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Échafaudage de gélatine réticulée gomme arabique modifié pour des applications

biomédicales

Le présent travail concerne le développement d'un échafaudage de gélatine réticulée gomme


arabique modifiée pour la culture cellulaire. Un nouvel échafaudage biocompatible a été
développé en réticulant la gélatine (Gel) avec de la gomme arabique, un polysaccharide. La
gomme arabique a été soumise à une oxydation par jour pour obtenir de la gomme arabique
aldéhyde (GAA). GAA a été mis à réagir avec de la gélatine sous un pH approprié pour
préparer l'hydrogel réticulé. La réticulation s'est produite en raison de la réaction de base de
Schiff entre les groupes aldéhyde de la gomme arabique oxydée et les groupes amino de la
gélatine. L'échafaudage préparé à partir de l'hydrogel a été caractérisé par des propriétés de
gonflement, le degré de reticulation, la dégradation in vitro et la microscopie électronique à
balayage (MEB). L'évaluation de la cytocompatibilité à l'aide de cellules L-929 et HepG2 a
confirmé la nature non cytotoxique et non adhérente de l'échafaudage. Ces propriétés sont
essentielles pour générer des sphéroïdes multicellulaires et, par conséquent, l'échafaud est
proposé pour être un candidat approprié pour la culture de cellules sphéroïdes.

1. Introduction

Le collagène est une protéine structurelle majeure présente dans le corps humain et la gélatine
est dérivée par dénaturation partielle du collagène. La gélatine est largement utilisée dans les
applications biomédicales en raison de son absence d'antigénicité, de sa non-immunogénicité,
de sa biodégradabilité et de sa biocompatibilité [1]. La gélatine a été largement utilisée sous la
forme de coacervatifs, d'hydrogels, de micro et de nanoparticules pour l'administration de
médicaments et les applications d'ingénierie tissulaire [2-5]. Récemment, l'hydrogel de
gélatine-carraghénane a été étudié pour l'administration contrôlée de quercétine (Q, 3,5,7,3 ',
4'-pentahydroxyflavone), un membre de la famille des flavonoïdes [6]. La gélatine possède de
nombreux sites de liaison de l'intégrine pour l'adhésion et la différenciation cellulaire, ce qui
la rend appropriée pour être utilisée dans des applications d'ingénierie tissulaire [7,8]. Des
études détaillées sur les propriétés calorimétriques et le comportement dynamique de l'eau à
l'interface des mélanges gélatino-glycosaminoglycanes ont été rapportées [9,10]. (Voir le
schéma 1.)

Des agents de réticulation tels que le glutaraldéhyde [11], l'hexaméthylènediisocyanate, le


carbodiimide [12] et les acylazides [7] sont utilisés pour la réticulation de la gélatine afin
d'améliorer la résistance à l'eau [13], la stabilité thermique et les propriétés mécaniques. Ces
substances, si elles sont libérées dans le corps en raison de la dégradation ou de la non-
réaction dans les structures, seraient à l'origine de la toxicité [14, 15].

Par conséquent, il y a eu de nombreuses tentatives pour préparer des échafaudages à base de


gélatine en évitant des agents de reticulation toxiques. Des hydrogels de gélatine, stabilisés
par des polysaccharides partiellement oxydés tels que le dextrane, l'acide alginique, le sulfate
de chondroïtine et la carboxyméthylcellulose ont été rapportés dans la littérature [16-20]. Ces
hydogels ont été développés pour être utilisés comme pansements, adhésifs tissulaires et
échafaudages pour l'ingénierie tissulaire. Cela s'est avéré être une excellente méthode de
stabilisation également pour les molécules de protéines telles que le collagène et le chitosane
et a permis le remplacement des agents de réticulation toxiques. Balakrishnan et al. utilisé
cette voie pour préparer des hydrogels injectables à base de gélatine et d'alginate oxydé [21].
La réticulation rapide entre les groupes amino de la gélatine et les groupes aldéhyde de
l'alginate oxydé conduit à la formation d'hydrogel en présence de borax dans un milieu
aqueux. Des articles récents de Boanini et al. et Yang et al. examiner également la
biocompatibilité de l'alginate réticulé gélatine et des matrices de collagène [22,23].

Les échafaudages jouent un rôle important dans l'ingénierie tissulaire [24-27]. Les
échafaudages à base de biopolymères sont polyvalents en raison de leur non toxicité et de leur
haute fonctionnalité [28]. Dans cette étude, nous avons exploré la possibilité d'utiliser une
gomme naturelle, à savoir la gomme arabique comme agent de réticulation pour l'échafaudage
à base de gélatine. Gumarabic (GA) est un biocompatible, non toxique, soluble dans l'eau,
gumobtained naturel d'acacia. Il s'agit d'un polysaccharide complexe ramifié, légèrement
acide, contenant des résidus d'arabinose, de rhamnose, de galactose et d'acide glucoronique
avec un squelette constitué de 1,3 unités β-Dgalactopyranosyle liées. Les chaînes latérales
sont composées de deux à cinq unités β-D-galactopyranosyles 1,3 liées à la chaîne principale
par 1,6 liaisons [29].

C'est un polysaccharide peu coûteux qui est largement utilisé comme agent stabilisant,
émulsifiant et épaississant dans l'industrie alimentaire. Les conjugués de gomme arabique et
de drogue ont été étudiés pour des applications contrôlées de délivrance de médicaments [30,
31]. Des microparticules à base de gomme arabique et des nanoparticules ont déjà été
rapportées dans la littérature [32-37]. La gomme arabique a également été utilisée comme
agent de modification de surface et comme construction phytochimique non toxique pour les
nanoparticules métalliques [36, 38, 39]. Reis et al. Ont modifié la gomme arabique avec du
méthacrylate de glycidyle pour préparer des hydrogels sensibles au pH pour les
nanoparticules magnétiques [40].

Bien que l'AG ait été proposée comme biomatériau potentiel, son utilisation dans les
échafaudages pour l'ingénierie tissulaire n'a pas encore été explorée. Dans cette étude, la
possibilité d'utiliser de la gomme arabique modifiée comme stabilisant pour la gélatine a été
explorée. La gomme arabique a été modifiée par oxydation au periodate et caractérisée. La
gélatine a été réticulée avec de la gomme arabique oxydée, ce qui a conduit au développement
d'un échafaudage à base de gélatine et de gomme arabique.

L'échafaud a été développé, caractérisé et évalué pour sa cytocompatibilité et son adhésion


cellulaire. Les études ont démontré que l'échafaudage est non cytotoxique et présente des
caractéristiques non adhérentes. Par conséquent, l'échafaudage peut fonctionner comme un
substrat pour la culture de cellules sphéroïdes qui nécessite une surface non adhérente, où les
cellules adhèrent les unes aux autres pour atteindre une architecture tissulaire avec moins
d'adhérence au substrat [41, 42].

2. Matériels et méthodes

2.1. Matériaux
Gomme arabique (d'acacia) de poids moléculaire approximatif 250 kDa, gélatine (type A),
métaperiodate de sodium, tétraborate de sodium (borax), acide trinitrobenzènesulfonique
(TNBS), milieu essentiel minimal (MEM), rouge neutre, iodure de propidium (PI) , le
diacétate de fluorescéine (FDA) et le glutaraldéhyde ont été achetés auprès de Sigma Aldrich,
Saint Louis, USA. Le chlorure de sodium, l'hydrogénophosphate disodique, le
dihydrogénophosphate de sodium, le nitrate d'argent, le chlorhydrate d'hydroxylamine,
l'hydrogénocarbonate de sodium, l'hydroxyde de sodium et l'isopropanol ont été obtenus
auprès de Merck (Mumbai, Inde). L'EDTA de trypsine (0,25%, 0,02%) a été obtenu auprès
d'Invitrogen, USA. Des tubes de dialyse (6000-8000 MWCO) ont été achetés auprès de
Spectrum Laboratories Inc., CA, USA. De l'eau bidistillée a été utilisée dans toutes les
expériences de synthèse et de l'eau Milli Q (Millipore) pour le travail de culture cellulaire.

Tableau 1 : Caractéristiques de gélification de GAA-1 et GAA-2 avec de la gélatine.

2.2. Préparation de gomme arabique oxydée

La gomme arabique a été oxydée en gomme arabique aldéhyde (GAA) en utilisant du


métaperiodate de sodium [33,34]. 10 g (0,058 mole) de gomme arabique ont été dissous dans
80 ml d'eau distillée et la quantité requise de periodate de sodium a été dissoute dans 20 ml
d'eau (pour 10% d'oxydation, 1,24 g, 0,0058 mole et 20%, 2,48 g, 0,0116 mol).

Une solution de periodate de sodium a été ajoutée à une solution de gomme arabique et le
mélange réactionnel a été agité avec un agitateur magnétique à 20 ° C pendant 6 h dans
l'obscurité. La purification a été effectuée par dialyse en utilisant un tube de dialyse de
MWCO 6000-8000 pendant trois jours contre de l'eau distillée. L'absence de periodate dans le
dialysat a été vérifiée en ajoutant 1 ml de solution à 1% de nitrate d'argent à 1 ml du dialysat.
Après l'élimination complète du periodate (pas de turbidité avec le nitrate d'argent), le dialysat
a été congelé et lyophilisé. La gomme arabique oxydée a été obtenue avec un rendement élevé
de 80 à 85%.

2.3. Études de viscosité

Les viscosités intrinsèques de la gomme arabique et de l'aldéhyde de la gomme arabique ont


été mesurées en utilisant un viscosimètre Ostwald. Des solutions mères de GA, 10% et 20%
de gomme arabique oxydée (GAA-1 et GAA-2 respectivement) ont été préparées dans du
borax 0,1 M. A partir de la solution mère, des solutions diluées (1%, 2%, 3% et 4%, p / v) ont
été préparées en utilisant du borax. Une solution de borax (15 ml, 0,1 M) a été introduite dans
le viscosimètre et son temps d'écoulement a été mesuré (t0). Le temps d'écoulement (t) pour
toutes les solutions a été déterminé comme ci-dessus et la viscosité intrinsèque a été
déterminée en plaçant le graphique entre ηred (viscosité réduite) et ηinh (viscosité inhérente).

2.4. Détermination de la teneur en aldéhyde


La teneur en aldéhyde dans la gomme arabique oxydée a été déterminée par titrimétrie [16].
GAA-1 (0,1 g) et GAA-2 (0,1 g) ont été dissous dans 25 ml d'une solution aqueuse 0,25 N de
chlorure d'hydroxylammonium.

L'acide chlorhydrique libéré résultant de la réaction du groupe aldéhyde dans le GAA avec du
chlorure d'hydroxylammonium a été titré contre du NaOH 0,1 N. On a utilisé comme
indicateur un mélange de méthyl-orange (solution à 0,05%, poids / volume).

Au point final, la solution de couleur rouge a été changée en jaune. Le nombre de moles de
NaOH consommé est équivalent au nombre de moles d'aldéhyde présentes dans l'échantillon.

Schéma 1. L'aldéhyde de gomme arabique est réticulé avec de la gélatine en présence de


borax.

2.5. Préparation d'hydrogel de gomme arabique-gélatine et d'échafaudage (GGA)

Les échafaudages ont été préparés à partir de gomme arabique oxydée et de gélatine. Ceci est
basé sur la réaction de base de Schiff entre les groupes amino libres de la gélatine et les
groupes aldéhydes de la gomme arabique aldéhyde (GAA). La solution de GAA-1 et la
solution de GAA-2 ont été préparées dans du borax 0,1 M et une solution de gélatine à 10% (p
/ v) a été préparée dans de l'eau distillée. Une solution de GAA-1 ou GAA-2 (0,5 ml) a été
prélevée dans un flacon en verre et 0,5 ml de solution de gélatine a été ajouté et vortexé à 37 °
C pour obtenir l'hydrogel.

La gélification s'est produite très rapidement, conduisant à la formation d'un hydrogel clair et
lisse. L'hydrogel ainsi obtenu a été congelé et lyophilisé pendant 12 h. Les échantillons ont
ensuite été rincés avec de l'eau distillée pour éliminer le borax et lyophilisés pendant 24 h
supplémentaires pour obtenir les échafaudages (GGA-1 et GGA-2).

2.6. Temps de gélification


Le temps de gélification de GAA-1 et GAA-2 avec de la gélatine a été déterminé. Les
solutions de GAA ont été préparées soit dans du borax 0,1 M, soit dans du PBS. Des quantités
égales (0,5 ml) de solutions à 10% (poids / volume) de GAA et de gélatine ont été prises dans
un flacon en verre de 5 ml de capacité et vortexées. Le temps de gélification a été déterminé
comme étant le temps nécessaire pour que les deux solutions se réticulent complètement et
forment un gel solide au vortex. La réaction de reticulation a été réalisée à 37 ° C. Toutes les
valeurs rapportées sont la moyenne de 4-5 déterminations.

2.7. Degré de réticulation

Le test TNBS a été utilisé pour déterminer le degré de réticulation [17]. Environ 50 mg
d'échafaudage GGA-1 et GGA-2 ont été traités avec 1 ml de solution de bicarbonate de
sodium à 4% et une solution de TNBS à 0,05% (p / v). Le mélange a été chauffé à 60 ° C
pendant 4 heures. A 1 ml de ce mélange, 3 ml de HCl 6N ont été ajoutés et chauffés à 40 ° C
pendant une heure et demie et l'absorbance a été mesurée par spectrophotométrie
(Spectrophotomètre UV-Visible CarylOO, USA) à 334 nm. Le degré de reticulation a été
trouvé par l'équation suivante. (1):

2.8. Analyse morphologique

La morphologie de l'échafaudage GGA-1 a été analysée à l'aide d'un microscope électronique


à balayage (MEB). Les échantillons ont été placés sur du ruban adhésif double face,
pulvérisés avec de l'or et examinés sous SEM (Hitachi, modèle S 2400, Japon). La porosité de
l'échafaudage (GGA-1) a été déterminée en utilisant une tomographie micro-informatique
(Micro-CT). L'échantillon a été découpé en un disque circulaire de 10 mm de diamètre et
imagé (Scanco Medical Micro CT, modèle μCT40, Suisse). Environ 511 projections de 3072
octets ont été acquises pour chaque tomogramme. La tension de la source de rayons X a été
réglée à 45 kV et le courant de faisceau à 177 μA.
Fig. 1. (a) Hydrogel transparent (GGA-1) formé après vortexage de GAA-1 et de gélatine et
(b) échafaudage obtenu par lyophilisation de l'hydrogel transparent.

2.9. Etudes de gonflement de l'échafaudage

Des études de gonflement ont été réalisées sur des échafaudages GGA-1 et GGA-2. Les
échafaudages ont été préparés comme décrit précédemment. Des échafaudages pesés avec
précision ont été immergés dans des flacons contenant 5 ml de solution saline tamponnée au
phosphate (PBS). À intervalles réguliers, le PBS a été aspiré et les échafaudages ont été
doucement épongés avec du papier filtre, puis pesés. Toutes les expériences ont été réalisées
en trois exemplaires. Le taux de gonflement a été calculé à partir de l'équation. (2) [43].

Rapport de gonflement;

où Ws et Wd sont respectivement les poids des échafaudages gonflés et secs.

Le degré de gonflement (Q) de l'échafaudage a été déterminé par l'équation. (3). Il est défini
comme l'inverse de la fraction volumique du polymère dans l'échafaudage gonflé (ν2).

où ρp est la densité du polymère (0,653 g / cm3), ρs est la densité de l'eau (0,9971 g / cm3 à
25 ° C) et Qm est le taux de gonflement [44].

2.10. Études de dégradation


Les caractéristiques de dégradation des échafaudages ont été étudiées dans du PBS. Des
échantillons préalablement pesés et séchés ont été immergés dans 5 ml de PBS à 37 ° C
pendant des durées allant d'une semaine à quatre semaines. Expériences

ont été réalisées dans des conditions aseptiques. Différents ensembles d'échantillons ont été
utilisés pour chaque semaine. Après le temps stipulé, le milieu a été enlevé et le poids de
l'échantillon a été vérifié après lyophilisation [45] et le rapport en poids a été calculé par Eq.
(4).

W1 et W2 sont les poids initial et final de l'échantillon.

2.11. Cytotoxicité et évaluation de la viabilité cellulaire

Des études de culture cellulaire ont été réalisées en utilisant une lignée cellulaire
fibroblastique de tissu conjonctif murin (L-929) [American Type Cell Cultures, USA] et une
lignée cellulaire d'hépatosarcome humain (HepG2) [Centre National pour les Sciences
Cellulaires, Inde]. Les cellules L-929 ont été cultivées dans du milieu essentiel minimum
(MEM: Gibco, USA) contenant 5% de sérum fœtal bovin (FBS: Gibco, USA) et 100 Ul / ml
de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine (PAA Laboratories, Allemagne). Les cellules
HepG2 ont été maintenues dans le milieu modifié de Dulbeccos d'Iscoves (IMDM: Gibco,
USA) contenant 2% de FBS et des antibiotiques.

La cytotoxicité a été évaluée par une méthode de contact direct utilisant des cellules L-929 et
HepG2. La monocouche cellulaire a été traitée avec une solution de trypsine et 1 x 105
cellules ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits contenant du milieu de culture.

Lorsque les cellules ont atteint la sous-confluence, des échafaudages GGA-1, un témoin
négatif (polyéthylène haute densité) et un témoin positif (chlorure de polyvinyle stabilisé)
ayant une taille cellulaire approximative de 10% ont été conservés. La réponse cellulaire
autour du matériau a été évaluée à 24 h sous un microscope à contraste de phase inversé
(Leica DMI 6000, Allemagne) et comparée au contrôle négatif et positif.

A la fin du test de cytotoxicité par contact direct, le milieu a été remplacé par du rouge neutre
(0,5 mg / ml) dans une solution saline. Après 5-10 min, une solution rouge neutre a été retirée
et les cellules ont été rincées avec du PBS. La viabilité cellulaire a été observée sous un
microscope inversé (Leica DMIL, Allemagne).

2.12. Adhésion cellulaire sur GGA-1


L'adhérence cellulaire sur l'échafaudage GGA-1 a été analysée en ensemençant les cellules L-
929 et HepG2 à une concentration de 5000 cellules / cm2 et laissé adhérer et croître pendant
48 h. Les échafaudages ensemencés en cellules ont été contrôlés sous un microscope à
contraste de phase, contrôlés et analysés pour la viabilité cellulaire et traités pour SEM. La
viabilité des cellules adhérées sur les échafaudages GGA-1 a été analysée par incubation avec
FDA (10 μg / mL en milieu sans sérum) pendant 5 min suivi d'un traitement par PI (0,1 μg /
mL) et observation sous microscope à fluorescence ou confocal à balayage laser. microscope
(Carl Zeiss 510 Meta, Allemagne) pour visualiser les cellules vivantes en vert et les cellules
mortes en rouge. Les cellules adhérant à GGA-1 ont également été analysées par MEB. Les
cellules ont été fixées en utilisant du glutaraldéhyde à 3% pendant 1 h et ont été déshydratées
dans de l'alcool gradué suivi par un séchage au point critique. Les échantillons ont été revêtus
d'or en utilisant un dispositif de pulvérisation ionique (Hitachi, E 101) et la morphologie
cellulaire a été observée sous SEM (Hitachi S 2400, Japon).
Fig. 2. (a) Image SEM de l'échafaudage GGA-1, (b) distribution de l'épaisseur de paroi de
l'échafaudage GGA-1 et (c) distribution de la taille des pores de l'échafaudage GGA-1 par
Micro-CT.

2.13. Test métabolique cellulaire

Un test d'élution a été réalisé avec l'extrait de GGA-1 sur des cellules L-929 cultivées dans
une plaque à 96 puits avec une densité d'ensemencement initiale de 5000 cellules / puits.
L'extrait a été préparé en incubant GGA-1 dans du MEM contenant du sérum à 37 ° C
pendant 1, 7, 14, 21 et 27 jours. L'extrait original a été dilué à 50 et 25% avec culturemedium.

A la fin de chaque point temporel, le milieu de culture des cellules L929 subconfluentes a été
remplacé par différentes concentrations d'extrait (25%, 50% et 100%) et incubé pendant 24 h
à 37 ° C dans un incubateur à CO2. Les cellules cultivées en milieu normal dans des
conditions similaires pour chaque point temporel ont été considérées comme contrôle. Les
cellules ont ensuite été traitées avec du réactif MTT (0,5 mg / ml dans du sérum exempt de
MEM) et incubées de nouveau pendant 2 heures à 37 ° C. Le réactif MTT a été remplacé par
100 ul d'isopropanol pour dissoudre les cristaux de formazan formés par l'activité cellulaire.

L'absorbance a été mesurée dans un spectrophotomètre (BioTek, USA) à 570 nm et la densité


optique des cellules traitées avec des extraits a été comparée à celle du témoin. Le
pourcentage d'activité cellulaire et la signification statistique ont été calculés à l'aide de
l'analyse de données Microsoft Excel.

Outil.

3. Résultats et discussion

3.1. Préparation de gomme arabique oxydée

La gomme arabique est un polysaccharide hautement ramifié et complexe. Les groupes


hydroxyle vicinaux dans sa structure ont été clivés par du periodate en dialdéhyde. Cette
méthode est avantageuse pour la préparation du dialdéhyde du polysaccharide car le périodate
résiduel peut être facilement éliminé par dialyse. En faisant varier la quantité de periodate,
gumarabic avec différentes teneurs en aldéhyde peut être préparé. Ehrenfreund-Kleinman et
al. rapportent l'oxydation au periodate de l'arabinogalactane pour la préparation de conjugués
d'amphotéréline B arabinogalactane solubles dans l'eau. Ils ont trouvé qu'après l'oxydation du
periodate, il n'y avait pas de changement significatif dans le poids moléculaire [46].

Les viscosités intrinsèques de la gomme arabique oxydée (0,10 g / dL et 0,18 g / dL pour


GAA-1 et GAA-2 respectivement) ne diffèrent pas significativement de la gomme arabique
non oxydée (0,09 g / dL) indiquant le poids moléculaire stable même après oxydation. Une
légère augmentation de la viscosité intrinsèque observée pour les échantillons oxydés par
rapport au gabarabique suggère l'absence de clivage du squelette lors de l'oxydation par
opposition à une dégradation importante rapportée pour l'oxydation des polysaccharides
linéaires comme le dextran et l'alignate [21,45]. Le rendement élevé du produit oxydé
confirme également l'absence de clivage du squelette. Dans le présent travail, de la gomme
arabique oxydée a été préparée avec différents rapports molaires de polysaccharide / periodate
(1: 0,1, 1: 0,2 pour 10% et 20% d'oxydation respectivement). La teneur en aldéhyde dans les
GAA oxydés à 10% et 20% est respectivement de 1,125 x 10-3 mol / g et de 2,425 x 10-3 mol
/ g.

3.2. Préparation d'hydrogel de gomme arabique-gélatine et d'échafaudage

L'échafaudage de gomme arabique-gélatine (GGA) a été préparé sur la base de la réaction de


reticulation de base de Schiff. La base de Schiff est formée par la réticulation de groupes
aldéhyde dans GAA et de groupes amino libres de groupes latéraux de lysine ou
d'hydroxylamine de gélatine. La réaction des groupes aldéhyde et amino à travers la formation
de base de Schiff a été explorée pour la préparation de matrices de libération de médicaments
[45,47], d'échafaudages pour l'ingénierie tissulaire [18], etc. Sauf pour la préparation
d'échafaudages d'alginate oxydé [21] la préparation de conjugués médicamenteux à partir de
la gomme arabique [30,31] les réactions de réticulation ont été rapportées comme étant lentes
avec un temps de réticulation allant de 4 à 6 min. Balakrishnan et al. ont trouvé que lorsque la
réaction de reticulation était réalisée en présence de borax (pH 9,1), la formation d'hydrogel se
produisait en quelques secondes et le temps de gélification variait légèrement en fonction du
degré d'oxydation [21].

Dans le présent travail, la reticulation et la formation d'échafaudage ont été réalisées en


utilisant une solution à 10% (en poids / volume) de GAA dans du borax 0,1 M avec une
solution aqueuse de gélatine. Le borax se dissocie en quantités égales d'acide borique et de
borate en milieu aqueux selon l'équation. (5)

Le borate peut subir une complexation avec des groupes hydroxyle de polysaccharides et
former des complexes mono ou di [48-50]. Ainsi, la capacité de complexation du borax et le
pH alcalin du borax 0,1 M (9,1) améliorent grandement la réaction de réticulation, ce qui
entraîne une gélification rapide [21]. La gélification a également été effectuée dans du PBS au
lieu du borax. Dans les expériences où du borax était utilisé, la gélification se produisait en
moins d'une minute, produisant des hydrogels transparents clairs, tandis que dans le PBS, la
formation du gel était retardée, confirmant le rôle du borax dans la gélification plus rapide
(Tableau 1). Par conséquent, d'autres réactions de reticulation ont été réalisées dans le borax.

D'après le tableau 1, il est clair que le temps de gélification dépend du pourcentage


d'oxydation de GAA et de la concentration de gélatine. Le temps de gélification diminue avec
l'augmentation du pourcentage d'oxydation. Cela est dû à la disponibilité accrue des groupes
fonctionnels pour la réaction de réticulation avec l'augmentation du pourcentage d'oxydation.
Une réaction de reticulation en présence de borax a conduit à la formation d'un hydrogel
transparent transparent, qui a été lyophilisé pour obtenir l'échafaudage (figure 1).

3.3. Analyse morphologique

La thémorphologie de l'échafaud a été étudiée en utilisant la microscopie électronique à


balayage et Micro CT. Les images SEM (figure 2, a) ont montré que l'échafaudage était très
poreux avec une étendue limitée d'interconnectivité. L'interconnectivité dans l'échafaudage
peut être encore améliorée en utilisant des techniques telles que la lixiviation des porogènes.
D'après l'analyse par micro-scanner, la porosité s'est révélée être de 82,5% et l'épaisseur
moyenne de la paroi était de 36 μm (Fig. 2, b et c). La taille des pores de l'échantillon variait
de 120 μm à 300 μm et la densité de connectivité était de 280 mm3.

3.4. Etudes de gonflement de l'échafaudage

La capacité de gonflement de l'échafaudage est un paramètre important tout en considérant


son application dans l'ingénierie tissulaire, car elle influence directement la diffusion des
nutriments et le mouvement des cellules sur l'échafaudage.

Le gonflement augmente la taille des pores et aide ainsi les cellules à migrer à l'intérieur de
l'échafaudage. Les caractéristiques de gonflement et de dégradation de l'échafaudage de
gomme arabique-gélatine dépendent de l'étendue de la réticulation, qui à son tour est régulée
par la disponibilité de groupes aldéhyde et amino pour la réaction.

Les propriétés de gonflement ont été déterminées en étudiant le taux de gonflement (Qm) par
Eq. (2) et le degré de gonflement (Q) par Eq. (3) (tableau 2).

Les échafaudages ont atteint un gonflement à l'équilibre en 5 h. Échafaudage préparé en


utilisant 20% de GA oxydé (GGA-2) a montré moins de rapport de gonflement et le degré de
gonflement que celui de l'échafaudage avec 10% de GA oxydé (GGA-1) (tableau 2). Les
échafaudages GGA-1 et GGA-2 ont montré des taux de gonflement de 66% et 56%
respectivement après 1 h et les valeurs ont augmenté jusqu'à la fin de 5 h pour atteindre
l'équilibre. De même, GGA-2 a montré un plus faible degré de gonflement par rapport à
GGA-1. La densité de réticulation (νe) a également été calculée à partir des résultats d'études
de gonflement utilisant Flory-Rehner Eq. (6),

où, ν2 est la fraction volumique du polymère dans l'échafaudage, V1 est le volume molaire de
l'eau (18,062 cm3 / mol), χ1 est l'interaction

où, v2 est la fraction volumique du polymère dans l'échafaudage, V1 est le volume molaire de
l'eau (18,062 cm3 / mol), χ1 est le paramètre d'interaction et f est la fonctionnalité de
réticulation. Le paramètre d'interaction χ1 a été pris pour être 0.35 [45]. On sait que 100 g de
gélatine contiennent respectivement environ 100, 75 et 50 milliéquivalence de groupes
hydroxyle, carboxyle et amino [51]. On a supposé que la fonctionnalité de la gélatine par
rapport aux groupes amino était de 50. En raison de la disponibilité accrue de groupes CHO
dans l'AG oxydée à 20%, l'échafaudage GGA-2 présentait une densité de réticulation plus
élevée que celle des GGA. 1. Ceci est en accord avec la diminution du taux de gonflement et
le degré de gonflement avec une augmentation du pourcentage d'oxydation.

En outre, le degré de reticulation a été déterminé par dosage TNBS en utilisant Eq. (1) en
termes de groupes amino n'ayant pas réagi de gélatine. Encore une fois, GGA-2 présentait un
degré de réticulation plus élevé que GGA-1 (tableau 2).

Tableau 2: Résumé des études de gonflement des échafaudages, GGA-1 et GGA-2.

3.5. Études de dégradation

Le comportement de dégradation des échafaudages dans le PBS par rapport à la perte de poids
n'a montré aucune diminution significative jusqu'à quatre semaines. Il n'y avait pas beaucoup
de différence dans le schéma de dégradation des échafaudages GGA-1 et GGA-2. Cette
caractéristique prouve la stabilité de l'échafaudage (figure 3).

Fig. 3. Schémas de dégradation de GGA-1 et GGA-2 jusqu'à un mois.


Fig. 4. Évaluation de la cytotoxicité de l'échafaudage GGA-1 confirmée par coloration de
viabilité. Les cellules L-929 (a) et les cellules HepG2 (b) autour de l'échafaudage présentent
une morphologie normale par rapport aux témoins négatifs respectifs (c et d). Les cellules L
929 et HepG2 autour du contrôle positif montrent une cytotoxicité sévère (e et f).

3.6. Cytotoxicité et évaluation de la viabilité cellulaire

L'échafaudage GGA-1 a été sélectionné pour l'évaluation de la cytotoxicité, l'adhésion


cellulaire et le dosage des cellules métaboliques car il a été préparé avec une quantité moindre
de groupes aldéhyde. Les lignées cellulaires L-929 et HepG2 ont été utilisées pour les études.

Les cellules autour de l'échafaudage GGA-1 ont maintenu la morphologie cellulaire originale
et ont confirmé leur viabilité en raison de l'absorption du colorant rouge neutre (figures 4, a et
b). La réponse des cellules à l'échantillon d'essai a été comparée avec des matériaux de
contrôle négatifs et positifs parallèles. Le contrôle négatif (HDPE) a montré une non-
cytotoxicité et le contrôle positif (PVC) a montré une cytotoxicité sévère lors de l'incubation
avec L-929 et HepG2 (figure 4, c-f).

3.7. Adhésion cellulaire sur GGA-1


L'adhésion cellulaire est un paramètre clé dans l'évaluation in vitro des biomatériaux [52]. En
plus des facteurs physiques et biologiques qui influencent l'adhésion cellulaire, il existe une
corrélation directe entre la charge de surface et l'adhésion de la cellule sur une surface [53].
Les cellules L-929 ont adhéré à l'échafaudage GGA-1 lorsqu'elles ont été incubées pendant 48
h, mais les cellules n'ont pas pu se propager et exprimer une morphologie caractéristique du
fuseau. Les cellules ont été visualisées sous forme de cellules rondes formant principalement
des amas (figure 5).

Comme le matériel s'est révélé non cytotoxique par un test de contact direct, une analyse plus
poussée a été effectuée pour confirmer la viabilité des cellules exprimant la morphologie
ronde. La coloration morte vivante des cellules ensemencées sur un échafaudage a confirmé
que les cellules étaient viables (figure 6, a et b) même si elles n'ont pas atteint la morphologie.
Les cellules observées à fort grossissement sous SEM ont révélé la présence de filopodes au
contact cellule-matériau (figures 6, c et d). Le contact cellule-cellule a également été observé
partout où il y avait un groupe de cellules et formé des agrégats de type sphéroïde. Cela
confirme la non-cytotoxicité, en même temps la propriété de non-adhérence de l'échafaudage
GGA-1. La nature poreuse a entraîné le piégeage des cellules et la formation de sphéroïdes
induits par la surface non adhérente. La taille des pores a également permis de limiter la taille
des sphéroïdes et a aidé à éviter les grands agrégats cellulaires avec un transfert de masse
entravé à l'intérieur de sphéroïde. La faible énergie interfaciale à la surface des échafaudages
enflés la rend généralement non adhérente aux cellules [54].

Il a été rapporté que le dextran, lorsqu'il est immobilisé sur le verre et le plastique, limite
efficacement l'adhésion cellulaire [52]. Hydrogels avec de telles propriétés sont proposées
pour la surfacemodification pour obtenir une interaction cellule-matériau spécifique pour une
meilleure performance dans les applications biomédicales.

Puisque GGA a également la capacité de conserver la viabilité cellulaire et la propriété


d'étalement des cellules, une analyse plus poussée de ce matériau le rendra apte à affiner
l'adhésion cellulaire sur les biomatériaux [55]. Modèle sphéroïde multicellulaire ressemble à
des tissus ayant des propriétés structurelles et fonctionnelles appropriées et est un outil
précieux dans le dépistage de la toxicité des médicaments et la recherche sur le cancer [56-
58].

Fig. 5. Adhésion cellulaire sur échafaudage GGA-1. (a) des cellules L-929 et (b) des cellules
HepG2 cultivées sur des échafaudages pendant 48 h et observées sous un microscope à
contraste de phase. Les cellules ont montré une morphologie ronde et ont tendance à former
des amas à l'intérieur des pores et de la surface de l'échafaudage.

Fig. 6. Confirmation de viabilité des cellules adhérentes (a) cellules L-929 et (b) HepG2
cultivées sur des échafaudages incubés avec FDA et observés au microscope à fluorescence.
Les images (c) et (d) montrent l'adhérence des cellules L-929 et HepG2 observées
respectivement sous MEB. Même si les cellules sont rondes en morphologie et vivent sur
l'échafaudage, elles expriment des extensions filopodiales.

Fig. 7. Dosage MTT de cellules L-929 exposées à 100% d'extrait d'échafaudage GGA-1
obtenu à différents moments. Les cellules ont montré plus de 85% d'activité métabolique du
1er au 27ème jour, avec la valeur la plus élevée de 110,78% le 1er jour et la valeur la plus
basse de 86,36% le 21ème jour. [* p = 0,001].

3.8. Test métabolique cellulaire

L'activité métabolique cellulaire déterminée par le test MTT a confirmé que les cellules
exposées à diverses concentrations d'extrait de GGA-1 ne présentaient aucun effet indésirable.
Les cellules exposées à l'extrait à 100% et moins (données non incluses) ont montré une
activité métabolique supérieure à 85% (comprise entre 110,38 et 86,36%) tout au long du 1er
jour au 27ème jour (figure 7). Cela prouve qu'il n'y a pas de lixiviat cytotoxique provenant de
l'échafaudage même après 27 jours et aussi déduire la stabilité de l'échafaud comme observé
dans les études de dégradation (figure 3). L'effet non cytotoxique après une durée d'extraction
prolongée et la stabilité révèle sa pertinence pour les systèmes de culture in vitro.

4. Conclusions
Nous rapportons un nouvel échafaud non cytotoxique, cytocompatible de la gélatine et de la
gomme arabique sans utiliser d'agents de reticulation externes. La gélatine a été réticulée avec
succès avec de la gomme arabique qui a été oxydée en son dialdéhyde par oxydation au
periodate pour former l'échafaudage. L'échafaudage a été caractérisé par SEManalyse,
caractéristiques de gonflement, degré de réticulation et études de dégradation. L'évaluation de
la cytotoxicité s'est révélée non cytotoxique et cytocompatibilité du matériau, tandis que les
études d'adhésion cellulaire ont indiqué la nature non adhérente de l'échafaudage. Cet
échafaudage non adhérent et cytocompatible peut être utilisé comme substrat approprié pour
générer une culture de cellules sphéroïdes tridimensionnelles pour le criblage de
médicaments, la recherche sur le cancer et la matrice à lit garni dans des bioréacteurs.

Remerciements

Les auteurs remercient le Directeur, IIST pour le soutien financier et le Directeur, SCTIMST
pour les facilités fournies.