL

2.1. ASPECTOS GENERALES DEL BIODIESEL

La contaminación ambiental generada por los combustibles fósiles apuntan a la

necesidad de reducir el consumo de hidrocarburos derivados del petróleo,
implementando medidas para disminuirlo y procurando satisfacer la demanda
energética nacional con fuentes alternativas de energía, menos lesivas a la
economía nacional y al medio ambiente.

Una de las alternativas viables es la sustitución de los combustibles derivados del

petróleo, por otros combustibles producidos a partir de cultivos renovables tales
como los biocombustibles, especialmente, el biodiesel. Sustitución que puede ser
tanto parcial como total y no requiere de modificaciones significativas de los
sistemas de distribución. Así mismo los vehículos actualmente en circulación
requerirían de mínimas modificaciones y en su mayor parte de ninguna, para utilizar
estos combustibles o sus mezclas.

El biodiesel es un biocombustible sintético líquido que se obtiene a partir de lípidos

naturales como aceites vegetales o grasas animales, nuevos o usados, mediante
procesos industriales de esterificación y transesterificación, y que se aplica en la
preparación de sustitutos totales o parciales del petrodiesel o gasóleo obtenido del
petróleo.

Este biocombustible puede mezclarse con gasóleo procedente del refino de petróleo
en diferentes cantidades. Se utilizan notaciones abreviadas según el porcentaje por
volumen de biodiesel en la mezcla: B100 en caso de utilizar sólo biodiesel, u otras
notaciones como B5, B15, B30 o B50, donde la numeración indica el porcentaje por
volumen de biodiesel en la mezcla.

La reacción química que mejores resultados ha demostrado tener para obtener

biodiesel es la transesterificación. Esta consiste en la reacción entre un triglicérido
(compuesto por una molécula de glicerol esterificada por tres moléculas de ácidos
grasos), contenido en el aceite vegetal o grasa animal y un alcohol ligero (metanol
o etanol), obteniéndose como productos glicerina y ésteres derivados de los tres
ácidos grasos de partida, es decir, biodiesel.
Figura 1: Reacción de transesterificación

Fuente: Características del biodiesel de palma y las mezclas., Mónica Cuéllar

Sánchez., Fedepalma.

2.2. MATERIAS PRIMAS PARA LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL

Si bien se puede obtener biodiesel a partir de grasa animal y aceite de fritura usado,
la materia prima más abundante son los aceites vegetales. Las dos etapas
necesarias para la obtención de biodiesel a partir de aceites vegetales, son:

1. La conversión de la materia prima en aceite vegetal

2. Su transformación química en éster.

Entre los principales aceites vegetales usados se encuentran los de colza, palma,
soya, girasol, Jatropha, semilla de algodón, canola, grasas animales y aceites
usados.

La investigación en materias primas es liderada principalmente por Estados Unidos,

China, Japón, India, Alemania y Turquía, que trabajan primordialmente en soya,
colza, girasol y palma. Se observa una estrecha relación entre la disponibilidad de
materia prima y la publicación de artículos científicos ya que cada país investiga
principalmente sobre la materia prima que tiene disponible. También se consideran
materias primas de importancia a las grasas animales, los aceite de cocina y, tal vez
el más promisorio sea, el Jatropha Curcas.
Por cuanto los aceites vegetales representan del 60 al 75% del costo final del
biodiesel, se investiga permanentemente en busca de materias primas de menor
costo, tales como las grasas animales y aceite de cocina usado. El otro factor
importante es el requerimiento de tierras de cultivo, que es la fuente de cada tipo de
materia prima. En este sentido tendría cierta ventaja la Jatropha Curcas, que es
adaptable a terrenos marginales improductivos, por lo que no desplazaría a los
cultivos alimenticios.

Figura 2: Especificaciones de calidad establecidas nacional e internacional.

Fuente: Características del biodiesel de palma y las mezclas., Mónica Cuéllar

Sánchez., Fedepalma.

Propósito / importancia / efectos posibles de la desviación de

Propiedad
especificación
Valores inferiores a la especificación indican reacción
Contenido de
incompleta/presencia de aceite.
éster (min.)
Provocará alta viscosidad, disminución del efecto spray, aumento de
carbonilla, combustión deficiente.
 Densidad
(15ºC) Depende del aceite de partida y proceso de transesterificación. Un
valor bajo indica excesivo resto de alcohol.

Satisfactoria combustión del combustible. El valor de la viscosidad

debe ser del mismo nivel del diésel convencional. Se deben evitar
valores mayores de viscosidad que el diésel, sin embargo, una
viscosidad tendiendo al valor más bajo del rango de la especificación
Viscosidad puede resultar ventajosa para motores que requieran menor potencia
(40ºC) en la bomba de inyección y en la salida de los inyectores.
Bajos valores indican exceso de metanol. Altos valores indican
degradación térmica y oxidativa, presencia de aceite sin reaccionar y
pueden provocar problemas en los inyectores y sistema de bombeo.
Acorta la vida del motor.
Seguridad contra incendios. Se utiliza como mecanismo para limitar el
nivel del alcohol sin reaccionar que permanece en el biodiesel
terminado. Normalmente, el punto de inflamación del biodiesel es
Punto de
mayor que el del diésel. Un bajo valor puede provocar problemas en el
inflamación
manipuleo, transporte y almacenamiento.
(min.)
Proteger el sistema catalítico del escape. El biodiesel generalmente
contiene menos de 15 ppm de azufre. Se recomienda utilizar el método
de ensayo ASTM D 5453 con el biodiesel. El uso de otros métodos de
ensayo puede dar resultados erróneos al analizar B100 con niveles de
azufre extremadamente bajos (menos de 5 mg/Kg.). Un valor alto
Azufre
indicaría contaminación del biodiesel y provocaría mayores emisiones
de SO2.

Buen desempeño del motor, es una medida de la calidad de ignición

del combustible y del proceso de combustión. Los requerimientos de
número de Cetano dependen del tamaño y diseño del motor, de la
naturaleza de las variaciones de velocidad y carga, y de las
Número de
condiciones atmosféricas. Depende de la materia prima y nivel de
Cetano
oxidación del biodiesel. Un bajo valor indica poca tendencia a la auto-
(min.)
ignición y provocaría mayor cantidad de depósitos en el motor y mayor
desgaste en los pistones.

Contenido de Un exceso de agua en el biodiesel puede ocasionar problemas de

agua hidrólisis (aparición de ácidos grasos libres).
 Prevenir corrosión y proliferación de organismos. Establecido al mismo
nivel del diésel convencional. Un exceso de agua puede causar
corrosión y proveer un ambiente propicio para la proliferación de
microorganismos. La oxidación puede incrementar el nivel de
sedimentos: por lo tanto este análisis debe ser usado con el de número
ácido y viscosidad para determinar que tanto se oxidó el combustible
Agua y durante su almacenamiento. Un exceso de agua puede ocasionar
sedimentos problemas de hidrólisis (aparición de ácidos grasos libres). La
presencia de sedimentos/contaminación depende de insaponificables
en la materia prima y proceso de producción. Un alto valor indica
presencia de insaponificables, jabones e impurezas mecánicas. Los
primeros dejan residuos en el motor porque tienen mayor punto de
evaporación, los jabones dan lugar a cenizas sulfatadas, y las
impurezas mecánicas obstruyen filtros.
Indica dificultades con componentes de bronce, latón o cobre de los
Corrosión a la vehículos. La presencia de ácidos o de compuestos con azufre puede
lámina de deteriorar la lámina de cobre, indicando así la posibilidad de ataque
cobre corrosivo. Altos valores provocarían problemas de corrosión durante el
almacenamiento y en el motor.
Depende exclusivamente del proceso de producción. Restos de
Metanol metanol provocan baja temperatura de inflamación, viscosidad y
densidad, y corrosión en piezas de aluminio y zinc.
Glicerina libre Buen desempeño a bajas temperaturas. La glicerina total comprende
la glicerina libre y la porción de glicerina de aceite o de grasa sin
reaccionar o que ha reaccionado parcialmente.
Niveles bajos de glicerina total aseguran una alta conversión del aceite
o de la grasa hacia sus mono-alquil-ésteres. La cantidad de glicerina
libre depende del proceso de producción.
Glicerina total
Un valor alto indica una mala decantación y lavado del biodiesel, y
provoca incremento en las emisiones de aldehídos y acroleína. Altos
niveles de mono-, di-, y triglicéridos y de glicerina libre pueden causar
depósitos en los inyectores y afectar adversamente la operación en
climas fríos causando taponamiento de filtros.
Índice/nº de
iodo Depende exclusivamente de la materia prima y cuantifica el grado de
instauración. Altos valores indican gran presencia de dobles enlaces
que favorecen los procesos de polimerización e hidrólisis.
Índice de
acidez
 Protege el motor. Se utiliza para determinar el nivel de ácidos grasos
libres o ácidos de proceso que puedan estar presentes en el biodiesel.
Un alto número ácido puede ocasionar aumento en la degradación del
biodiesel, aumentar la formación de depósitos en los sistemas de
Metales inyección y la probabilidad de corrosión.
alcalinos
(Na+K) y del Su presencia depende del proceso de producción. Los metales
Grupo provocan depósitos y catalizan reacciones de polimerización. Valores
II (Ca+Mg) altos de (Na + K) indican restos de catalizador. Valores altos de (Ca +
Mg) indican presencia de jabones insolubles.
Determinar, mediante el tiempo de filtración luego de un tratamiento a
baja temperatura, la adecuada operabilidad en frío del B100 para ser
mezclado con diésel, como mínimo en el punto de nube. Algunas
sustancias que son solubles o aparentemente solubles en biodiesel a
temperatura ambiente, bajo enfriamiento o estadía prolongada a
temperatura ambiente, se separan de la solución. Estas sustancias
Cold soak
pueden causar taponamiento de filtros. Este método de ensayo
filterability
proporciona un medio acelerado para medir la tendencia de estas
sustancias a taponar los filtros. A elevados valores de tiempo de
filtración, mayor probabilidad de taponamiento de filtros y problemas
de operabilidad a bajas temperaturas.

Ídem sedimentos en "Agua y Sedimentos"

Contaminación
Protege el motor. Mide la tendencia a la formación de depósitos de
total
carbón generado por un destilado de petróleo; aunque no tenga una
estricta correlación directa con los depósitos en el motor, esta
propiedad se considera simplemente como una aproximación al
Residuo
respecto.
carbonoso
Depende exclusivamente del proceso de transesterificación. Un valor
elevado indica alto contenido de glicéridos, presencia de metales
(jabones, restos de catalizador) u otras impurezas.

Satisfactoria combustión del combustible. Los materiales que forman

cenizas pueden estar presentes en el biodiesel de 3 formas: (1) sólidos
abrasivos, (2) jabones metálicos solubles, y (3) catalizadores no
removidos. Los sólidos abrasivos y los catalizadores no removidos
pueden afectar los inyectores, filtros y bomba de inyección, generar
desgaste en los pistones y anillos, y depósitos en el motor. Los jabones
metálicos solubles tienen poco efecto en el desgaste pero pueden
 Cenizas afectar los empaques, contribuir al taponamiento de filtros y generar
sulfatadas depósitos en el motor.

Su valor depende de la materia prima y proceso de producción. Se

permite el uso de aditivos para mejorar este parámetro. Un bajo valor
indica aceite de partida degradado, o degradación del biodiesel en el
proceso. Un tiempo inferior al especificado no aseguraría la estabilidad
del biodiesel durante su almacenaje y distribución.

Estabilidad a la
oxidación (a
110ºC)
Éster metílico Depende de la materia prima (contenido de C18:3). Altos valores
–ácido provocan bajo valor de POFF, bajo nº de Cetano y alto índice de iodo.
linolénico
Depende del proceso. Indica reacción incompleta ya que son restos de
Contenido de
aceite que no ha terminado de reaccionar. Altos valores provocan
monoglicérido
depósitos (inyectores, cilindros) y cristalización (tienen mayor punto de
y diglicérido
fusión y baja solubilidad en biodiesel)

Depende del proceso. Un valor elevado indica presencia de aceite o

Contenido de grasa sin reaccionar.
triglicérido Ocasionará elevada viscosidad del biodiesel y depósito en cilindros y
válvulas.

Contenido de Depende de la materia prima (contenido de metil-éster con 4 o más

éster metílico dobles enlaces). Altos valores favorecen los procesos de
poliinsaturado polimerización que provocan depósitos y deterioran el aceite
(4 o más lubricante.
dobles
enlaces)
Prevenir daños en el convertidor catalítico. El fósforo puede deteriorar
los sistemas de control de emisiones y tratamiento de gases de
escape, razón por la cual su contenido debe ser bajo. Contenidos
elevados indicarían un mal blanqueado del aceite de partida y
Fósforo presencia de insaponificables.
 Para asegurar que el biodiesel no ha sido contaminado con materiales
de alto punto de ebullición, como aceites lubricantes gastados.
Temperatura
atm.
equivalente Buen desempeño a bajas temperaturas. Define la temperatura a la cual
(90% R) aparece una nube o nubosidad de cristales en el combustible, bajo
condiciones de ensayo prescritas. Problemas de operación en climas
fríos.
Punto de
Enturbiamiento El valor de POFF es un indicador de los límites de operabilidad. Este
valor depende de la materia prima y del proceso de producción
(impurezas mecánicas).
Punto de
obstrucción
del filtro
en frío (POFF)
3. PROCEDIMIENTO DE LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL

3.1. OBJETIVO

Documentar las prácticas, recomendaciones y criterios que se deben realizar para

la producción de biodiesel a partir de diferentes materias primas (aceite vegetales,
aceite reciclados, grasas animales entre otros).

3.2. EQUIPOS Y MATERIALES

 Balón de reacción de 1000 ml

 Agitador magnético
 Condensador vertical
 Beacker (600 ml, 250 ml y 100 ml)
 Embudo de separación de 1000 ml
 Resistencia eléctrica
 Pera de succión
 Pipeta
 Espátula
 Papel vinipel
 Balanza analítica
 Plancha de agitación y calentamiento
 Equipo de filtración al vacío
 Motor de agitación

3.3. REACTIVOS

 Materia prima (aceites vegetales y animales, así como a las grasas crudas y
aceites usados)
 Ácido sulfúrico
 Metanol
 Hidróxido de Potasio o Hidróxido de Sodio
 Fenolftaleína
 Agua
 Silicona
3.4. PROCEDIMIENTO

Antes de producir el biodiesel se debe determinar a la muestra de aceite la densidad

(ver anexo A1.1), el índice de acidez (ver anexo A1.2), índice de yodo (ver anexo
A1.3) e índice de saponificación (ver anexo A1.4); luego de haber realizado estas
pruebas y conociendo sus resultados se lleva a cabo la esterificación según sea el
caso y la transesterificación.

Para todos los aceites, según sea el índice de acidez:

 Aceite con % AG < 2 : Transesterificación

 Aceite con % AG entre 2 y 8 Neutralizado con glicerina
 Aceite con % AG mayor a 8 Esterificación

En caso de utilizar aceite de cocina usado se le debe realizar:

 Filtración al Vacío.
 Calentamiento para la evaporación de agua.

Si se utiliza aceite de palma crudo se le debe realizar:

 separación de la oleína y la estearina para trabajar con la oleína.
 Filtración al Vacío.

Si el aceite a utilizar es de Jatropha Curcas se debe realizar:

 Calentamiento para la evaporación de agua.

3.4.1. ESTERIFICACIÓN DEL ACEITE

Esta reacción se llevara a cabo en balones de vidrio conectados a condensadores

de reflujo, y sobre planchas de calentamiento y agitación magnética y controlador
de temperatura, transcurrido este tiempo se transvasara la mezcla (aceite, H2SO4 y
metanol) a un embudo de decantación, se dejara reposar por 1 hora y se separara
el aceite esterificado, el cual se utilizara para la producción de biodiesel.

3.4.1.1. CONDICIONES

 Concentración de catalizador: 1-3%

 Temperatura: 60°C.
 Agitación: 380 rpm
  Tiempo de reacción: 2 horas.

3.4.1.2. CÁLCULOS:

 Masa del aceite

 Porcentaje de alcohol en peso
 Porcentaje de catalizador en peso

3.4.1.3. PASOS

 Pesar por separado de acuerdo a los cálculos realizados previamente, la

materia prima, el alcohol y el catalizador.

 Acondicionar el montaje para la esterificación.

 Colocar a calentar en baño de maría en el reactor de vidrio el aceite de

Jatropha a una temperatura de 60°C y agitación de 380 rpm.

 Paralelo al calentamiento del aceite, preparar la mezcla Metanol – ácido

sulfúrico, tenga en cuenta que esta preparación debe hacerse
cuidadosamente y baja la campana de extracción para lo cual usted deberá
colocar en un Beacker el metanol requerido para el experimento, lo ubicara
sobre el motor el motor de agitación y le depositara un agitador magnético y
colocar en una agitación lenta, lentamente con ayuda del pipeteador y la
pipeta deposite gota a gota el ácido sulfúrico hasta terminar, dejando un
intervalo de tiempo corto entre gota y gota, finalizada esta operación apague
el motor de agitación, retire el Beacker y el agitador, tape la mezcla con el
papel vinipel.

 Cuando el agua haya calentado la temperatura de 60 °C, apague lentamente

la mezcla preparada anteriormente, ubique el condensador y a partir de ese
momento empiece a contabilizar el tiempo de reacción hasta cumplir 2 horas.

 Transcurrido el tiempo de reacción apague el sistema, desmonte el reactor y

vierta su contenido en el embudo de separación y déjelo separando durante
1 hora.
  Lavar la vidriería utilizada y colocarla a secar.

 Pasado este tiempo retire el embudo de separación la fase inferior del aceite
esterificado.

 Medir el índice de acidez al aceite esterificado y si está por debajo de 5 mg

KOH/g muestra, proceda a Transesterificar.

3.4.2. TRANSESTERIFICACIÓN DEL ACEITE ESTERIFICADO

El biodiesel se obtendrá usando metanol cuya Relación molar metanol – aceite

estequiométrica es 3:1, sin embargo mediante experimentación se ha llegado a
concluir que la más adecuada es 6:1; y como catalizador se empleara KOH o NaOH
(%p/p en base al aceite). Esta reacción se llevara a cabo en balones de vidrio
conectados a condensadores de reflujo, y sobre planchas de calentamiento con
controlador de temperatura y agitación magnética, a 70 °C por espacio de tiempo
de 1 hora y agitación de 380 r.p.m. Transcurrida la reacción, el producto final se
llevara a un embudo de decantación para separar el biodiesel crudo y la glicerina.
El biodiesel obtenido se lavara con agua caliente hasta obtener un pH neutro en las
aguas de lavado, finalmente, al metiléster se le retirará la humedad residual,
haciéndolo pasar a través de un lecho filtrante de sulfato de manganeso anhidro
(MnSO4), sulfato de potasio o sulfato de sodio, mediante el uso de un sistema de
filtración al vacío, o por calentamiento a 100 °C durante 30 minutos para retirarle la
humedad.

3.4.2.1. CONDICIONES

 Relación de metanol/ aceite esterificado: 6:1

 % Catalizador: Depende de las condiciones que desee manejar
 Temperatura: 70 °C
 Tiempo: 1 hora
 Agitación: 380 r.p.m.

3.4.2.2. CALCULOS

 Masa del aceite esterificado:

 Catalizador:
 Alcohol:
3.4.2.3. PASOS

 Pesar por separado de acuerdo a los cálculos realizados previamente, los

reactivos, alcohol y catalizador (Metanol e hidróxido de potasio (KOH) o
hidróxido de sodio (NaOH)).

 Acondicionar el montaje para la transesterificación.

 Colocar a calentar al baño de maría a una temperatura de 70 °C y agitación

de 380 r.p.m., en el reactor de vidrio el aceite previamente esterificado.

 Paralelo al calentamiento del aceite, preparar la mezcla Metanol – Hidróxido

de potasio para formar el metoxido de potasio, para lo cual usted deberá
colocar en un Beacker el metanol requerido para el experimento, ubicarlo
sobre el motor de agitación, depositar dentro un agitador magnético y
proceder a la agitación lenta. luego con la ayuda de la espátula añada el
catalizador y agite hasta que el KOH se halla disuelto completamente,
finalizada esta operación apague el motor de agitación, retire el Beacker y el
agitador, tape la mezcla con el papel vinipel.

 Cuando el aceite haya alcanzado la temperatura de 70 °C, agregue

lentamente el metoxido preparado anteriormente, ubique el condenador y a
partir de ese momento empezar a contabilizar el tiempo de reacción (1 hora).

 Transcurrido el tiempo de reacción apague el sistema, desmonte el reactor y

vierta su contenido en el embudo de separación y déjelo en reposo durante
3 horas, con el fin de que ocurra la separación de la glicerina (Fase inferior)
del Biodiesel (Fase superior).

 Pasado este tiempo retire del embudo de separación la glicerina del biodiesel
crudo.

 Lavar el biodiesel que quedo en el embudo, adicionando agua caliente a

temperatura de ebullición y agitando suavemente para evitar emulsificación,
deje reposar y espere que se separe el biodiesel del agua de lavado, la cual
contiene trazas de metanol, catalizador y jabones que se hallan formado
durante el proceso de transesterificación.
 Retirar el agua de lavado por la parte inferior del embudo, repita la operación
anterior el número de veces necesarias hasta obtener un pH neutro en las
aguas de lavado.

 Secar el biodiesel lavado por calentamiento a 100 °C durante 30 minutos

para retirarle humedad o por filtración al vacío utilizando como lecho filtrante
sulfato de potasio, sulfato de magnesio o sulfato de sodio anhidro. Después
de la etapa anterior el biodiesel quedara listo para ser caracterizado y
sometido a diferentes pruebas de calidad.

 Lavar la vidriería utilizada, colocarla a secar en la estufa y organizar el puesto

de trabajo.
4. OBTENCIÓN DE BIOETANOL

4.1. ASPECTOS GENERALES

El alcohol etílico o etanol es un producto químico obtenido a partir de la fermentación

de los azúcares que se encuentran en los productos vegetales, tales como cereales,
remolacha, caía de azúcar, sorgo o biomasa. Estos azúcares están combinados en
forma de sacarosa, almidón, hemicelulosa y celulosa. Las plantas crecen gracias al
proceso de fotosíntesis, en el que la luz del sol, el dióxido de carbono de la
atmósfera, el agua y los nutrientes de la tierra forman moléculas orgánicas
complejas como el azúcar, los hidratos de carbono y la celulosa, que se concentra
en la parte fibrosa la planta.

El bioetanol se produce por la fermentación de los azúcares contenidos en la

materia orgánica de las plantas. En este proceso se obtiene el alcohol hidratado,
con un contenido aproximado del 5% de agua, que tras ser deshidratado se puede
utilizar como combustible. El bioetanol mezclado con la gasolina produce un
biocombustible de alto poder energético con características muy similares a la
gasolina pero con una importante reducción de las emisiones contaminantes en los
motores tradicionales de combustión. El etanol se usa en mezclas con la gasolina
en concentraciones del 5 o el 10%, E5 y E10 respectivamente, que no requieren
modificaciones en los motores actuales.
Un obstáculo importante es la legislación europea sobre la volatilidad de las
gasolinas que fija la proporción de etanol en mezclas E5. Concentraciones más
elevadas, autorizadas en Suecia y Estados Unidos, implica que se debe disponer
de un vehículo flexible (FFV), con un depósito, motor y sistema de combustible único
capaz de funcionar con gasolina y etanol, solos o mezclados en cualquier
proporción. La otra alternativa para su uso es en forma de aditivo de la gasolina
como etil-tercbutil eter (ETBE).

El bioetanol se obtiene a partir de la remolacha (u otras plantas ricas en azúcares),

de cereales, de alcohol vínico o de biomasa, mediante un proceso de destilación.
En España la producción industrial emplea principalmente cereal como materia
prima básica, con posibilidad de utilizar los excedentes de la industria remolachera
transformados en jugos azucarados de bajo costo. En general, se utilizan tres
familias de productos para la obtención del alcohol:

 Azucares, procedentes de la caña o la remolacha, por ejemplo.

 Cereales, mediante la fermentación de los azúcares del almidón.
 Biomasa, por la fermentación de los azúcares contenidos en la celulosa y
hemicelulosa.

El esquema general de fabricación del bioetanol (diagrama 1), muestra las

siguientes fases en el proceso.

Dilución:

Es la adición del agua para ajustar la cantidad de azúcar en la mezcla o (en última
instancia) la cantidad de alcohol en el producto. Es necesaria porque la levadura,
usada más adelante en el proceso de fermentación, puede morir debido a una
concentración demasiado grande del alcohol.

Conversión:

La conversión es el proceso de convertir el almidón/celulosa en azúcares

fermentables. Puede ser lograda por el uso de la malta, extractos de enzimas
contenidas en la malta, o por el tratamiento del almidón (o de la celulosa) con el
ácido en un proceso de hidrólisis ácida.

Fermentación:

La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado por las levaduras,

básicamente. De la fermentación alcohólica se obtienen un gran número de
productos, entre ellos el alcohol

Destilación o Deshidratación:
La destilación es la operación de separar, mediante calor, los diferentes
componentes líquidos de una mezcla (etanol/agua). Una forma de destilación,
conocida desde la antigüedad, es la obtención de alcohol aplicando calor a una
mezcla fermentada.

Diagrama 1

5. OBTENCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE AZUCARES FERMENTABLES

5.1. OBJETIVO

Obtener bioetanol a partir de materia prima que contenga una cantidad de azucares
fermentables inmediatamente disponibles. Utilizando Saccharomyces cerevisiae
como microorganismo capaz de fermentar los azucares.

5.2. EQUIPOS Y MATERIALES

 Biorreactor
 Plancha magnética
 Vórtex
 Refractómetro
 Peachímetro
 Autoclave
 Espectrofotómetro
 Balanza analítica
 Micropipetas
 Termómetro
 Tubos de ensayo
 Baño María
 Erlenmeyer
  Gradilla
 Vasos de precipitado
 Balones aforados
 Espátulas
 Pipetas

5.3. REACTIVOS
 Agua destilada
 HCl 0,1 N (Ácido clorhídrico)
 NaOH 0,1 N (Hidróxido de sodio)
 KH2PO4. (Fosfato de potasio monobásico)
 Extracto de levadura.
 MgSO4.7H2O (Sulfato de magnesio heptahidratado)
 DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico)
 K2Cr2O7 (97%) (Dicromato de potasio)
 K2CO3 (98%) (Carbonato de potasio)
 H2SO4 (96%) (Ácido sulfúrico).
 C6H12O6 (glucosa anhidra)
 Alcohol etílico (99%)

5.4. PROCEDIMIENTO

 Extraer jugo de la materia prima seleccionada (caña de azúcar, remolacha,

melaza, etc.)

 Clarificar el jugo de caña mediante una técnica de las siguientes técnicas: 1)

adición de cal y calor, 2) cal, calor y polímero natural o 3) cal, calor y polímero
artificial.

 Filtrar jugo clarificado con papel filtro en una bomba a vacío.

 Tomar muestra para determinar grados brix (por refractometría), si los grados
brix superan los 20°brix, se ajusta con agua destilada hasta alcanzar los brix
requeridos (los 20°Brix).

 Se ajusta pH a 4.0 con NaOH 0,1 N o HCl 0,1 N según sea el caso.

 Apartar de la muestra 50 ml y esterilizar ambas muestras en una autoclave

a 121 °C por 15 minutos y se dejar en reposo.

 Pesar 2 g/L de inoculo (Saccharomyces cerevisiae).

  Inocular la levadura (Saccharomyces cerevisiae) anteriormente pesada.
Para ello se debe pesar con anticipación los siguientes compuestos:
- 1.1 g/L de KH2PO4.
- 5 g/L de extracto de levadura.
- 0.125 g/L de MgSO4.7H2O.

 Luego de haber pesado mezclar esos compuestos con la cantidad de

levadura requerida y llevarla a un Erlenmeyer, adicionarle 25 ml de la muestra
de 50 ml esterilizada, mezclar bien hasta disolver por completo, llevar a un
balón de 50 ml y aforar hasta este volumen. Después de haber realizado
este paso por completo llevar el inoculo a una plancha magnética a 120 rpm
y 38°C durante 12 horas, con el objetivo de activar la levadura.

 En el biorreactor previamente lavado y esterilizado químicamente, mezclar

los 50 ml con el resto de la muestra a fermentar y agitar.

 Tomar 4 ml de muestra inicial llevarla a refrigeración

 Ajustar la velocidad del biorreactor a 200 rpm y la temperatura a 38°C durante

48 horas

 Tomar 4 ml de muestra cada 4 horas llevarla a refrigeración. Rotular para

identificar las muestras.

 Medir pH y ajustarlo (cada 4 horas).

 Cumplidas las 48 horas realizar el desmontaje del biorreactor, tomar la

muestra y destilarla para determinar porcentaje de alcohol probable (ver
anexo A2.3)

 Tomar las muestras y determinarle azucares reductores (ver anexo A2.1), y

determinarle la concentración de alcohol (ver anexo A2.2), determinación
de la concentración de alcohol y otros sustratos por cromatografía (ver anexo
A2.4)

5.5. CALCULOS
Calcular
 El porcentaje de alcohol
 La concentración de alcohol de cada muestra
 Los azucares reductores de cada muestra
 Velocidad de consumo de producto
 Velocidad de formación de sustrato
 Conversión de sustrato
 Rendimiento en producto
 Productividad

6. OBTENCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE ALMIDONES (ALMIDON DE

YUCA).

6.1. OBJETIVO

Obtener bioetanol a partir de almidón de yuca. Utilizando hidrolisis enzimática y

fermentación simultánea con Saccharomyces cerevisiae como microorganismo
capaz de fermentar los azucares.

6.2. EQUIPOS Y MATERIALES

 Biorreactor
 Plancha magnética
 Vórtex
 Refractómetro
 Peachímetro
 Autoclave
 Espectrofotómetro
 Balanza analítica
 Micropipetas
 Termómetro
 Tubos de ensayo
 Baño María
 Erlenmeyer
 Gradilla
 Vasos de precipitado
 Balones aforados
 Espátulas
 Pipetas

6.3. REACTIVOS
 Agua destilada
 HCL 0,1 N (Ácido clorhídrico)
 NaOH 0,1 N (Hidróxido de sodio)
 KH2PO4. (Fosfato de potasio monobásico)
  Extracto de levadura.
 MgSO4.7H2O (Sulfato de magnesio heptahidratado)
 DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico)
 K2Cr2O7 (97%) (Dicromato de potasio)
 K2CO3 (98%) (Carbonato de potasio)
 H2SO4 (96%) (Ácido sulfúrico).
 Peptona
 C6H12O6 (glucosa anhidra)
 α –amilasa
 β-glucoamilasa
 Alcohol etílico (99%)
 Medio YM

6.4. PROCEDIMIENTO

6.4.1. Activación de la levadura

Pesar 0,75 g/L de inoculo (Saccharomyces cerevisiae).

Inocular la levadura (Saccharomyces cerevisiae) anteriormente pesada, en 100 ml

de medio YM (contiene por litro 3 g de extracto de levadura, 3 g de extracto de malta,
5 g de peptona y 10 g de glucosa monohidratada) a 37°C, 150 rpm y un pH de 5.3
por un tiempo de 12 horas.

6.4.2. Procedimiento general

 Buscar u obtener almidón de yuca en las mejores condiciones.

 Llevar la harina de yuca a una estufa a 100°C +/- 0.1°C por tres horas con
el objeto de reducir la carga microbiana y evitar la contaminación del
medio.

 Pesar 250 g almidón de yuca, diluirlo con 500 ml agua destilada. Y aforar
hasta 1000 ml en un balón de 1 L

 Ajustar pH a 5.3 con NaOH 0,1 N o HCl 0,1 N según sea el caso

 Tomar una muestra inicial.

 En el biorreactor previamente lavado y esterilizado químicamente,
mezclar la solución de almidón de yuca con 2 g/L de enzima α –amilasa,
 a una temperatura de 64°C y 200 rpm, después de 10 minutos se le
agregan 2g/L de la enzima β-glucoamilasa.

 Al pasar 1 hora se toman 4 ml de muestra y se adiciona la levadura

activada con anticipación y se ajusta la temperatura a 37°C y a unas 200
rpm por 48 horas

 Tomar 4 ml de muestra llevarla a refrigeración y ajustar pH, no olvides

rotular para identificar las muestras.

 Cumplidas las 48 horas realizar el desmontaje del biorreactor, tomar la

muestra y destilarla para determinar porcentaje de alcohol probable (ver
anexo A2.3)

 Tomar las muestras y determinarle azucares reductores (ver anexo

A2.1), y determinarle la concentración de alcohol (ver anexo A2.2).

6.5. CALCULOS

Calcular:

 El porcentaje de alcohol
 La concentración de alcohol de cada muestra
 Los azucares reductores de cada muestra
 Velocidad de consumo de producto
 Velocidad de formación de sustrato
 Conversión de sustrato
 Rendimiento en producto
 Productividad

7. OBTENCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE MATERIAL

LIGNOCELULOSICO (BAGAZO DE CAÑA).

Bagazo de caña como combustible

Se relacionan las características más importantes del bagazo como fuente

alternativa de energía, utilizada fundamentalmente en la industria azucarera
mostrando un análisis de cómo calcular el valor calórico del mismo además de las
tablas y diagramas con los resultados obtenidos.

Bagazo

El bagazo, fibra residual de la caña de azúcar después de la molida, es un

combustible natural para producir vapor en las fábricas azucareras. Es de tamaño
uniforme con longitud promedio de 5-7,5 cm y no excede los dos centímetros de
ancho; el rango de densidad varía entre 120-160 kg/m3. Este consiste de
fibra, agua, sólidos solubles y cenizas; pero es importante conocer su
composición química, que afecta su uso como combustible, y el método por el cual
puede ser manipulado y quemado técnica y económicamente.

El bagazo es el residuo lignocelulósico fibroso remanente de los tallos de caña,

obtenido a la salida del último molino del tándem azucarero, constituyendo un
conjunto heterogéneo de partículas de diferentes tamaños que oscilan entre 1 y 25
mm, presentando una fracción promedio de aproximadamente 20 mm. Desde el
punto de vista físico, el bagazo integral se compone de 45% de fibra, 2-3% de
sólidos insolubles, 2-3% de sólidos solubles y 50% de humedad, mientras que
desde el punto de vista químico, se compone de 46,6% de celulosa, 25,2% de
hemicelulosas (pentosanos) y 20,7% de lignina. Las hemicelulosas abarcan un
conjunto de polisacáridos diferentes, cuya composición tiene como características
comunes: solubilidad en solventes, reactividad frente a los ácidos y descomposición
en azúcares y furfural. Estas propiedades las diferencian, analíticamente, del resto
de los componentes químicos del bagazo. La lignina, tercer componente en
importancia cuantitativa del bagazo, entre 20 y 22%, representa un conjunto de
polímeros amorfos, reticulares, de altos pesos moleculares y naturaleza
eminentemente fenólica

Contenido de Fibra

El contenido de fibra en la caña ejerce una marcada influencia en el balance entre

la energía disponible y las necesidades del proceso. Un bajo contenido de fibra en
la caña procesada no solo significa menos combustible disponible, sino también a
causa del aumento de proporción del jugo, una mayor tarea de evaporación y por
tanto una mayor demanda de vapor.
Rendimiento y balance energético:

De una tonelada de bagazo se producen 90 galones de etanol, que le permiten a un

automóvil recorrer más de 3.200 kilómetros con una mezcla de 85% etanol y 15%
gasolina.

Combustión del bagazo

Expresado en Kcal/Kg

7.1. OBJETIVO

Obtener bioetanol a partir de bagazo de caña utilizando la estrategia de

sacarificación y fermentación simultánea (SSF) con Saccharomyces cerevisiae
variedad Ethanol red como microorganismo fermentador de azucares.

7.2. EQUIPOS Y MATERIALES

 Biorreactor
 Plancha magnética
 Vórtex
 Refractómetro
 Peachímetro
 Autoclave
 Espectrofotómetro
 Balanza analítica
  Micropipetas
 Termómetro
 Tubos de ensayo
 Baño María
 Erlenmeyer
 Gradilla
 Vasos de precipitado
 Balones aforados
 Espátulas
 Pipetas

7.3. REACTIVOS

 Agua destilada
 HCL 0,1 N (Ácido clorhídrico)
 NaOH 0,1 N (Hidróxido de sodio)
 KH2PO4. (Fosfato de potasio monobásico)
 Extracto de levadura.
 MgSO4.7H2O (Sulfato de magnesio heptahidratado)
 DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico)
 K2Cr2O7 (97%) (Dicromato de potasio)
 K2CO3 (98%) (Carbonato de potasio)
 H2SO4 (96%) (Ácido sulfúrico).
 Peptona
 C6H12O6 (glucosa anhidra)
 Alcohol etílico (99%)
 Medio YM
 Solución de citrato de sodio al 0.1M, pH=4.0

7.4. PROCEDIMIENTO

7.4.1. Tratamiento del material lignocelulosico

El bagazo de caña pasó por una disminución de tamaño manual para favorecer el
secado en la estufa a 65 °C por 24 horas con el fin de eliminar la mayor cantidad de
humedad. Posteriormente, el material se triturara en un molino de martillos, hasta
un tamaño <1,2 mm.

7.4.2. Determinación del tamaño de partículas

Se utilizó el tamizado para estimar el diámetro medio de partículas a utilizar.

7.4.3. Pretratamiento químico del bagazo de caña

Se emplea el método de hidrolisis alcalina con hidróxido de sodio (NaOH) al 1%,

empleando una concentración de sustrato 5% (p/v). Este pretratamiento se lleva a
cabo en Baño María a 90 °C, en un tiempo de 15 minutos a 100 rpm.

Terminado el pretratamiento, el material pretratado se filtra. La torta en el filtro será

lavada y secada en estufa a 65 °C durante 12 horas.

8. Anexo A1
 (Anexo A1.1)
DENSIDAD

OBJETIVO

Determinar la densidad del aceite por medio del picnómetro.

ALCANCE

Esta técnica es aplicable al agua y a todos los aceites vegetales y animales, así
como a las grasas crudas y aceites usados. Además es apta para la determinación
de la densidad de muestras de biodiesel de Jatropha, Palma, de aceite usado, entre
otros.

GENERALIDADES

Esta se utiliza para determinar la masa presente en la unidad de volumen. Para los
ácidos grasos y glicéridos la densidad aumenta al disminuir su peso molecular y al
amentar su grado de instauración y es la relación de la masa de una grasa en aire
con su volumen a una temperatura dada.

PRINCIPIO

Determinar la masa presente en la unidad de volumen.

MATERIALES

 Picnómetro.
 Balanza.
 Termómetro.

El procedimiento es el siguiente:
  Pesar el picnómetro limpio y seco (a una temperatura dada) = W 1.
 Pesar el picnómetro con agua a una temperatura de 25°C = W 2.
 Pesar el picnómetro con la muestra de aceite a una temperatura de 25°C =
W3

La densidad se determina con la siguiente ecuación:

𝑊3 − 𝑊1
𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 º𝑇 𝑑𝑎𝑑𝑎 =
𝑊2 − 𝑊1

RECOMENDACIONES

 Para una grasa, se debe hacer a 40 °C o 60 °C según sea el método AOAC

o AOCS.
 Control estricto de la temperatura.
 El picnómetro debe estar complemente seco.
 (Anexo A1.2)
ÍNDICE DE ACIDEZ

OBJETIVO

Realizar los procedimientos a seguir para la determinación del índice de acidez en

aceites, grasas crudas y refinadas.

ALCANCE

Esta técnica es aplicable a todos los aceites vegetales y animales, así como a las
grasas crudas y aceites usados. Además es apta para la determinación del índice
de acidez de muestras de biodiesel de Jatropha, Palma, de aceite usado, entre
otros.

GENERALIDADES

El índice de acidez se define como los miligramos de NaOH o KOH necesarios para
neutralizar los ácidos grasos libres presentes en 1 gramo de aceite o grasa, y
constituye una medida del grado de hidrólisis de una grasa. La acidez libre es una
medida del grado de descomposición lipolítica de los glicéridos pero su exceso, no
siempre coincide con la rancidez.

El método se basa en la neutralización de los ácidos grasos libres presentes en el

aceite o grasa con solución etanólica de hidróxido de potasio en presencia de
fenolftaleína como indicador. El índice de acidez se expresa en mg de Hidróxido de
Potasio necesarios para neutralizar un gramo de grasa. También puede expresarse
en porcentaje de Ácido Oleico.

PRINCIPIO
Titulación, por solución alcalina, de la acidez libre de la materia grasa disuelta en
una mezcla alcohol y éter, utilizando fenolftaleína como indicador.

EQUIPOS Y MATERIALES

Espátula, Beacker, balanza, bureta, agitador magnético, soporte universal.

REACTIVOS

KOH, NaOH, fenolftaleína, alcohol etílico.

PROCEDIMIENTO

 En un Beacker pesar entre 1 - 5 g de la muestra de aceite, simultáneamente

medir en un Beacker 20 ml de alcohol etílico.

 Mezclar la muestra de aceite con el alcohol y con la ayuda del agitador

magnético homogenizar totalmente la muestra.

 Adicionar de 2 a 3 gotas de fenolftaleína a la muestra y con la ayuda del

agitador magnético homogenizar totalmente la muestra.

 Titular con KOH o NaOH 0,1N hasta que la fenolftaleína alcance un color de
débilmente rosa que persista durante 30 segundos.

 Anota el volumen de KOH gastados y aplica la fórmula del índice de acidez.

𝑷𝑴(𝑲𝑶𝑯 𝒐 𝑵𝒂𝑶𝑯) × [𝑲𝑶𝑯 𝒐 𝑵𝒂𝑶𝑯] × 𝑽𝑮𝒂𝒔𝒕𝒂𝒅𝒐

𝑰𝑨 =
𝑾𝑴𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂

𝑃𝑀 = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑀𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟
[𝐾𝑂𝐻 𝑜 𝑁𝑎𝑂𝐻] = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑏𝑎𝑠𝑒
𝑊𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝑉𝐺𝑎𝑠𝑡𝑎𝑑𝑜 = 𝑉𝑜𝑙ú𝑚𝑒𝑛 𝑔𝑎𝑠𝑡𝑎𝑑𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑡𝑖𝑡𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛

RECOMENDACIONES

 Pesar estrictamente lo estipulado en la guía descrita anteriormente.

 Conocer la concentración del alcohol y las bases a utilizar.
  Realizar la muestra por duplicado y sacar promedio de los resultados.
 Al momento de manipular el alcohol tapar herméticamente el Beacker para
que no se pierda la concentración.

(Anexo A1.3)
ÍNDICE DE YODO

OBJETIVO

Determinar y expresar el índice de yodo de la muestra de aceites o grasas como g

de yodo absorbidos por cada 100 g de grasa.

ALCANCE

Esta técnica es aplicable a todos los aceites vegetales y animales, así como a las
grasas crudas y aceites usados.

PRINCIPIO

El principio del IY es la acción del Monocloruro de yodo sobre la materia grasa

disuelta en cloroformo, s e hace por medio del método Wijs. Los materiales y
reactivos necesarios son los siguientes:

EQUIPOS Y MATERIALES

 Balanza analítica.
 Bureta.
 Frasco de yodo.
 Cronometro.
 Beacker.

REACTIVOS

 Almidón a 1%.
 Tiosulfato de sodio 0.1N.
  Yoduro de potasio al 15%.
 Cloroformo g.r.
 Reactivo Wijs.

PROCEDIMIENTO

 Pesar entre 0,1 – 0,3 g de la muestra si su índice de yodo es mayor a 100;

entre 0,3 – 0,5 g si el índice de yodo esta entre 60 y 100 y si es menor de 60,
pesar entre 1 – 10 g.
 Pasarla cuantitativamente al frasco de tapa esmerilada o frasco de yodo con
20 ml de cloroformo.
 Adicionar 25 ml del reactivo de Wijs desde una bureta midiendo el tiempo de
escurrimiento.
 Tapar el frasco, agitar 1 minuto y agregar gotas de yoduro de potasio
alrededor de la tapa para formar un buen cierre y dejar en reposo en la
oscuridad por 1 hora.
 Pasada la hora, a 20ºC agregar 20 ml de solución acuosa de yoduro de
potasio al 15% y 100 ml de agua recientemente hervida y fría, arrastrando
con ella el yodo del tapón.
 Titular el yodo libre con Tiosulfato de sodio 0.1N con agitación constante,
hasta la casi total decoloración de la disolución, sin pasar del color amarillo
claro, cerrar la llave de la bureta y añadir de 1ml de la solución de almidón al
1% y continuar la titulación hasta que el color amarillo desaparezca.
 Por último, tapar el frasco y agitar fuertemente para extraer las trazas de yodo
que puedan permanecer en el cloroformo.
 Simultáneamente titular el blanco, teniendo en cuenta que el tiempo de
escurrimiento del reactivo de Wijs sea el mismo que la muestra.

(𝑽𝑩 − 𝑽𝑴 ) ∗ 𝑵 ∗ 𝟏𝟐. 𝟔𝟕
í𝒏𝒅𝒊𝒄𝒆 𝒅𝒆 𝒀𝒐𝒅𝒐 =
𝒑𝒆𝒔𝒐 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂

RECOMENDACIONES

 Es importante que el tiempo de escurrimiento del reactivo Wijs desde la

bureta sea el mismo en el blanco y en la muestra.
 Tener precisión en el tiempo en que la muestra se deja en reposo y en la
oscuridad.
 Conocer las concentraciones de los reactivos.
 (Anexo A1.4)
INDICE DE SAPONIFICACION

OBJETIVO

Determinar y expresar el índice de saponificación de la muestra de aceites o grasas

como mg de hidróxido de potasio que se requieren para saponificar 1g de grasa.

ALCANCE

Esta técnica es aplicable a todos los aceites vegetales y animales, así como a las
grasas crudas y aceites usados.
Si hay presencia de aceite mineral, los resultados obtenidos con este método no se
pueden interpretar a menos que se determinen por separado los ácidos minerales.

PRINCIPIO
El método de determinación descrito, consiste en saponificar completamente una
cantidad, exactamente pesada, de la muestra por ensayar, mediante un exceso de
solución alcohólica de hidróxido de potasio, valorando luego dicho exceso de
solución alcalina con ácido clorhídrico 0,5N.

EQUIPOS Y MATERIALES

 Erlenmeyer
 condensador de reflujo
 dispositivo calentador (plancha magnética)
 bureta
 pipeta

REACTIVOS
  Hidróxido de potasio, c(KOH) » 0,5 mol/ l solución en 95 % (V/V) etanol.
 Ácido clorhídrico. Solución volumétrica estándar, c(HCl) = 0,5 mol/l.
 Fenolftaleína 10 g/l solución en 95 % (V/V) etanol.
 Azul de metileno, 20 g/l solución en 95 % (V/V) etanol.

PROCEDIMIENTO

 Se pesan 2 g de la muestra de ensayo, con aproximación de 5 mg, en un

matraz cónico.

 Se añaden a la porción de ensayo, con una pipeta, 25,0 ml de la solución

etanólica de hidróxido de potasio y algunas ayudas de ebullición. Se conecta
el condensador de reflujo al matraz o erlenmeyer, se coloca éste sobre el
dispositivo de calentamiento y se deja ebullir ligeramente, agitando
esporádicamente, por 1 h o por 2 h, en el caso de aceites y grasas que
tengan un punto de fusión alto y que sean difíciles de saponificar.

 Se añaden a la solución caliente de 0,5 ml a 1 ml de solución fenolftaleína y

se titula con la solución volumétrica de ácido clorhídrico estándar hasta que
desaparezca el color rosa indicador. Si la solución está muy coloreada, se
usan de 0,5 ml a 1 ml de solución de azul de metileno.

 Se realiza un ensayo en blanco siguiendo el procedimiento especificado

anteriormente con 25,0 ml de solución etanólica de hidróxido de potasio pero
omitiendo la porción de ensayo.

El índice de saponificación Is se calcula así:

Is = (V0 – V1) x c x 56,1 / m

V0 = es el volumen, en mililitros, de la solución volumétrica normalizada de ácido

clorhídrico que se usa para el ensayo en blanco.

V1 = es el volumen, en mililitros, de la solución volumétrica estándar de ácido

clorhídrico que se usa para la determinación.

c = es la concentración exacta, en moles por litro, de la solución volumétrica

estándar de ácido clorhídrico.
m = es la masa, en gramos, de la porción de ensayo.

9. Anexo A2
 ANEXO (A2.1)

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR METODO-DNS (ACIDO

3,5-DINITROSALICÍLICO)

1. OBJETIVOS

Aplicar una técnica sencilla, rápida y eficaz para determinar azúcares reductores
en caldos y medios de fermentación que permitan conocer los rendimientos en
sustrato y/o productos.

2. ALCANCE

Esta técnica es aplicable a todos los procedimientos de sistemas de cultivos de

medios líquidos y sólidos cuya molécula de sustrato sean azúcares reductores como
glucosa, xilosa, entre otros.

3. CONTENIDO

3.1. GENERALIDADES

 Es un método conveniente y relativamente barato, aunque de baja

especificidad
 Altas concentraciones de proteínas interfieren en la determinación de los
azúcares reductores
 La curva de calibración que se hace, es específica para cada volumen de
reactivo de DNS preparado, al agotarse este debe hacerse una nueva curva
de calibración
 Los tubos deben sumergirse en el agua en ebullición y baño de hielo en un
solo grupo a fin de garantizar homogeneidad en la reacción.

3.2. DESCRIPCIÓN

3.2.1. Principio del método

Este método nos ayuda a determinar la presencia de grupos carbonilos libres
(C=O), en los también llamados azúcares reductores. Esto involucra la oxidación
del aldehído presente en el grupo funcional. Simultáneamente, en presencia de
calor el ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) se reduce a ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico
bajo las condiciones alcalinas, desarrollándose un color amarillo café:

Oxidación
Grupo aldehído grupo carboxilo

Reducción
DNS ácido 3-amino,5-nitrosalicílico

Se adiciona sulfito (no necesario para la reacción del cambio de color) en el reactivo
para absorber el oxígeno disuelto, ya que éste puede interferir con la oxidación de
la glucosa.

En la reacción se muestra que un mol de azúcar reaccionará con un mol de DNS.

Sin embargo, no cabe duda que se dan muchas otras reacciones, y la
estequiometria de la reacción es mucho más complicada que lo previamente
descrito. El tipo de reacción lateral depende de la naturaleza exacta del azúcar
reductor. Diferentes azúcares reductores arrojan distintas intensidades de color;
así, se hace necesario calibrar para cada azúcar. Además de la oxidación de los
grupos carbonilos en el azúcar, otras reacciones laterales como la descomposición
de azúcar también compiten para la disponibilidad del ácido 3,5-dinitrosalicílico.
Como consecuencia, la carboxymetil celulosa puede afectar la curva de calibración
alterando la intensidad del color desarrollado.

Cuando los efectos de compuestos extraños no son conocidos, uno puede incluir
efectivamente el llamado control interno para el desarrollo del color en muestras
desconocidas; entonces, una cantidad conocida de azúcar se adiciona a esta
muestra. El aumento en la absorbancia en el segundo desarrollo de color es
equivalente a la cantidad incrementada de azúcar.

3.2.2. Equipos

 Balanza analítica
 Espátula
 Espectrofotómetro
  Estufa con agitación
 Vórtex
 Micropipeta.

3.2.3. Reactivos

 Solución del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) al 1%. (Ver Anexo (A2.1.1)).

Debe ser almacenado en frasco oscuro y a 4ºC, agua destilada.
 Solución estándar de glucosa de 0.4g/L

3.2.4. Materiales
 Matraz aforado de 100 ml
 11 tubos de ensayo tapa rosca de 10 ml
 Papel aluminio
 Frasco color ámbar
 Beacker de 1000 ml
 Puntas plásticas
 Pipetas de 5, 1 y 10 ml.

3.3. PROCEDIMIENTO

 Preparar una solución de glucosa de 0.4 g/L

 Establecer una escala estándar de 0 a 0.4g/L a partir de la solución de

glucosa previamente preparada.

 Preparar 0; 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 y 1.0 ml de solución
estándar y completar hasta 1 ml con agua destilada.

 Adicionar a cada ml de muestra y 1 ml del reactivo de DNS y agitar en un

vórtex.

 Colocar los tubos en baño de agua a 90 ºC por 5 min. Luego enfriar a una
temperatura 20 - 30°C durante 3 min.

 Agitar en el vórtex y realizar la lectura a 540 nm en espectrofotómetro para

determinar la absorbancia.

Llene la siguiente tabla:

 Tubo ml. de s/n ml. de agua Concentración Absorbancia
estándar destilada final (g/L) (540 nm)
glucosa
1 0.0 1.0 0.00
2 0.1 0.9 0.04
3 0.2 0.8 0.08
4 0.3 0.7 0.12
5 0.4 0.6 0.16
6 0.5 0.5 0.20
7 0.6 0.4 0.24
8 0.7 0.3 0.28
9 0.8 0.2 0.32
10 0.9 0.1 0.36
11 1.0 0.0 0.40

Grafique la curva de calibración (Concentración vs Absorbancia) para la

determinación de azúcares reductores con el método del DNS, utilizando la
ecuación obtenida.

3.3.1. Determinación de azucares reductores en muestra problema.

En tubos de ensayo de 10 ml se adicionan 1 ml de muestra y 1 ml del reactivo de

DNS y se agita en un vórtex. Los tubos se colocan en baño de agua a 90 ºC por 5
min. Luego se enfría a una temperatura 20 -30°C durante 3 min. Se agita y se
realiza la lectura a 540 nm en espectrofotómetro para determinar la absorbancia.

Tomar los datos de absorbancia y llevarlos a la ecuación de la curva de calibración

para determinar la concentración de azucares reductores en las muestras
problemas.

3.4. ADVERTENCIA

Usar siempre guantes para leer las muestras en el equipo y por lo que el reactivo
DNS es altamente tóxico, cancerígeno y abortivo. Mucho cuidado al manipularlo.
 Anexo (A2.1.1)

Solución de glucosa anhidra (0.4g/L): disolver 0.04 g de glucosa y aforar hasta

100 ml con agua destilada.

Reactivo ácido 3,5-dinitrosalicílico: se elabora a partir de las siguientes

soluciones tal como se describe a continuación: Solución de NaOH 2N (80 g de
NaOH y aforar hasta 1L agua destilada), solución de 3,5-DNS (10 g de ácido
dinitrosalicílico, hasta 200 ml de NaOH 2N), solución de tartrato sódico potásico
(402,7 g de Tartrato NaK-4H2O, hasta 500 ml de agua destilada). El reactivo se
prepara mezclando 200 ml de la solución de 3,5-DNS, 500 ml de la solución de
Tartrato de NaK, y completar con agua destilada hasta 1000 ml.
 ANEXO (A2.2)

CUANTIFICACIÓN DE ETANOL POR DICROMATO DE POTASIO

OBJETIVO

Aplicar una técnica eficaz para la determinación de la concentración de etanol en

muestra.

ALCANCE

Esta técnica determina semi-cuantitativa la concentración de etanol presente en una

muestra.

PRINCIPIO: El etanol obtenido por destilación se oxida cuantitativamente a ácido

acético por un exceso de dicromato de potasio estandarizado.

3C2H5OH + 2Cr2O7 = + 16H+ 3CH3COOH + 4Cr++++ + 11H2O

El exceso de K2Cr207 se determina con solución de sulfato ferroso y amonio

estandarizado. Los tiempos y temperatura de incubación para oxidar el etanol a
ácido acético son críticos. Debe tenerse especial precaución con el material de
vidrio, exactitud de las mediciones, calibración de pipetas, etc. Debe realizarse un
blanco.

EQUIPOS Y MATERIALES:

 Pipeta
 Centrifuga
 Beacker
 Vórtex
 Termostatado
 Espectrofotómetro
 Vaso de precipitado
 Balón aforado de 1000ml.

REACTIVOS:

 Dicromato de potasio
 Carbonato de potasio
 Ácido sulfúrico.

PROCEDIMIENTO:

La técnica de Dicromato consiste en:

 tomar 2 ml del medio de crecimiento de levaduras (centrifugado a 3200rpm
durante 30 minutos)
 lo mezclamos con 2 ml de una solución oxidante de dicromato de potasio (ver
anexo A2.2.1)
 esta solución se mezcla (homogeniza) en vórtex a 1500 rpm y se calienta en
baño termostatado de 80-85 °C, por 30 min.
 Luego Se enfría a temperatura ambiente y se lee la absorbancia a 440 nm y se
realiza una curva de calibración (Anexo A.2.2.2), reportando el valor de etanol en
g/L.

Anexo (A2.2.1)

• SOLUCIÓN OXIDANTE

Se mezclan 4.165 g de dicromato de potasio (97%) y 250 ml de ácido sulfúrico (96%)

en un vaso de precipitado de 600mL. Luego esta solución se para a un balón
volumétrico aforado de 1000 ml y se completa hasta el aforo con agua destilada, y
se deja reaccionar por 24 horas.

• SOLUCIÓN DE CARBONATO DE POTASIO

Se mezclan de 20 g de carbonato de potasio (98%) en un vaso de precipitado de

250mL hasta que se disuelva. Luego esta solución se transfiere a un balón
volumétrico de 100mL y se completa con agua destilada hasta el aforo.

Después de tener las 2 soluciones anteriores preparadas se realiza la solución final:

• SOLUCIÓN FINAL

Se toman 4 ml de la solución oxidante en un tubo de ensayo y luego se adiciona,

gota a gota, 2 ml de solución de carbonato de potasio hasta finalizar el burbujeo.

Anexo (A2.2.2)

PROCEDIMIENTO PARA LA REALIZACIÓN DE LA CURVA PATRÓN

Se prepararon diferentes concentraciones de etanol en agua destilada (2,5, 5,0, 10,

15, 20, 30), (% P/V), como se muestra en la tabla siguiente. Se mezclan 2 ml de la
solución final con 2 ml de los diferentes patrones en un tubo de ensayo
homogeneizándose en vórtex a 1500 rpm durante 10 s. Seguidamente se realiza un
calentamiento en baño termostatado de 80-85 °C, por 30 min. Se enfría a
 temperatura ambiente y se lee la absorbancia a una longitud de onda de 440 nm,
ajustando la absorbancia con el blanco de prueba

Concentración Etanol Agua destilada (ml)

g/L (ml)
Blanco ---- ----
2.5 0.05 19.95
5 0.1 19.9
10 0.2 19.8
15 0.3 19.7
20 0.4 19.6
30 0.5 19.5
 El blanco se prepara con ácido sulfúrico con una concentración de 6N.

 DETERMINACIÓN DE ETANOL EN CADA MUESTRA

Se tomaron 10mLde la muestra de medio de cultivo en un tubo de ensayo y se

centrifuga a 3500 rpm durante 20 min. Se trabaja con el sobrenadante de donde se
toman 2mL en un tubo de ensayo y se mezclan con 2mL de la solución final en un
vórtex por 10 segundos.

Estos tubos son puestos en un baño termostatado de 80 a 85ºC por 30 minutos. Al

cabo de esto se dejan enfriar a temperatura ambiente y se lee la absorbancia a una
longitud de onda de 440 nm ajustando la absorbancia con el blanco de prueba. Los
datos obtenidos se multiplican por el factor que corresponda a cada medio que se
presentan a continuación debajo de cada gráfica, para hallar la concentración en
g/L.
 ANEXO (A2.3)

CUANTIFICACIÓN DEL GRADO DE ALCOHOL PROBABLE POR

REFRACTÓMETRIA

OBJETIVO

Aplicar una técnica alternativa para la determinación de la concentración de etanol

probable en muestra.

ALCANCE

Esta técnica determina el grado de alcohol (etanol), probable presente en

determinada muestra.

PRINCIPIO

La refracción se basa en la modificación de la trayectoria de un rayo luminoso al

atravesar una superficie que limita dos medios diferentes. Se puede demostrar que
el rayo de luz incidente AO, la normal a la superficie y el rayo de luz refractado OB
están en el mismo plano (Fig.1) y que la relación entre el seno del ángulo de
incidencia i 1 y el del ángulo de refracción i 2 siguen la ley de SNELLIUS.

Cuanto mayor sea la concentración de los azúcares de un mosto, más denso será
éste y menor la velocidad con que la luz lo atraviese, provocando un cambio en el
(n). Así se
puede
establecer una relación entre la concentración de azúcar y el (n)

EQUIPOS:

 Refractómetro FIGURA 2
 Pipeta

PROCEDIMIENTO

 Se debe filtrar el mosto a través de papel de filtro, eliminando las primeras gotas
del filtrado.
 Unas gotas del filtrado, es mantenido a una temperatura próxima a los 20 °C.
 se colocan mediante la pipeta en el prisma inferior del refractómetro procurando
que al estar los prismas en estrecho contacto la superficie de vidrio quede cubierta
uniformemente.

CÁLCULO

Como el ° Brix y la n sufren variaciones con los cambios de temperatura, siempre

que sea posible las determinaciones deben hacerse a 20 °C, En caso contrario es
necesario corregir el valor de la lectura del ° Brix aparente del refractómetro según
la fórmula siguiente:
° Brix20 °C = ° Brix t + c
Para conocer el grado alcohólico probable del mosto analizado es necesario
Interpolar el resultado de la lectura del °Brix en la siguiente fórmula (válida en el
intervalo de 15-25 °Brix):
Grado alcohólico probable, % vol = (0,6757 x ° Brix)– 2,0839

Factores de corrección (c) del °brix

en función de la temperatura
Temperatura c
17°c -0,2
18°c -0,1
19°c -0,1
20°c 0,0
21°c 0,1
22°c 0,1
23°c 0,2
24°c 0,2
25°c 0,3
(Anexo A2.4)

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ALCOHOL Y OTROS

SUSTRATOS POR CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION
(HPLC)

OBJETIVO:

Aplicar una técnica instrumental

ALCANCE:

La técnica determina por cromatografía la concentración de etanol, glicerol y de los

sustratos sobrantes como sacarosa, glucosa y fructosa.

PRINCIPIO:

La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los

componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna)
y una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se ha tratado con RMe2SiCl. La
fase móvil actúa de portador de la muestra.

La muestra en solución es inyectada en la fase móvil. Los componentes de la

solución emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos
con la columna. Estas interacciones químicas, determinan la separación de los
contenidos en la muestra.
La utilización de los diferentes detectores dependerá de la naturaleza de los
compuestos a determinar.

EQUIPO:

Cromatógrafo de líquidos de Alta Presión (HPLC).

PROCEDIMIENTO:

Se toma la muestra a analizar y se mantiene bajo refrigeración.

Cuidando mantener la temperatura estable, la muestra se lleva al laboratorio

encargado de realizar el análisis cromatógrafo.

10. REFERENCIAS

 MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of

reducing sugar. Analyt Chem. 1959; p. 31, 426-429. En: RAIMBAULT,
Maurice. Manual de Laboratorio: Métodos Físicos, Químicos y
Microbiológicos. Cali, Colombia: ORSTOM – UV, 1994; p. 1-3.

 WANG, Nam Sun. Biochemical Engineering Laboratory Manual. University

of Maryland. Deparment of Chemical Engineering. 1999.

 Características del Biodiésel de palma y las mezclas. Mónica Cuéllar

Sánchez. Fedepalma.

 NTC 218. Grasas Y Aceites Vegetales Y Animales. Determinación Del Índice

De Acidez Y De La Acidez.

 NTC 283. Grasas Y Aceites Vegetales Y Animales. Determinación Del Índice

De Yodo.