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COLEGIO DE POSTGRADUADOS

INSTITUCIÓN DE ENSEÑANZA E INVESTIGACIÓN


EN CIENCIAS AGRÍCOLAS
INSTITUTO DE FITOSANIDAD

MAESTRÍA TECNOLÓGICA

EN MEDIDAS SANITARIAS Y FITOSANITARIAS

DETECCIÓN DE LOS VIRUS MOSAICO Y MANCHA ANULAR


DEL PAPAYO EN Carica papaya L.
EN COMAYAGUA, HONDURAS

FABIOLA MAYRETH ELVIR GUEVARA

TESINA

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL


PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRÍA TECNOLÓGICA

MONTECILLO, TEXCOCO, EDO. DE MEXICO

2004
La presente tesina realizada por la alumna FABIOLA MAYRETH ELVIR

GUEVARA, bajo la dirección del Consejo Particular indicado, ha sido aprobada por el

mismo y aceptada como requisito parcial para obtener el grado de:

MAESTRÍA TECNOLÓGICA

ESPECIALISTA EN MEDIDAS SANITARIAS Y


FITOSANITARIAS

CONSEJO PARTICULAR

CONSEJERA: DRA. ELIZABETH CÁRDENAS SORIANO

ASESOR: DR. DANIEL LEOBARDO OCHOA MARTÍNEZ

ASESOR: MT. RAÚL RODAS SUAZO

Montecillo, Estado de México

2004

ii
AGRADECIMIENTOS

Al Organismo Internacional Regional de Sanidad Agropecuaria (OIRSA).

Al Proyecto Regional de Fortalecimiento de la Vigilancia Fitosanitaria en Cultivos de

Exportación No Tradicional VIFINEX – OIRSA.

Al Instituto de Fitosanidad del Colegio de Postgraduados de México.

Al Laboratorio del Virología Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo.

A mi Consejera Dra. Elizabeth Cárdenas Soriano.

A mi Asesor Dr. Daniel Ochoa.

A mi Asesor Ing. Raúl Rodas, por su valiosa colaboración en la realización de este

proyecto.

Al Dr. Juan Cibrián Tovar.

A mis amigos y compañeros de trabajo.

A mis padres y hermanos quienes me animan a seguir el camino con perseverancia.

A mi esposo Rafael Valverde y mi hijo Rafaelito por su amor, apoyo y comprensión en

la culminación de esta meta y por ser mi fuente de inspiración.

iii
CONTENIDO Página
INDICE DE CUADROS v

INDICE DE FIGURAS vi

RESUMEN vii

ABSTRACT viii

1. INTRODUCCION 1

1.1. VIRUS DEL MOSAICO DEL PAPAYO 3

1.2. VIRUS DE LA MANCHA ANULAR DEL PAPAYO 4

2. MATERIALES Y METODOS 7

2.1. COLECTA DE MUESTRAS 7

2.2. ANALISIS DE MUESTRAS 10

2.2.1. DAS-ELISA 10

2.2.2. INCLUSIONES VIRALES 12

2.2.3. TINCION NEGATIVA 13

3. RESULTADOS Y DISCUSION 16

3.1. COLECTA DE MUESTRAS 16

3.2. ANALISIS DE MUESTRAS 17

3.2.1. DAS-ELISA 17

3.2.2. INCLUSIONES VIRALES 19

3.2.3. TINCION NEGATIVA 21

3.3. COLECTA DE ARTROPODOS 21

4. CONCLUSIONES 26

5. LITERATURA 28

6. ANEXO 1 32

7. ANEXO 2 47

iv
INDICE DE CUADROS

Página

Cuadro 1. Características de las fincas y de las plantas de papayo (Carica papaya 16

L.) muestreadas en el Valle de Comayagua, Honduras, 2004

Cuadro 2 Síntomas observados en tejido de papayo colectado en 15 fincas y 18

resultados de la prueba DAS- ELISA para el virus de la mancha anular

(PapMV), Mayo de 2004, Comayagua, Honduras, 2004

Cuadro 3. Presencia del PapMV en hojas jóvenes y maduras (estrato superior y 19

medio respectivamente) de plantas de papayo. Valle de Comayagua,

Honduras, 2004

Cuadro 4. Coordenadas de las fincas de papayo muestreadas en el Valle de 22

Comayagua, Honduras, 2004

v
INDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Síntomas observados en plantaciones de papayo en el valle de 8

Comayagua, Honduras 2004.

Figura 2. Inclusiones virales observadas al microscopio de luz en muestras de 20

tejido de plantaciones de papayo del valle de Comayagua, Honduras

2004.

Figura 3. Partículas virales observadas al microscopio electrónico en muestras de 21

tejido de plantaciones de papayo del valle de Comayagua, Honduras

2004.

Figura 4. Hojas Cartográficas geoposicionadas en Arcview 3.2, 1628.sid. 23

INFOAGRO/SAG

Figura 5. Hojas Cartográficas geoposicionadas en Arcview 3.2, 1628.sid. 24

INFOAGRO/SAG

Figura 6. Mapa de Honduras geoposicionado en Arcview 3.2, 1628.sid. 25

INFOAGRO/SAG.

vi
DETECCIÓN DE LOS VIRUS MOSAICO Y MANCHA ANULAR DEL PAPAYO

EN Carica papaya L. EN COMAYAGUA, HONDURAS

Fabiola Mayreth Elvir Guevara

RESUMEN

El presente estudio tuvo como objetivo detectar la presencia del virus del mosaico

(Papayo Mosaic Potexvirus, PapMV) y mancha anular del papayo (Papayo Ringspot

Potyvirus, PRSV) en plantaciones de papayo (Carica papaya) en Comayagua,

Honduras, mediante las técnicas: DAS-ELISA, inclusiones virales y microscopía

electrónica. El 15 de febrero del 2004, se colectó tejido foliar de plantas procedentes de

15 fincas de papayo criollo, tipo Solo y de las variedades Dama Roja y Tainung las

cuales presentaban clorosis, deformación, corrugamiento de hojas, lesiones necróticas,

moteado y enanismo. Este material fue analizado en el laboratorio de la Universidad del

Valle de Guatemala, con la técnica DAS-ELISA, resultando negativas para PapMV y

PRSV el 100% de las muestras. Un segundo muestreo se realizó el 15 de mayo del 2004,

en plantas con los síntomas antes descritos, procesadas en el laboratorio de Virología

Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo, México. Los resultados con la técnica

DAS-ELISA fueron negativos para PRSV, pero positivos para PapMV en 6 fincas.

Asimismo, en el Laboratorio de Histopatología del CP, México, se diagnosticó en todas

las muestras al género Potexvirus a través del microscopio de luz (inclusiones virales) y

electrónico (partículas virales elongadas). Adicionalmente se elaboró un mapa de

distribución de los virus en la zona. Fueron identificados en el Instituto de Fitosanidad

del Colegio de Postgraduados (CP), México, los especimenes Trialeurodes spp.,

Empoasca spp. y Tetranichus mexicanus McGregor asociados al cultivo.

Palabras claves: Carica papaya L, DAS-ELISA, Inclusiones virales, microscopia

electrónica, Potexvirus, Honduras.

vii
DETECTION OF PAPAYA MOSAIC VIRUS AND PAPAYA RING SPOT VIRUS

IN Carica papaya L. IN COMAYAGUA, HONDURAS

Elvir Guevara Fabiola Mayreth

ABSTRACT

The present study had as objective to detect the presence of mosaic virus (Papaya

Mosaic Potexvirus, PapMV) and Papaya Ringspot Potyvirus (PRSV) in papaya tree

plantations (Carica papaya) located in the valley of Comayagua, Honduras, using three

techniques: DAS-ELISA, viral inclusions and electronic microscopy. Papaya trees

foliar tissue were collected on February 15th 2004 in 15 farms of local papaya varieties,

Solo type and to the varieties Dama roja and Tainung presenting chlorotic lesions

symptoms, deformation, wrinkled leaves, necrotic lesions, spotted and suppressed

growth, This material was analyzed in the Universidad del Valle laboratory with DAS-

ELISA in which 100% of the samples resulted negative for PapMV and PRSV. A

second foliar tissue collection was made on May 15th of the 2004, of plants leaves with

the symptoms described before, and were processed in the laboratory of Agricultural

Virology of the Universidad Autónoma Chapingo, Mexico. The results with DAS-

ELISA technique were negative for PRSV, but positive for PapMV in material of 6

farms. Also in the Histopatology Laboratory of the CP,Mexico, Potexvirus was

detected in all samples trough the light microscope (viral inclusions) and electronic

microscope (viral elongated particles). Additionally a map of viral distribution of this

area was elaborated. Trialeurodes spp., Empoasca spp. and Tetranichus mexicanus

McGregor were identified as specimens associated to this crop.

Key words: Carica papaya L, DAS-ELISA, viral inclusions, electronic

microscopy, Potexvirus, Honduras.

viii
1. INTRODUCCIÓN

El papayo pertenece a la familia Caricaceae y desde el punto de vista nutricional se lo

considera un excelente fruto por su alto contenido de vitamina A y C, además de ser una

buena fuente de calcio (Sudzuki, 1996). DICTA (2004), sugiere que los requerimientos

agroecológicos del papayo son de un clima tropical y subtropical y requiere de una

humedad relativa del 60 – 80%. La precipitación pluvial de 1500 -2000 mm/año y

temperatura óptima de 18 – 20 °C.

A nivel mundial el papayo es un cultivo de gran potencial para el mercado de las

exportaciones, por lo que se han desarrollado técnicas de mejoramiento genético para

convertir la tradicional papaya en un producto apto para el mercado internacional

(Doyle, 2000). Derivado de lo anterior, se ha originado el papayo tipo Solo con

características de mercado muy aceptables, pero cuyo cultivo es susceptible a ciertas

enfermedades lo cual compromete su rendimiento (Kuang et al., 1998).

Aún así, este cultivo se ha convertido en una importante fuente de ingresos para países

productores y exportadores de papaya. En Honduras, este potencial de exportación

puede ser desarrollado por contar con las condiciones climáticas ideales para el cultivo.

La producción de papaya en Honduras, ha sido parte de la cultura hortofrutícola de los

campesinos, los cuales en su inmensa mayoría, mantienen pequeñas áreas del cultivo, el

cual es destinado al autoconsumo o a la comercialización en mercados locales.

Históricamente se han cultivado materiales “criollos” que producen frutos grandes de

hasta 14 Kg. de peso, de sabor semidulce y color rojo tenue. Por tradición y tamaño,

estos materiales son los más populares para la comercialización local y regional

1
(mercado Centroamericano). Con la promoción de cultivos de exportación no

tradicionales, que se ha iniciado en la región de Centroamérica, Honduras ha introducido

nuevos materiales genéticos con mejores características de productividad, sabor, aroma,

color y tamaño. Estos materiales aun y cuando ofrecen muchas ventajas en comparación

con los materiales “criollos”, en su mayoría son más susceptibles a plagas y

enfermedades, convirtiéndose el factor fitosanitario en la principal limitante para su

producción (Rodas, 2004)1. Según Chiriboga (2000), entre los principales factores que

limitan la producción de papaya para la exportación se encuentran las enfermedades

ocasionadas por virus.

En Honduras, recientemente se dio inicio a un programa de promoción de la variedad

tipo Solo, el cual se ha posicionado con éxito en los mercados internacionales de frutas.

Sus características de sabor, aroma, tamaño y vida postcosecha, lo convierten en un

excelente material; sin embargo, su producción requiere de un estricto manejo de plagas

y enfermedades, principalmente las causadas por virus, ya que este cultivar es

susceptible a estos patógenos (VIFINEX, 2003). Los síntomas observados en las

plantaciones, como clorosis (en algunos casos en la totalidad del área foliar), mosaico,

deformación de hojas, defoliación y enanismo, constituyen el cuadro de problemas

fitosanitarios más frecuente en las plantaciones de papaya, provocando en este momento

la principal causa de pérdida del cultivo en el valle de Comayagua. Se encuentra en la

literatura que las plantas infectadas por virus exhiben inicialmente una clorosis en las

hojas más jóvenes, la cual es seguida por un aclaramiento de las nervaduras, rugosidad y

moteado prominente de la lámina foliar (Castaño, 1994). Estos síntomas se observan en

las plantaciones de papayo en el valle de Comayagua.

1
Rodas, R. 2004. Caracterización del cultivo de papaya en el valle de Comayagua. VIFINEX – OIRSA.
Comunicación Personal.

2
La complejidad de las enfermedades virales puede variar dependiendo de las relaciones

existentes entre el vector, el patógeno, el ambiente y las localidades donde ocurran.

(Palmieri, 2003). Los síntomas varían en intensidad dependiendo del aislamiento del

virus, temperatura, vigor y desarrollo fisiológico de las plantas (Gonsalves, 1994).

La necesidad de impulsar métodos prácticos para el diagnóstico de virus y otros

organismos, favoreció el desarrollo de alternativas de técnicas sensibles a virus similares

a las usadas en el diagnóstico de bacterias y hongos (Hansen y Wick, 1993). Uno de los

beneficios de la tecnología es el desarrollo de pruebas altamente específicas para el

diagnóstico de enfermedades de plantas y detección de patógenos basadas en reacciones

serológicas (Castaño, 1994). Para un diagnóstico confiable se requerirá realizar más de

una prueba de diagnóstico. Estas podrán ser los síntomas, rango de hospedantes, tipo de

transmisión, la morfología de la partícula viral, pruebas serológicas, entre otras

(Cárdenas, 1999).

Un virus es un agente genético que posee un ácido nucleico que puede ser ADN o ARN,

rodeado de una envoltura de proteína. Los virus contienen toda la información necesaria

para su ciclo reproductor pero necesitan para conseguirlo a otras células vivas de las que

utilizan orgánulos y moléculas (Anónimo, 2004).

1.1. Virus del mosaico del papayo (Papayo Mosaic Potexvirus, PapMV)

El PapMV pertenece al género Potexvirus, es una partícula viral filamentosa de 528 a

533 nm de longitud (Purcifull, et al., 1971). Al microscopio de luz se observan

inclusiones bandeadas en el citoplasma de células epidérmicas. Al microscopio

3
electrónico se determinó que las bandas están compuestas por partículas de virus

(Cárdenas, 1999). Es un virus de ARN, que infecta varias plantas dicotiledóneas

(Conover, 1962). El PapMV no es transmitido por vectores ni semilla y sólo se transmite

por inoculación mecánica (Brunt, et al., 1996).

Las plantas jóvenes inicialmente presentan un aclaramiento de nervaduras, moteado en

la lámina foliar y el crecimiento de la planta se retarda (Purcifull, et al., 1971). Los

síntomas más frecuentemente observados son: mal desarrollo de la planta, márgenes

foliares irregulares y moteado en las hojas (Breman, 1997). Sobre los pecíolos, parte

superior del tallo y frutos no aparecen otros síntomas. En general el crecimiento es

ligeramente retardado, pero si hay fructificación lo que la diferencia del virus de la

mancha anular (Barahona, et al., 1991).

En cuanto al manejo de la enfermedad se debe tener cuidado con las prácticas culturales

para evitar al máximo daño mecánico así como una adecuada limpieza de los

instrumentos de cosecha (Brunt, et al., 1996). Esta enfermedad se reportó en Estados

Unidos en 1962 y en Venezuela en 1970 (Purcifull, et al., 1971).

1.2. Virus de la mancha anular del papayo (Papayo Ringspot Potyvirus, PRSV)

El PRSV es un virus de ARN, que pertenece al género Potyvirus, no se transmite por

semilla y es transferido de plantas infectadas a plantas sanas por medio de áfidos (más

de 25 especies), los más frecuentes son: Myzus persicae, Aphis gossypii, A. neerii, A.

citricola y A. spiraecola (VIFINEX, 2003).

4
La dispersión del PRSV depende principalmente de factores bióticos y abióticos que

influyen en la presencia y movimiento de los insectos vectores (Téliz, et al., 1987).

La partícula viral es una varilla flexible con dimensiones aproximadas de 780 nm de

longitud y un diámetro de 12 nm (Yeh, et al., 1984).

Francki et al. (1985), sugiere que todos los Potyvirus inducen estructuras complejas en

el citoplasma de células infectadas, formando inclusiones laminadas e inclusiones

circulares, nominadas inclusiones cilíndricas cuando se observan al microscopio

electrónico. Las inclusiones inducidas por los Potyvirus, son de naturaleza proteica y en

su gran mayoría son citoplasmáticas amorfas, fibrosas y granulares vistas al

microscopio de luz.

El PRSV tiene dos biotipos: PRSV-p y PRSV-w. El PRSV-p infecta papayo y

cucurbitáceas, mientras que el PRSV-w infecta sólo cucurbitáceas. El rango de

hospedantes de PRSV se limita a plantas de la familia Caricaceae, Cucurbitaceae y

Chenopodiaceae (Purcifull, 1984).

Los síntomas provocados por el PRSV en plantas de papayo inician con un reticulado

acuoso de las nervaduras secundarias y terciarias en el envés de las hojas (Cárdenas, et

al., 1993). En los pecíolos y parte superior del tallo aparecen manchas de color verde

oscuro con apariencia grasienta o acuosa, que liberan látex cuando son heridas. Los

síntomas más característicos se presentan en los frutos donde se desarrollan manchas en

forma de anillo o de “C” con apariencia grasienta (Barahona, et al., 1991).

5
Este virus es uno de los más destructivos en casi todas las regiones dedicadas al cultivo

de papayo. Es particularmente severo en áreas de Tailandia, Taiwán, Filipinas y parte sur

de China (Gonsalves, 1994). Está presente en Estados Unidos, Sur América, países del

Caribe, India, China, Medio Oriente, África (Brunt, et al., 1996) y México (Téliz, et al.,

1987).

Carrillo (1990), sugiere la integración de las siguientes medidas para reducir el efecto de

la enfermedad en plantaciones de papayo:

• Hacer inspecciones periódicas en plantaciones y eliminación de las primeras

plantas enfermas.

• Mantener la plantación libre de maleza.

• Evitar la presencia de cucurbitáceas en torno a la plantación de papayo.

• Destruir plantaciones viejas enfermas.

• Uso de barreras y control de vectores.

Debido a la poca información disponible de los virus presentes en papayo en nuestro

país, existe la necesidad de realizar investigaciones que permitan identificarlos y conocer

su distribución, formas de transmisión, rango de hospederos y vectores asociados para

diseñar y establecer estrategias de manejo exitosas. El presente estudio tuvo como

objetivo principal, la detección del virus del mosaico (Papayo Mosaic Potexvirus,

PapMV) y virus de la mancha anular (Papayo Ringspot Potyvirus, PRSV) en

plantaciones de papayo establecidas en el valle de Comayagua. Adicionalmente se

elaboró un mapa de distribución de los virus en la zona y se identificaron los dos

especies insectiles y un acaro asociados al cultivo.

6
2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Colecta de muestras

El presente estudio se realizó en el valle de Comayagua, Honduras el cual se localiza en

los 14°-08´ latitud Norte, 87-02-08´ longitud Oeste, entre los departamentos de

Comayagua y La Paz. Con 3,725 Km2 de extensión territorial. La elevación media es de

550 a 700 msnm, registrando una temperatura media anual de 41 °C, una humedad

relativa de 69% una precipitación de 116.9 mm y una evaporación de 1,724.4 mm

(DICTA,2004).

Se realizaron dos muestreos dirigidos en los meses de febrero y mayo del 2004 en 15

plantaciones de papayo. Se colectó tejido foliar (hoja completa con pecíolo), de plantas

de papayo de los estratos superior y medio que mostraban síntomas tales como: clorosis,

deformación, corrugamiento, necrosis, moteado y enanismo (figura 1).

7
A B
Elvir, G. F. Elvir, G. F

C D
Elvir, G. F Elvir, G. F

E F
Elvir, G. F Elvir, G. F

Figura 1. Síntomas observados en plantaciones de papayo en el valle de Comayagua, Honduras 2004. A)


Hoja del estrato medio con mosaico. B) Hoja del estrato medio deforme. C) Hojas apicales cloróticas y
corrugadas. D) Planta con hojas apicales corrugadas. E) Planta con crecimiento reducido. F) Hoja del
estrato medio con mosaico.

8
Se utilizaron bolsas plásticas ziplock de 2.2 Kg. para guardar las hojas obtenidas de cada

planta, cuales se manipularon con guantes desechables y se cortaron con navajas Gillette

individuales para cada muestra y evitar así la contaminación cruzada entre muestras.

En promedio se tomaron dos muestras por finca, de las plantas con los síntomas antes

mencionados. Para documentar cada muestreo, se elaboraron fichas con información de

la finca y del cultivo con los siguientes datos: propietario, dirección, georeferenciación,

área cultivada, variedad, edad y estado del cultivo. Asimismo se describieron

detalladamente los síntomas observados en cada planta muestreada los cuales se

apoyaron con fotografías digitales por cada una de las plantas muestreadas. Finalmente,

se marcaron las plantas muestreadas en el tallo con pintura en aerosol de color rojo, para

identificarlas posteriormente de obtener el diagnóstico del laboratorio, las marcas

utilizadas fueron las siguientes: se utilizo la letra “F” para finca seguida de un número

progresivo mas la letra “M” seguida de un número progresivo que indica el número de

muestra. Cada finca fue georeferenciada utilizando GPS de la marca GARMIN Modelo

EtrexVista para la elaboración del mapa de distribución de los virus en las plantaciones

de papayo.

Simultáneamente a la toma de muestras de tejido foliar, con un aspirador de insectos

manual de succión se colectaron insectos con hábitos alimenticios chupador o masticador

chupador, encontrados en las plantas de papayo y se conservaron en etanol al 80% para

ser identificados posteriormente en el Colegio de Postgraduados. No se colectaron

muestras de insectos procedentes de malezas.

9
2.2. Análisis de muestras

2.2.1. DAS-ELISA

Las 33 muestras del primer muestreo colectadas de las 15 fincas, se conservaron en una

hielera con hielo a una temperatura aproximada de 4° C y se trasladaron vía aérea al

laboratorio de la Universidad del Valle en Guatemala para su diagnóstico. Al ingresar las

muestras al laboratorio se observaron los síntomas de cada una y con la descripción de

los mismos se creó un registro de información de cada una de las muestras, adicionando

fotografías para reforzar la descripción de los síntomas observados en campo.

Para identificar a los virus PapMV y PRSV se utilizó la técnica de DAS - ELISA

(Double Antibody Sandwich - Enzime Linked Immunosorbent Assay), utilizando el

protocolo anticuerpos y conjugados de AGDIA Inc. Elkhart, Indiana 46514, USA.

Con el fin de confirmar los resultados obtenidos en el primer muestreo y aplicar otras

técnicas de diagnóstico como las microscopia electrónica e inclusiones virales, el 15

mayo del 2004, se realizó el segundo muestreo, tomando en promedio dos muestras por

finca (38 muestras en total), considerando las 15 fincas del primer muestreo. Se tomaron

hojas jóvenes del estrato superior y adultas del estrato medio de la planta, con los

síntomas descritos anteriormente de las mismas plantas que se marcaron en el muestreo

anterior. Únicamente en aquellas fincas en que la planta marcada había muerto, se tomó

tejido foliar de una nueva planta también con síntomas. Las muestras se conservaron

dentro de bolsas plásticas ziplock de 2.2 Kg., envueltas en papel toalla humedecido y se

colocaron dentro de una hielera con hielo y se trasladaron vía aérea al Instituto de

Fitosanidad (IFIT) del Colegio de Postgraduados (CP), Campus Montecillo, México,

10
para ser analizadas con las técnicas de DAS - ELISA, inclusiones virales y tinción

negativa para microscopía electrónica.

Las 38 muestras de hojas de papayo, fueron procesadas en el laboratorio de Virus

Fitopatógenos IFIT-CP y de Virología Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo

para analizarlas con la técnica de DAS-ELISA, utilizando el protocolo propuesto por

Clark y Adams (1997), modificado por Sutula (1993). Las placas de ELISA fueron

analizadas a 405 nm en un lector de ELISA automático (Multiskan EX de Labsystems

Inc.).

Los materiales utilizados para realizar esta prueba fueron los siguientes:

• Hojas de papayo con síntomas (clorosis, moteado, deformaciones)

• Kit de ELISA para el virus de la mancha anular del papayo de AGDIA

• Lector de ELISA Multiskan EX Labsystems

• Impresora EPSON LX–300

• Macerador de tejido vegetal

• Amortiguador de lavado

• Amortiguador de extracción

• Amortiguador de conjugado

• Amortiguador de cobertura

11
• Amortiguador de sustrato

• Matraces

• Pipetas

• Agitadores

• Bolsas plásticas

2.2.2. Inclusiones Virales

Para la observación de inclusiones virales en epidermis, todas las muestras fueron

procesadas en el laboratorio de Histopatología IFIT-CP siguiendo el protocolo propuesto

por Cárdenas (1993) .

Se utilizaron los siguientes materiales:

• Hojas de papayo con síntomas (clorosis, moteado, deformaciones)

• Colorante azul de bromofenol mercurio

• Portaobjetos de vidrio

• Cubreobjetos

• Pinza

• Lija de agua

• Agua de la llave

12
• Etilenglicol monometil eter

• Glicerina

• Microscopio de luz Carl Zeiss Ultraphot II

Procedimiento:

Se colocó sobre un portaobjetos tres gotas de colorante azul de bromofenol mercurio,

luego con una pinza se tomaron tiras de epidermis por el envés de la hoja, en aquellos

casos en que no fue posible obtener tiras de epidermis, se empleó lija de agua lijando

cuidadosamente la hoja por la parte del haz, hasta quedarnos con la epidermis de la

nervadura del envés. Posteriormente para eliminar la clorofila de la porción de tejido

lijado se colocaron en etilenglicol monometil eter, dejándolo sumergido hasta que se

observó el tejido completamente clarificado. Una vez obtenido este tejido se colocó sobre

el portaobjetos donde inicialmente colocamos el colorante azul de bromofenol mercurio y

se dejó teñir durante siete minutos, luego se enjuagó con agua de la llave, hasta que ya el

agua no salió coloreada, seguidamente se le agregaron cuatro gotas de glicerina al 25% y

se le colocó el cubreobjetos sobre la muestra. Las observaciones y toma de fotografías se

hicieron en un microscopio de luz Carl Zeiss Ultraphot II.

2.2.3. Tinción Negativa

Todas las muestras obtenidas en la segunda colecta realizada en mayo del 2004, excepto

las de las fincas 9 y 11, se procesaron para tinción negativa en el laboratorio de

Histopatología IFIT-CP. Lo anterior fue debido a que las muestras del resto de las fincas

presentaron síntomas más severos de clorosis, corrugamiento y mosaico.

13
Para la tinción negativa se utilizaron los siguientes materiales:

• Hojas de papayo con síntomas (clorosis, moteado, deformaciones)

• Rejillas de cobre de 250–300 mallas con membrana de formvar al 25% en

dicloroetano.

• Portaobjetos de vidrio

• Pipetas Pasteur

• Cajas de Petrí

• Papel filtro

• Pinzas de punta fina

• Solución al 1% de ácido fosfotúngstico pH 6.9

• Navaja Gillette

• Lápiz

• Microscopio electrónico marca Jeol, modelo EM-9

Procedimiento:

Se tomaron porciones de la hoja y se colocaron sobre el portaobjetos en el cual

previamente se colocó una gota del ácido fosfotúngstico al 1%, se maceró con una

navaja limpia, hasta lograr extraer savia del tejido, luego con una pinza se sujetó una

rejilla la cual se puso en contacto con el extracto obtenido de la maceración, se dejó

14
humedecer la rejilla esperando un minuto para que secara un poco y luego se colocó en

una caja Petri sobre papel filtro, marcando con lápiz a un lado de la rejilla el número de

muestra correspondiente para su identificación. La observación de las preparaciones se

hizo en un microscopio electrónico marca Jeol, modelo EM-9 en la unidad de

microscopía electrónica del Colegio de Postgraduados.

15
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Colecta de muestras

De las 15 fincas muestreadas en ambas fechas (febrero y mayo) el 73% están sembradas

con papayo criollo, el 13% con tipo Solo y únicamente un 7% con las variedades Dama

Roja y Tainung. Se encontró que de las 15 fincas muestreadas, el 73% se encontró en

etapa de producción, el 7% en abandono y el 20% en crecimiento vegetativo (Cuadro 1).

Cuadro 1: Características de las fincas y de las plantas de papayo (Carica papaya L.)
muestreadas en el Valle de Comayagua, Honduras, 2004.

Edad de las
No. Muestras Superficie
Variedad plantas Estado del cultivo
Finca colectadas (Mz.)
(meses)
1 3 0.75 criolla 10 Produccióna
2 3 1.5 criolla 15 Produccióna
3 2 8 tipo Solo 14 Abandonob
4 2 1.42 dama roja 9 Produccióna
5 2 1 criolla 7 Produccióna
6 2 1 criolla 12 Produccióna
7 2 0.75 criolla 13 Produccióna
8 2 1.7 criolla 10 Crecimiento vegetativoc
9 1 1 criolla 13 Produccióna
10 2 1 criolla 11 Crecimiento vegetativoc
11 2 0.5 criolla 15 Produccióna
12 1 2 criolla 11 Crecimiento vegetativoc
13 2 1.7 criolla 14 Produccióna
14 4 1 tainung 11 Produccióna
15 3 2 tipo Solo 15 Produccióna
a
La planta se encuentra en producción. 
b
La plantación se encuentra sin ningún manejo agronómico. 
c
La plantación se encuentra en desarrollo. 

La información que contiene el cuadro 1, es la misma en ambos muestreos, la única

diferencia es la edad de la planta, ya que el segundo muestreo se realizó tres meses

después del primer muestreo.

16
3.2. Análisis de muestras

3.2.1. DAS-ELISA

El 100% de las muestras analizadas en el laboratorio de la Universidad del Valle en

Guatemala fueron negativas a PapMV y PRSV. Este resultado negativo puede deberse a

que las muestras analizadas, no tuvieron la concentración mínima de detección en el

momento del muestreo ya que se sabe que la técnica de DAS-ELISA no detecta virus en

plantas si su concentración es menor de 0.1 ng de virus por ml (Salazar, 1996). Sin

embargo, en los análisis realizados en laboratorio de Virología Agrícola de la

Universidad Autónoma Chapingo, México, en todos los casos se obtuvieron resultados

negativos para el PRSV, pero positivos para el PapMV en muestras de seis fincas

(Cuadro 2):

17
Cuadro 2. Síntomas observados en tejido de papayo colectado en 15 fincas y

resultados de la prueba DAS- ELISA para el virus de la mancha anular (PapMV),

Mayo de 2004, Comayagua, Honduras.

Tipo
No. Resultado
de Síntomas
finca DAS ELISA
papayo
1 criolla Hojas necróticas, lesiones cloróticas, planta enana +
2 criolla Hojas adultas con lesiones cloróticas +
3 tipo Planta con pocas hojas, hojas con reducción del área +
Solo foliar, planta sin fruto.
4 dama Hojas con abultamientos en el área foliar, lesiones -
roja cloróticas, planta enana
5 criolla Hojas con abultamiento en el área foliar, lesiones +
cloróticas, planta enana
6 criolla Hojas con abultamientos en el área foliar, lesiones -
cloróticas, planta presenta síntoma punta de lápiz, es
decir solamente hay hojas en el ápice y estas tienen su
área foliar reducida.
7 criolla Planta presenta defoliación, hojas adultas deformes, -
punta de lápiz.
8 criolla Hojas apicales con lesiones cloróticas -
9 criolla Hojas apicales con lesiones cloróticas -
10 criolla Hojas con moteado (contraste de color verde claro y +
verde oscuro)
11 criolla Punta de lápiz, ápice arrepollado +
12 criolla Hojas deformes, planta enana -
13 criolla Hojas con moteado -
14 tainun Hojas de todos los estratos con lesiones cloróticas -

15 tipo Hojas apicales con lesiones cloróticas -


Solo
+= Positivo

- = Negativo

De las seis fincas positivas para PapMV , se observó que los síntomas encontrados en

común fueron: presencia de lesiones cloróticas y enanismo de las plantas, además se

observó que la detección del virus a través de la prueba (DAS-ELISA) tuvo variaciones

de acuerdo al tejido analizado, es decir en algunos casos se manifestó en ambos tipos de

tejido (joven y adulto) y en otros solamente se manifestó en un tipo de tejido. El 50%

18
sólo en tejido joven, mientras que el 16.66% se presentó únicamente en tejido adulto, en

los casos en que el virus se encontró en ambos tipos de tejido fue de 16.66% y restante

16.66% corresponde a una muestra compuesta únicamente por tejido adulto (Cuadro 3).

Cuadro 3: Presencia del PapMV en hojas jóvenes y maduras (estrato superior y

medio respectivamente) de plantas de papayo. Valle de Comayagua, Honduras,

2004.

Tipo de
No. De No. de
tejido Observaciones
Finca Muestra
analizado
F1 M1 Joven/Adulto El virus se manifestó únicamente en tejido joven
F2 M1 Adulto Únicamente se analizo tejido adulto
F3 M1 Joven/Adulto El virus se manifestó únicamente en tejido joven
F5 M1 Joven/Adulto El virus se manifestó únicamente en tejido adulto
F10 M1 Joven/Adulto El virus se manifestó en ambos tipos de tejido
F10 M2 Joven/Adulto El virus se manifestó en ambos tipos de tejido
F11 M2 Joven/Adulto El virus se manifestó únicamente en tejido joven

Como tejido apical se consideró el tejido joven tomado del estrato superior, mientras que

el adulto es aquel tomado del estrato medio de la planta, hojas ya completamente

formadas y maduras pero aún turgentes. De las seis fincas en las que se detectó este

virus a través de la técnica DAS-ELISA, cinco se dedican a cultivar papayo criolla y una

al cultivar tipo Solo.

3.2.2. Inclusiones virales

En plantas colectadas en mayo del 2004 se encontraron inclusiones amorfas, densas en el

citoplasma de las células oclusivas de los estomas (figura 2). Adicionalmente se

encontraron inclusiones amorfas, densas, dentro del núcleo de las células del parénquima

situadas sobre las nervaduras (figura 2). En ocasiones se llegaron a observar granulosas

19
y estos gránulos con una disposición uniforme dando la apariencia de inclusiones

bandeadas. De acuerdo con la forma y localización de las inclusiones antes indicadas,

éstas corresponden a las inducidas por el PapMV (Cárdenas, 1999).

A B
Ochoa M.D. Ochoa M.D.

C D
Ochoa M.D. Ochoa M.D.

Figura 2. Inclusiones virales observadas al microscopio de luz en muestras de tejido de plantaciones de


papayo del Valle de Comayagua, Honduras 2004. A) Inclusiones citoplasmáticas amorfas; B) Inclusiones
citoplasmáticas densas; C) Inclusiones nucleares amorfas y densas; D) Inclusiones nucleares.

20
3.2.3. Tinción negativa

En las muestras sometidas a tinción negativa, se observaron partículas virales al

microscopio electrónico de forma elongada y flexible las cuales corresponden a un

Potexvirus (Fig. 3).

A B
Cardenas, S. E. Cardenas, S. E.

Figura 3. Partículas virales observadas al microscopio electrónico en muestras de tejido de plantaciones de


papayo del valle de Comayagua, Honduras 2004. A) Partículas virales elongadas y flexibles; B) Partículas
virales elongadas y flexibles.

3.3. Colecta de artrópodos

Se encontraron los siguientes artrópodos asociados al cultivo de papaya en las 15 fincas

muestreadas:

• Trialeurodes spp.
• Empoasca spp.
• Tetranichus mexicanus McGregor

La identificación fue realizada por el Dr. Cesáreo Rodriguez Hernández del Instituto de

Fitosanidad del Colegio de Postgraduados de México.

21
Las poblaciones de Trialeurodes spp. y Empoasca spp. se encontraron en poblaciones

reducidas; sin embargo, en algunas fincas se observaron altas densidades de población

de Tetranichus mexicanus McGregor, provocando daños directos tales como reducción

del área foliar y enrollamiento de las hojas.

3.4. Mapa de distribución de los virus

Cuadro 4: Coordenadas de las fincas de papayo muestreadas en el Valle de

Comayagua, Honduras, 2004.

No. de finca Mapa Vertical Horizontal Altitud


1 1 424661 1597348 593
2 2 424749 1593698 631
3 3 424937 1591563 642
4 4 425750 1590780 640
5 5 427182 1588940 625
6 6 427193 1588517 624
7 7 426201 1588098 634
8 8 427280 1588021 616
9 9 427062 1586573 626
10 A 433283 1585426 621
11 B 437892 1580875 641
12 C 438687 1579356 650
13 D 437822 1581229 640
14 E 429378 1597422 555
15 F 424822 1596092 609

22
Figura 4. Fuente: Hojas Cartográficas geoposicionadas en Arcview 3.2, 1628.sid. INFOAGRO/SAG.

23
Figura 5. Fuente: Hojas Cartográficas geoposicionadas en Arcview 3.2, 1628.sid. INFOAGRO/SAG.

24
Figura 6. Fuente: Mapa de Honduras geoposicionado en Arcview 3.2, 1628.sid. INFOAGRO/SAG.

25
4. CONCLUSIONES

1. En las 15 fincas muestreadas se observaron inclusiones virales al microscopio de

luz y partículas virales al microscopio electrónico, correspondientes al virus del

mosaico del papayo (PapMV). Sin embargo, mediante la técnica de DAS-ELISA

resultaron positivas al mencionado virus, muestras de sólo seis fincas.

2. Para un diagnóstico confiable de virus en plantas, se deberán integrar varias

técnicas de detección (serológicas, biológicas y moleculares), sin embargo por la

poca disponibilidad y el alto costo de las mismas, se deben implementar técnicas

más económicas (inclusiones virales).

3. En las 15 fincas muestreadas no se detectó presencia del Virus de la mancha

anular del papayo (Papayo Ringspot Potyvirus, PRSV), mediante los tres

métodos utilizados (DAS-ELISA, Inclusiones virales y microscopía electronica).

Asimismo, no se observaron síntomas característicos de este virus en las

plantaciones muestreadas.

4. Para el diagnóstico del virus del mosaico del papayo (PapMV), se debe tomar

tejido apical y tejido adulto, ya que su distribución en la planta no se concentra

únicamente en tejido apical.

5. Los síntomas comúnmente encontrados en las plantas con resultados positivos

para el virus del mosaico del papayo (PapMV), fueron clorosis y enanismo.

26
6. Dado que el virus del mosaico del papayo (PapMV) se trasmite en forma

mecánica, se deben considerar prácticas culturales en todas las etapas del cultivo,

evitando el daño mecánico a las plantas y haciendo una correcta limpieza de las

herramientas.

7. Se encontraron como artrópodos asociados al cultivo de papaya en las 15 fincas

muestreadas los siguientes:

• Trialeurodes spp.

• Empoasca spp.

• Tetranichus mexicanus McGregor

27
5. LITERATURA CITADA

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Yeh, S.D., and Gonsalves, D. 1984. Translation of papayo ringspot virus RNA in vitro:

Detection of a possible polyprotein that is processed for caspid protein, cylindrical –

inclusions protein, and amorphous-inclusion protein.

31
6. ANEXO 1

METODO DE ELISA PROPUESTO POR CLARK Y ADAMS (1977) MODIFICADO

POR SUTULA (1993) PARA FOSFATASA ALCALINA.

Elaborado por el Dr. José A. Quintero Benítez,


Universidad Autónoma de Sinaloa, México

1.1.- Preparación de soluciones.

1.1.1.- Solución madre del amortiguador del lavado (PBSt 10X).

Fórmula:

Cloruro de sodio anhidro (NaCl) 40.00 g

Fosfato dibásico de sodio anhidro (Na2Hpo4) 5.75 g

Fosfato monobásico de potasio anhidro (Kh2PO4) 1.00 g

Cloruro potasio anhidro (KCl) 1.00 g

Tween – 20 (monolaurato de polietilensorbitán) 2.5 mL

Agua destilada (H2Od), aforar a 500.00 mL

(pH=7.4)

ATENCION: el fosfato dibásico de sodio forma terrones que al contacto con el agua, se

vuelven duros y se precipitan. Es recomendable deshacer los terrones con una espátula

hasta que el reactivo quede como polvo fino; agregarlo poco a poco. El control de las

velocidades del agitador magnético indicadas en los protocolos es importante para evitar

32
la formación de espuma en las mezclas.

Preparación:

1.- Agregar 200 Ml del H2Od en un matraz y colocarlo en un agitador magnético a

velocidad media-alta.

2.- Pesar y agregar el cloruro de sodio. Esperar a que se disuelva.

3.- Subir la velocidad del agitador magnético a alta.

4.- Pesar el fosfato dibásico de sodio; deshacer los terrones. Agregarlo poco a poco, hasta

que se disuelva.

5.- Pesar y agregar el fosfato monobásico de potasio; esperar a que se disuelva.

6.- Pesar y agregar el cloruro de potasio; esperar a que se disuelva.

7.- Bajar la velocidad del agitador magnético a baja – media.

8.-Medir el volumen de Tween-20 en una pipeta y agregarlo.

9.- Llevar la mezcla a un volúmenes de 450 Ml con H2Od. Mantener en agitación por 30

– 60 segundos para que homogenice.

10.- El Medir el pH de la mezcla en un pH-metro calibrado. Generalmente oscila entre

6.8 -7.3.

11.- Mantener la mezcla en agitación a velocidad media, con el electrodo del pH-metro

dentro de la misma. Agregar NaOH 1N gota a gota, vigilando el incremento en el pH.

Llevar el pH de la mezcla a 7.4. Si el pH inicial es superior a 7.4. o si al tratar de ajustar

33
el pH sobrepasa ese valor, puede bajar y ajustar el pH con una solución de HC 1N.

12.- Llevar la mezcla a un volumen final de 500 Ml con H2Od. Dejar en agitación por

30-60 segundos para que homogenice.

La solución debe almacenarse a 6 °C (en el refrigerador). Puede conservarse por un

tiempo máximo de cinco meses a partir de la fecha de la preparación.

1.1.2.- Amortiguador de lavado (PBSt 1X).

Fórmula:

Solución madre (PBSt 10X) 100.0 Ml

Agua destilada (H2Od), aforar un 1000.0 Ml

Preparación:

1.- Medir 100 Ml de PBSt 10X en una probeta y agregar a un matraz. Colocar el matraz

en un agitador magnético a velocidad media.

2.- Llevar la mezcla a un volumen final de 1000 Ml con H2Od. Dejar en agitación por

30-60 segundos para que homogenice.

Esta solución debe almacenarse a 6 °C (en le refrigerador). Pede conservarse por un

tiempo máximo de un mes a partir de la fecha de preparación.

1.1.3.- Amortiguador de extracción.

Fórmula:

34
Albúmina del huevo 0.300 g

Sulfito de sodio anhidro (Na2SO3) 0.195 g

Polivinilpirrolidona (PVP-40) 3.000 g

Ázida del anhidro del sodio (Na2SO3) 0.030 g

Tween -20 (monolaurato de polietilensorbitán) 3.000 Ml

Amortiguador de lavado (PBSt 1X), aforar a 150.000 Ml

(pH=7.4)

ATENCION: La albúmina de huevo y el PVP-40 forman grumos poco solubles al

incorporarse al PBSt, por lo que es recomendable predisolverlos. Se coloca el reactivo en

un vaso de precipitado pequeño, se agrega un poco de PBSt 1X (suficiente para que

humedezca a punto de sobresaturación) y se agita vigorosamente con una varilla de vidrio

para que se disuelvan los grumos, después se añade otro poco de PBSt 1X y se agita de

nuevo. La substancia predisuelta se agrega a la mezclas.

Preparación:

1.- Agregar 50 Ml de PBSt 1X en un matraz y colocarlo en un agitador magnético a

velocidad baja.

2.- Pesar la albúmina de huevo; predisolverla como se indicó y agregar. Esperar a que se

disuelva.

35
3.- Pesar y agregar el sulfito de sodio; esperar hasta que se disuelva.

4.- Pesar el PVP-40; predisolverlo como se indicó y agregar. Esperar a que se disuelva.

5.- Pesar y agregar el ázida de sodio; esperar a que se disuelva.

6.- Medir el volumen de Tween-20 en una pipeta y agregarlo.

7.- Llevar la mezcla a un volumen de 130 Ml con PBSt 1X. Mantener en agitación por

30-60 segundos para que homogenice.

8.- Medir el pH de la mezcla en un pH-metro calibrado. Generalmente oscila entre 7.3 -

7.9.

9.- Mantener la mezcla en agitación a velocidad media, con el electrodo del pH-metro

dentro de la misma. Si el pH es mayor a 7.4, agregar HCl 1N gota a gota, vigilando,

el decremento en el pH. Llevar el pH de la mezcla a 7.4. Si el pH inicial es inferior un

7.4, o si al tratar de ajustar el pH baja ese valor, puede subir y ajustar el pH con una

solución de NaOH 1N.

10.- Llevar la mezcla a un volumen final de 150 Ml con PBSt 1X. Dejar en agitación por

30-60 segundos para que homogenice.

Esta solución debe almacenarse a 6 °C (en el refrigerador). Es común que se observe

un poco turbia, por pequeños grumos de PVP-40 que no alcanza a disolverse y se

precipitan; esto no afecta su uso. Puede conservarse por un tiempo máximo de un

mes a partir de la fecha de la preparación.

1.1.4.- Amortiguador del conjugado (ECI).

Fórmula:

36
Albúmina del bovino 0.30 g

Polivinilpirrolidona (PVP-40) 3.00 g

Ázida de sodio anhidra (NaN3) 0.03 g

Amortiguador de lavado (PBSt 1X), aforar 150.00 Ml

ATENCION: el PVP-40(y en ocasiones la albúmina de bovino) forma (n) grumos poco

solubles al incorporarse al PBSt, por lo que es recomendable predisolverlo (s). Se coloca

(n) el (los) reactivo (s) en un vaso de precipitado pequeño, se agrega un poco de PBSt 1X

(suficiente para que humedezca a punto de sobresaturación) y se agita vigorosamente con

una varilla de vidrio para que se disuelvan los grumos, después se añade otro poco de

PBSt 1X y se agita de nuevo. La substancia predisuelta se agrega entonces a la mezcla.

Preparación:

1.- Agregar 50 Ml de PBSt 1X en un matraz y colocarlo en un agitador magnético a

velocidad baja.

2.- Pesar albúmina de bovino; agregarla poco a poco. Esperar a que se disuelva.

3.- Pesar el PVP-40; predisolverlo como se indicó y agregar. Esperar a que se disuelva.

4.- Pesar y agregar el ázida de sodio; esperar a que se disuelva.

5.- Llevar la mezcla a un volumen final de 150 Ml con PBSt 1X. Mantener en agitación

por 30-60 segundos para que homogenice.

No es necesario medir no ajustar pH de la mezcla. Generalmente oscila entre 7.4-7.6.

Esta solución debe almacenarse a 6 °C (en el refrigerador). Puede conservarse por un

37
tiempo máximo de un mes a partir de la fecha de la preparación; como medida de

seguridad, no se emplee esta solución cuando se observe turbia.

1.1.5.-Amortiguador de cobertura.

Fórmula:

Carbonato de sodio anhidro (NaCO3) 0.238 g

Bicarbonato de sodio anhidro (NaHCO3) 0.439 g

Ázida de sodio anhidro (NaN3) 0.030 g

Agua destilada (H2Od), aforar un 150.000 Ml

(pH = 9.6)

Preparación:

1.- Agregar 50 Ml de H2Od en un matraz y colocarlo en un agitador magnético a

velocidad media.

2.- Pesar y agregar el bicarbonato de sodio; esperar a que se disuelva.

3.- Pesar y agregar el bicarbonato de sodio; esperar a que se disuelva.

4.- Pesar y agregar el ázida de sodio; esperar a que se disuelva.

5.- Llevar la mezcla a un volumen de 130 Ml con H2Od. Mantener en agitación por 30 -

60 segundos para que homogenice.

38
6.- Medir el pH de la mezcla con un pH-metro calibrado. Generalmente oscila entre 9.7 -

10.2.

7.- Mantener la mezcla en agitación a velocidad media, con el electrodo del pH-metro

dentro de la misma. Agregar HCl 1N gota a gota, vigilando el incremento en el pH.

Llevar el pH de la mezcla a 9.6. Si el Ph inicial es inferior a 9.6, o si al tratar de

ajustar el pH baja de ese valor, puede elevar y ajustar el pH con una solución de

NaOH 1N.

8.- Llevar la mezcla a un volumen final de 150 Ml con H2Od. Dejar en agitación por 30 -

60 segundos para que homogenice.

Esta solución debe almacenarse a 6 °C (en el refrigerador). Puede conservarse por

un tiempo máximo de un mes a partir de la fecha de preparación.

1.1.6.- Amortiguador de sustrato.

ATENCION: el amortiguador de sustrato es fotodegradable, por lo que el matraz o vaso

de precipitado en el que se prepare debe estar cubierto con papel aluminio. Aunque puede

conservarse hasta por una semana, es recomendable prepararlo momentos antes de su

utilización (1 hora de anticipación). De esa manera los resultados son confiables.

Fórmula:

Cloruro de magnesio anhidro (MgCl2) 0.0025g

Ázida de sodio anhidro (NaN3) 0.0050 g

Dietanolamina (bis[2-Hidroxietil]amina)(C4H11NO2) 2.4200 Ml

39
Agua destilada (H2Od), aforar a, 25.0000 Ml

(pH=9.8)

Preparación:

1.- Agregar 20 Ml de H2Od en un matraz y colocarlo en un agitador magnético a

velocidad media.

2.- Pesar y agregar el cloruro de magnesio; esperar a que se disuelva.

3.- Pesar y agregar el ázida de sodio; esperar a que se disuelva.

4.-Medir el volumen de dietanolamina en una pipeta agregar a la mezcla. Mantener

en agitación por 30-60 segundos para que homogenice.

5.- Medir el pH de la mezcla en un pH-metro calibrado. Generalmente oscila entre 10.9 -

11.5.

6.- La Mantener la mezcla en agitación a velocidad media, con el electrodo del pH-metro

dentro de la misma. Agregar HCl 1N gota a gota, vigilando el decremento en el pH.

Llevar el pH de la mezcla a 9.8. Si el pH inicial es inferior a 9.6, o si al tratar de

ajustar el pH queda debajo de ese valor puede subir y ajustar el pH con la solución de

NaOH 1N.

7.- Llevar la mezcla a un volumen de 25 Ml con H2Od. Dejar en agitación por 30 -

60 segundos para que homogenice.

ATENCION: el sustrato para la fosfatasa alcalina, en el compuesto llamado p-Nitrofenil

40
fosfato disódico (PNP, 5 mg/tableta3), se agrega con 10 minutos de anticipación.

Incorporación del amortiguador:

1.- Calcular el volumen del amortiguador de sustrato necesario para cubrir los pozos del

la placa ELISA (100µL/pozo), dejando cierto sobrante para compensar errores de

pipeteo.

2.- Medir y añadir ese volumen de amortiguador de sustrato en un vaso de precipitado

cubierto con papel aluminio. Colocarlo en un agitador magnético a velocidad baja -

media.

3.- Agregar una pastilla de PNP por cada 10 Ml del amortiguador de sustrato. Mantener

en agitación por 5-10 minutos para que la pastilla se incorpore y la mezcla

homogenice.

PROTOCOLO ELISA-DAS.

1.- Definir la distribución de tratamientos y sus repeticiones en la (s) placa (s) de ELISA.

Es recomendable que para cada virus que se quiera detectar se consideren: testigo

positivo (planta enferma con el virus objetivo), testigo negativo (planta sana de cada

especie incluida en las muestras), testigo blanco (sin muestras vegetal) y muestras

problema. Hacer un esquema de la distribución de los tratamientos, teniendo al menos

dos repeticiones por tratamiento.

2.- Calcular el volumen a utilizar de cada antisuero, de acuerdo con la sugerencia del

distribuidor. Se divide el volumen del amortiguador de cobertura requerido para < ese

antisuero entre la dilución sugerida. Es recomendable hacer los cálculos considerando

41
algunos pozos mas de los requeridos, para compensar errores de pipeteo.

EJEMPLO: se requiere cubrir 24 pozos de una placa ELISA con antisuero el TSWV(el

calculo se hará considerando dos pozos adicionales). Aunque la dilución recomendada

por Agdia es 1.200, nuestra experiencia ha demostrado que se obtienen buenos resultados

con 1.500.

Volumen del amortiguador = pozos*100 µL = (26*100)=2600 µL

Dilución = 500

Volumen de antisuero = volumen de amortiguador/dilución(2600µL/500) = 5.2µL

Resultado: se requieren 5.2 µL de antisuero TSWY, diluidos en 2600 µL de amortiguador

de cobertura, para cubrir los 24 pozos de la placa.

3.- Medir el volumen de amortiguador de cobertura requerido en cada caso, y colocarlo

en vaso de precipitado. Agregar el volumen de antisuero calculado en el paso anterior,

con una micropipeta; es recomendable realizar esta operación cerca de la llama de un

mechero para disminuir el riesgo de contaminación del antisuero. Agitar en un vórtex por

30-60 segundos para su adecuada incorporación.

4.- Agregar 100 µL de antisuero diluido en amortiguador de cobertura en cada pozo, de

acuerdo con el esquema de distribución previamente definido (paso1).

5.- Incubar la (s) placa (s) a temperatura ambiente y luz natural por 4 horas. Colocarla (s)

dentro de una bolsa de polietileno de tamaño adecuado conteniendo papel húmedo, para

evitar la evaporación del amortiguador.

6.- Por cada muestra, colocar 2 gramos del tejido vegetal fresco o congelado en una

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bolsita de polietileno grueso. Añadir 2 µL de amortiguador de extracción y macerar con

un pistilo de mortero.

NOTAS IMPORTANTES: 1 – Numere previamente las bolsas para evitar confusiones

con las muestras. 2 – Es recomendable iniciar este paso treinta minutos o una hora antes

de cumplirse el tiempo de la incubación de la (s) placa (s), con el fin de tener las muestras

ya maceradas en su momento. 3 – El pistilo del mortero debe mojarse continuamente en

agua destilada para evitar que rompa la bolsa de polietileno. 4 – Las muestras se

consideran maceradas cuando ya no se aprecian pedazos de tejido sin moler. 5 –Estas

deben conservarse en un recipiente con hielo para evitar la oxidación del tejido vegetal.

7.- Para cada muestra, añadir 200 µL del extracto obtenido en una bolsa u otro recipiente

que contenga 800 µL de amortiguador de la extracción. Con esto se obtiene una dilución

final 1:10(p/v).

8.- Lavar la(s) placa (s) con PBSt 1X tres veces.

PROCEDIMIENTO: 1 – Tomar la placa, con un movimiento del brazo dejarla caer

invertida. Suavemente y sin soltarla. Detener bruscamente el movimiento para que el

líquido salga del pozo sin contaminar a los demás. 2 – Llenar los pozos con PBSt 1x,

vaciando directamente del matraz o con pipetas (no importa si se derrama el PBSt 1X).

3 – Repetir los pasos 1 y 2 en dos ocasiones. 5 –Repetir el paso 1 mas de vez, para

completar los tres lavados. 6 – Secar la placa con papel absorbente, golpeando la placa

invertida sobre dos o más hojas de papel colocado sobre una mesa.

9.- Añadir 100 µL de la muestra diluida (paso 7) en los pozos correspondientes según

esquema previo (paso 1).

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10.- Incubar la (s) placas (s) a 4 °C (en el refrigerador) durante toda la noche.

Colocarla(s) dentro de una bolsa de polietileno de tamaño adecuado conteniendo papel

húmedo, para evitar la evaporación del amortiguador.

11.- Medir el volumen del amortiguador de conjugado requerido en cada caso, que debe

ser igual al calculado para amortiguador de cobertura en paso 2; colocarlo en un vaso de

precipitado. Agregar un volumen de conjugado (antisuero+fosfatasa alcalina) igual al

calculado para el antisuero en el paso 2 con una micropipeta; es recomendable realizar

esta operación cerca de la llama de un mechero para disminuir el riesgo de contaminación

del conjugado. Agitar en un vórtex por 30 un 60 segundos para su adecuada

incorporación.

12.- Lavar la (s) placa(s) con PBSt 1X tres veces, siguiendo el procedimiento del paso 8.

13.- Colocar 100 µL del conjugado diluido en cada pozo, de acuerdo con esquema previo

(paso1).

14.- Incubar la (s) placa(s) a temperatura ambiente y luz natural por 2 horas. Colocarla (s)

dentro de una bolsa de polietileno de tamaño adecuado conteniendo papel húmedo, para

evitar la evaporación del amortiguador.

15.- Preparar el volumen adecuado del amortiguador de sustrato (ver apartado 1.1.6).

Agregar una pastilla de PNP (Agdia, Inc.) por cada 10 µL de amortiguador de sustrato.

Mantener en agitación durante 2-5 minutos para su incorporación.

PRECAUSIONES: 1 – Iniciar la preparación de este amortiguador 40 minutos antes de

cumplirse el tiempo de incubación de la (s) placa (s). 2 – Mantener los recipientes del

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amortiguador cubiertos con papel aluminio para evitar su fotodegradación, pues podría

haber color en todos los pozos aun en los negativos. 3 –Disolver siempre pastillas

completas de PNP en amortiguador de sustrato, utilizar 10 µL, 20 µL, 30 µL, etc., Del

amortiguador según el volumen requerido para cubrir todos los pozos.

16.- Lavar la (s) placa (s) con PBSt 1X tres veces, siguiendo el procedimiento del paso 8.

17.- Colocar 100 µL del amortiguador de sustrato +PNP en cada pozo, cubriendo todos

los pozos útiles de la (s) placa (s).

18.- Incubar la (s) placa (s) a temperatura ambiente y obscuridad total por 20 minutos.

Colocarla (s) dentro de una caja de cartón o cubrirla (s) con papel aluminio; mantenerla

(s) dentro de la gaveta o en cualquier sitio muy obscuro.

19.- Revisar la (s) placa (s) para detectar la reacción positiva, que consiste en una

coloración amarilla. Si no hay reacción positiva (o ésta es débil) a los 20 minutos, incubar

por 10 minutos más. Repetir la operación cada 10 a 15 minutos hasta que el período de

incubación total sea de un máximo de 1 hora 30 minutos a 2 horas.

NOTAS IMPORTANTES: 1 – Buscar primero la reacción positiva en los testigos

positivos del (los) virus involucrado (s). 2 – Es posible mantener la (s) placa (s) en

incubación por más tiempo del señalado si la reacción tarda en aparecer, pero las

reacciones se consideran válidas solo mientras los testigos blancos se mantengan claros o

virtualmente claros. 3 – Una vez que la reacción positiva alcance la intensidad de color

adecuada, pueden añadirse 50 µL de NaOH 3M en cada pozo para detener la reacción

hasta por dos semanas, este paso es opcional, pues la reacción puede evaluarse visual y/o

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colorímétricamente sin necesidad de detener la reacción.

20.- Evaluar visualmente los resultados, o medir la absorbancia de cada pozo de la placa

(s) en un fotoclorímetro a una longitud de onda de 405 nm.

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7. ANEXO 2

FICHA UTILIZADA PARA COLECTA DE INFORMACION DE LA FINCA

 
ORGANISMO INTERNACIONAL REGIONAL DE SANIDAD AGROPECUARIA
OIRSA
PROYECTO REGIONAL DE FORTALECIMIENTO DE LA VIGILANCIA
FITOSANITARIA EN CULTIVOS DE EXPORTACIOIN NO TRADICIONAL
VIFINEX
MAESTRIA TECNOLÓGICA EN MEDIDAS SANITARIA Y FITOSANITARIAS
MSF
DETECCIÓN DE LOS VIRUS MOSAICO Y MANCHA ANULAR DEL
PAPAYO EN CARICA PAPAYA L.
EN COMAYAGUA, HONDURAS

No. de Finca ____________

Propietario: ____________________________________________________

UBICACIÓN

Departamento: ___________________ Municipio: _______________________

Aldea: _________________________ Caserío: __________________________

Dirección exacta:

Coordenadas Vertical: ______________


Horizontal: ______________
Altitud m.s.n.m.: ______________

DATOS DEL CULTIVO

Cultivar o variedad de papaya: ______________ Edad en meses: _____________

Etapa fenológica: _______________________ Área sembrada Mz.: _________

Fecha de visita: __________________ Encuesto: _________________

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ORGANISMO INTERNACIONAL REGIONAL DE SANIDAD AGROPECUARIA 
OIRSA 
PROYECTO REGIONAL DE FORTALECIMIENTO DE LA VIGILANCIA FITOSANITARIA EN 
CULTIVOS DE EXPORTACIOIN NO TRADICIONAL 
VIFINEX 
MAESTRIA TECNOLÓGICA EN MEDIDAS SANITARIA Y FITOSANITARIAS 
MSF 
DETECCIÓN DE LOS VIRUS MOSAICO Y MANCHA ANULAR DEL PAPAYO EN CARICA
PAPAYA L.
EN COMAYAGUA, HONDURAS 

INFORMACION BASICA DE LA MUESTRA

No. Finca:_______________ Muestra:____________

Fecha de la colecta:___________ Hora colecta: __________ Colecto:___________

Cultivar /variedad:________ Edad (meses): __________ Etapa fenológica:__________

Descripción de la muestra: _________________________

Síntomas observados:

_______________________________________________________________________

No. Finca : ______________ Muestra: _________________

Fecha de la colecta:___________ Hora colecta: __________ Colecto:___________

Cultivar /variedad:________ Edad (meses): __________ Etapa fenológica:__________

Descripción de la muestra: _________________________

Síntomas observados:

_______________________________________________________________________

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