Taller de Investigación I 

 
 
 
 
 
 
Anteproyecto 
¨Desarrollo de una técnica de micropropagación de especies para la 
replicación de orquídeas mexicanas para su preservación¨ 

Presentado por:  
Rincón Quezada Maria Isabel 15211257 
 
 
Profesora Norma Beatriz Torrontegui 
 
 
Tijuana Baja California a 1ero de Junio del 2019
 ANTECEDENTES
La familia Orchidaceae, es una de las más diversas, pero también una de las más
vulnerables, por la destrucción de su hábitat y la gran extracción a la que ha estado sujeta, por
el gran interés comercial que ha despertado desde hace muchos años, lo que ha favorecido un
extenso mercado, en el que tanto las plantas como las flores de corte se cotizan en precios
elevados. (Loreto, 2016) En México se conocen más de 1200 especies de orquídeas, de las
cuales 181 se registran en alguna categoría de riesgo en la norma oficial vigente (NOM-059-
ECOL-2001)

Al igual que todas las plantas con flores, las orquídeas necesitan de los polinizadores
para reproducirse y factores físicos como temperatura y luminosidad para germinar. Sin
embargo, algo que las caracteriza es la complejidad de sus interacciones con otros
organismos, entre las cuales destaca la simbiosis micorrícica que se lleva a cabo con hongos
micorrizógenos específicos, que ayudan a la planta a germinar proporcionándole carbono y
minerales (Cox,​ ​2013)

Sean epifitas o terrestres, las orquídeas dependen de los hongos al menos durante las
etapas de germinación y crecimiento. La familia Orchidaceae se divide simpodial y
monopodial. Las orquídeas simpodiales se caracterizan por tener retoños individuales de
crecimiento finito de los tallos rastreros llamados rizomas, brotan retoños que se desarrollan
en otros tallos y hojas, y que al madurar producen flores; Los tallos de muchas orquídeas
simpodiales, se convierten a menudo en órganos de almacenamiento llamados pseudobulbos,
que varían mucho de tamaño y forma. Las orquídeas monopodiales, en cambio, tienen un
tallo central cuyo extremo crece continuamente, produciendo hojas alternadas e
inflorescencias entre las hojas. (Loreto, 2016)

Se reporta que las orquídeas fueron las primeras plantas propagadas in vitro a partir de
la siembra de semillas, de manera simbiótica y asimbióticamente, o clonalmente al
introducirse la técnica del cultivo de meristemos para la propagación vegetativa. Dada la
importancia hortícola y comercial de las orquídeas, se han desarrollado diversos métodos de
propagación, tanto sexual, a través de semillas, como asexual con el cultivo de segmentos
vegetativos (explantes). (Ávila y Salgado, 2006)
 Como en otras plantas, en las orquídeas, los virus patógenos tienden a acumularse
dentro del huésped y se propagan a plantas sanas, lo que reduce el rendimiento y la calidad.
Las orquídeas infectadas con virus muestran retraso en el crecimiento, producen menos flores
y de mala calidad. La medida de cuarentena apropiada en la actualidad, la erradicación de las
poblaciones infectadas y la provisión de plantas de siembra libres de virus siguen siendo la
estrategia principal para controlar las enfermedades virales en las orquídeas. El cultivo de
tejidos vegetales se ha utilizado ampliamente para producir plantas de orquídeas libres de
virus. (Pradhan, Regmi, Ranjit y Pant, 2016)

Existen dos tipos básicos de crecimiento dentro de la familia: el tipo simpodial, que
origina tallos múltiples, y el tipo monopodial, que origina un solo tallo. El tipo simpodial de
crecimiento es el más común dentro de la familia. La mayoría de estas orquídeas presentan
pseudobulbos que funcionan como reservorios de agua y nutrientes. La planta sostiene los
pseudobulbos casi verticalmente y el crecimiento y desarrollo posterior de nuevos tallos se
produce horizontalmente, entre los pseudobulbos preexistentes. Cada nuevo pseudobulbo se
origina en la base de los anteriores y, con su crecimiento, origina nuevas hojas y raíces. Las
hojas originadas en cada pseudobulbo pueden durar muchos años, proveyendo nutrientes para
toda la planta, hasta que se tornan marrones y mueren. Aún sin hojas, cada pseudobulbo
continúa sosteniendo el crecimiento y suministrando la energía necesaria para el crecimiento
del resto de la planta y para la floración. Algunos ejemplos de orquídeas con este tipo de
crecimiento son los géneros Cattleya, Dendrobium y​ Oncidium. Las orquídeas con
crecimiento monopodial, a diferencia de las anteriores, presentan un solo tallo principal que
crece erecto e indefinidamente desde el centro de la planta. Normalmente, el tallo va
creciendo hacia arriba y se originan raíces en los nudos, las cuales crecen hacia abajo. La
planta, conforme va creciendo, pierde las hojas inferiores a medida que se forman nuevas
hojas en el extremo superior. Algunas especies de orquídeas con este tipo de crecimiento son
aquellas pertenecientes a los géneros ​Ascocentrum, Phalaenopsis ​y​ Vanda. (​ ​Hágsater, 1981)

JUSTIFICACIÓN
 Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que conforman el
ambiente de la planta en la naturaleza es técnicamente muy complejo. Por esa razón se realiza
una simplificación de la realidad escogiendo aquellos factores que se puedan mantener
controlados. Cuando no se realiza el estudio con todo el ser vivo sino con solamente una
parte del mismo, se utiliza el término explante para indicar la parte del órgano ó tejido vegetal
que se cultiva in vitro. A la dificultad de reproducir las condiciones naturales en condiciones
de laboratorio, se debe añadir en este caso la dificultad de suministrar al explante todo
aquello que antes obtenía del sistema completo. En resumen, el cultivo in vitro de plantas es
una técnica que exige un control específico del ambiente, tanto físico como químico, en el
que se sitúa al explante. Conviene, por tanto, conocer cuales son los principales factores que
conforman dicho y que deberán ser controlados. (Castillo, 2004)

En la actualidad existen miles de especies de orquídeas comerciales (fam:

Orchidaceae) que se cultivan artificialmente por sus hermosas flores y su importancia
glucosidal. Además, existen orquídeas con propiedades medicinales, como coagulación de la
sangre en la herida (​Cymbidium ​giganteum)​ , antídoto para envenenamiento y afecciones
abdominales (​Vanda ​tessellata)​ , cicatrización de heridas (​Cymbidium ​aloifolium​), histeria
(​Vanda ​spathulata​) y anticonceptivos orales (​Cymbidium ​madidum)​ . Por lo tanto, es de suma
importancia la formulación y desarrollo técnicas de cultivo in vitro para la rápida propagación
de especies de orquídeas comercialmente importantes). Las semillas de orquídeas se
germinan artificialmente con fines comerciales y las plántulas germinadas se levantan
"enmasse". La micropropagación de la orquídea también se podría hacer con el uso de
plántulas crecidas asépticamente. (Rahman, Hasan, Das y Hossain, 2011)

Es indispensable la formulación de medios de cultivos simples, que permitan

disminuir los costos de producción en el proceso. La expresión cultivo in vitro de plantas,
significa cultivar plantas dentro de un frasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma
de cultivar las plantas tiene dos características fundamentales: la asepsia (ausencia de
gérmenes, etc), y el control de los factores que afectan el crecimiento. El avance alcanzado
por las ciencias biológicas ha permitido en los últimos años el estudio detallado de las plantas
tanto a nivel celular como molecular, y en condiciones de laboratorio es una técnica de
reproducción en condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento
inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas
genéticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estímulo por
medio de variables físicas y químicas controladas en un medio de cultivo. A diferencia de las
técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagación de
grandes volúmenes de plantas en menor tiempo; así como el manejo de las mismas en
espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de plantas
libres de patógenos; plantas homocigotas, en la producción de plantas en peligro de extinción,
en estudios de ingeniería genética, etc. (Loreto, 2016)

El medio de cultivo incluye agua, una fuente de carbono, sustancias inorgánicas (sales
minerales), vitaminas, hormonas y factores reguladores del crecimiento (Tabla 1). Algunos de
los elementos anteriores pueden ser reemplazados por mezclas poco definidas, más
económicas o simples de manipular (agua de coco, jugo de tomate, jugo de naranja).
Generalmente, el pH del medio varía entre 5,0 y 6,5. La composición del medio de cultivo
depende de las necesidades de cada especie. El crecimiento y la diferenciación celular se
controlan modificando la proporción entre las hormonas y reguladores de crecimiento. De un
modo general, si la relación citoquininas/auxinas es mayor que 1, se desarrollarán brotes, si
es menor, raíces, y si es igual, callos. (Muñoz, 2012)

Componentes Descripción

Agua destilada Representa el 95% de medio de nutriente.

Sacarosa. Los explantes no son completamente autótrofos y

Fuente de carbono no son capaces de cubrir sus necesidades con la fotosíntesis
que pueden realizar in vitro.

Macroelementos, (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe,

Sustancias inorgánicas Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), en una proporción
adecuada según la especie.

Vitaminas B1, B2, B6, vitamina H, vitamina E, ácido fólico,

Vitaminas
ácido nicotínico, entre otras.

Auxinas: promueven la elongación celular, la formación de

callos y raíces adventicias, inhiben la formación de brotes
Hormonas y reguladores
axilares adventicios y, a veces, inhiben la embriogénesis.
del crecimiento
Citoquininas: promueven la división celular, regulan el
crecimiento y el desarrollo de los tejidos vegetales. Otras:
 giberelinas, ácido abscísico, etileno.

Mezclas de sustancias
Extracto de levadura, extractos vegetales.
poco definidas

Se usan como soporte: agar, agarosa, otros polisacáridos, lana

Materiales inertes
de vidrio, papel de filtro, arena.
Tabla 1. Composición del medio de cultivo. (Biotecnología, 2006. Pág. 125)

OBJETIVO GENERAL
Desarrollo de una técnica de micropropagación de especies para la replicación de
orquídeas mexicanas para su preservación.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Establecer de las condiciones de trabajo y desarrollo de actividades.

Desarrollar y establecer el protocolo para extracción de explantes y replicación de especies,

técnicas de desinfección y asepsia.

HIPÓTESIS

La expresión cultivo in vitro de plantas, significa cultivar plantas dentro de un frasco

de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas tiene dos características
fundamentales: la asepsia (ausencia de gérmenes, etc), y el control de los factores que afectan
el crecimiento. El avance alcanzado por las ciencias biológicas ha permitido en los últimos
años el estudio detallado de las plantas tanto a nivel celular como molecular, y en condiciones
de laboratorio es posible actualmente reproducir todos los factores que puedan incidir en el
crecimiento y desarrollo de las plantas. Este principio general se aplica también al cultivo in
vitro de plantas. (Castillo, 2004)

La micropropagación o propagación clonal, es una de las aplicaciones más

generalizadas del cultivo in vitro, a través de la micropropagación, a partir de un fragmento
(explante) de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme, con plantas
genéticamente idénticas, denominadas clones. Se establece, por tanto, que es posible la
implementación de esta técnica como una alternativa para la preservación de orquídeas.

METODOLOGÍA
 1. Establecer de las condiciones de trabajo y desarrollo de actividades.
El medio de cultivo más adecuado para el desarrollo de plántulas son las sales de
Murashige y Skoog (MS) suplementado con 30 g/L de sacarosa, 2 g/L de peptona, 2 g/L de
carbón activado, 40 g/L de extractos de manzana, que serán licuados con 100 mL/L de agua
de coco, adicionando al medio antes de ajustar el pH a 5​±0.1​ e incorporar 6g/L de agar.

Para la obtención de la planta madre se propone un intercambio entre viveros y

jardineros que cultiven estas especies; siendo parte del objetivo general la multiplicación de
orquídeas mexicanas para su preservación, sus donaciones podrían ser de gran ayuda dentro
del proceso, además de que eventualmente serian retribuidas con alguna de las réplicas
desarrolladas en laboratorio.

La preparación del medio de cultivo, la desinfección y asepsia de la materia vegetal y

el desarrollo de la técnica de micropropagación serán llevados a cabo dentro del laboratorio
de microbiología.

2. Desarrollar y establecer el protocolo para extracción de explantes y replicación de

especies, técnicas de desinfección y asepsia.

Preparación de la planta madre

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes
con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es
recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un
período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero
bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias
óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento
vigoroso y libre de enfermedades.

Desinfección del material vegetal

Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta
madre para eliminar los contaminantes externos. Los contaminantes más comunes son los
hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el
material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia.
 A efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas de flujo
laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal. Estos explantes se
introducirán en un tubo de cultivo conteniendo medio de iniciación para poder controlar la
sanidad y la viabilidad, luego de realizar la desinfección del material con hipoclorito de sodio
(agua clorada comercial), pura o diluida durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3
a 4 enjuagues en agua esterilizada.

Introducción del material invitro

Posterior a la desinfección superficial, las yemas se colocarán sobre el medio de
cultivo estéril. El proceso de regeneración de nuevos tejidos vegetales comenzará un periodo
estimado entre una semana y 15 días.

Multiplicación de los brotes

Los explantes sobrevivientes a las etapas anteriores deberán originar brotes (de
procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que
se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos
nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en
tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizarán en la cámara
de flujo laminar presente en el laboratorio de microbiología, permitiendo mantener las
condiciones de asepsia.

Elección de un medio de enraizamiento para los explantes.

Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un
tamaño aproximado de 2 centímetros. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación
se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas
del tipo auxinas.

Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del
invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando
progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se plantarán en contenedores de vidrio
(frascos de gerber) con tapaderas cubiertas de papel aluminio.

Aclimatación de los explantes enraizados

 Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de
manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En esta etapa
las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a
vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantes o plantines
enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos
explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y
generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida
de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la
humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Por
otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula
con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la pérdida de agua a lo
largo de toda la superficie de la planta.

Bibliografía

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