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Resumen Abstract
A partir de la emisión de los permisos de liberación al ambien- In 2009 in Mexico, permission was given to release genetically
te de maíz (Zea mays L.) genéticamente modificado (GM) en modified maize (Zea mays L.) into the environment. This
el año 2009, en México fue necesario realizar la detección, made it necessary to detect, identify and quantify genetically
identificación y cuantificación de organismos genéticamen- modified organisms (GMO) in the country’s crops. The
te modificados (OGM) de los cultivos en el país. El objetivo objective of this study was to validate the technique of
del presente estudio fue validar la técnica de cuantificación absolute quantification of leaf mixtures in mass fraction
absoluta de mezclas de hoja en fracción masa de maíz GM a of GM maize using real time (qPCR) and digital (dPCR)
través de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa polymerase chain reaction (PCR) technique.Mixed leaves of
(PCR) en tiempo real (qPCR) y digital (dPCR). Mezclas de maize modified with the MON810 event were prepared with
hojas de maíz modificado con el evento MON810 se prepara- conventional maize and analyzed with the qPCR technique.
A certified reference plasmid and DNA obtained from a leaf
ron con hojas de maíz convencional, fueron analizadas con la
with the MON810 modification were used as calibrants;
técnica de qPCR, y como calibrantes se usaron un plásmido
besides, the dPCR technique was utilized since it allows a
de referencia certificado y ADN obtenido de una hoja con
precise measurement of the number of DNA initial copies in
la modificación MON810, y con la técnica de dPCR, la cual
the samples and does not require the utilization of calibrants.
permite la medición precisa del número de copias iniciales
The test in qPCR complied with validation criteria, such
de ADN en las muestras y no usa calibrantes. La prueba en
as quantification limit, dynamic interval, amplification
qPCR cumplió con los criterios de validación, como límite
efficiency, correlation coefficient and estimation of
de cuantificación, intervalo dinámico, eficiencia de amplifi-
uncertainty. Moreover, the dPCR technique was validated
cación, coeficiente de correlación y estimación de la incer-
prior to quantification of the mixtures with the certified
tidumbre. Además, se validó la técnica de dPCR previo a la reference materials (CRM). Once the dPCR technique was
cuantificación de las mezclas, usando materiales de referencia validated, the GM material in the mixtures were quantified,
certificados (MRC). Una vez validada la técnica de dPCR se and the results of the two techniques were comparable,
cuantificó la cantidad de material GM en las mezclas y los re- indicating that they can be applied in quantifying genetic
sultados entre ambas técnicas fueron comparables, indicando modification in crops and emit the results in mass fraction
que pueden aplicarse para cuantificar la modificación genéti- or copy number. The results show that quantification of
ca en los cultivos y emitir los resultados en fracción masa o en genetically modified crop material in México is possible with
número de copias. Los resultados muestran que se puede rea- reliable results.
lizar la cuantificación de material genéticamente modificado
de cultivos en México con resultados confiables. Key words: qPCR, dPCR, Zea mays L., GMO.
I
* Autor responsable v Author for correspondence. n Mexico, with the law on biosafety of
Recibido: octubre, 2014. Aprobado: febrero, 2015. genetically modified organisms in force as of
Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 49: 373-394. 2015. 2005 and its regulation in 2008, the Secretaría
373
AGROCIENCIA, 16 de mayo - 30 de junio, 2015
E
n México, entró en vigor la Ley de Biosegu- Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad
ridad de Organismos Genéticamente Modifi- Agroalimentaria (SENASICA), began inspection,
cados en 2005 y su reglamento en 2008, por surveillance and monitoring genetically modified
lo cual la Secretaría de Agricultura, Ganadería, De- (GM) crops throughout the country. The Centro
sarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA), a Nacional de Referencia en Detección de Organismos
través del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Geneticamente Modificados (CNRDOGM), where
Calidad Agroalimentaria (SENASICA) inició las ac- this study was conducted, validates methods to assure
tividades de inspección, vigilancia y monitoreo de los reliability of the results emitted. The SENASICA
cultivos genéticamente modificados (GM) en todo el sends samples to the CNRDOGM for analysis. The
país. El Centro Nacional de Referencia en Detección samples must be of the first growth stages of the plant
de Organismos Genéticamente Modificados (CNR- to give the authorities sufficient time to exercise their
DOGM), donde se desarrolló este estudio, valida los powers if necessary. Most of the methods validated
métodos para asegurar la confianza en los resultados worldwide for analysis of GMOs use samples of
emitidos. El SENASICA envía las muestras al CNR- flours from seeds, such as maize, soybeans or cotton
DOGM para su análisis. Las muestras deben ser de (Luque-Perez et al., 2013; Mazzara et al., 2013). It
las primeras etapas de crecimiento de la planta, para is necessary to have validated methods applicable to
dar a la autoridad un periodo suficiente para el ejer- the matrixes that are analyzed in Mexico, such as the
cicio de sus facultades si es necesario. La mayoría de leaves of maize plants.
los métodos validados en el mundo para el análisis de PCR is the most used technique for analysis
OGM usan muestras de harina de las semillas, como of DNA from organisms derived from modern
maíz, soya o algodón (Luque-Perez et al., 2013; Ma- biotechnology. Real-time PCR, or qPCR, is a sensitive,
zzara et al., 2013), por lo cual, es conveniente tener rapid and quantitative technique. Its limitations,
métodos validados aplicables a las matrices que se however, are the need to use a calibrant, conduct the
analizan en el país, como las hojas de plantas de maíz. test in a laboratory that works under a management
La PCR es la técnica más usada para el análisis system based on the international norm ISO/IEC
de ADN de los organismos derivados de la biotec- 17025:2005, and use certified reference materials
nología moderna. La PCR en tiempo real o qPCR es (CRM) generated by a competent institution (Žel
una técnica sensible, rápida y cuantitativa; pero, las et al., 2006), which, in many events with genetic
limitaciones son la necesidad de usar un calibrante, modification, are not immediately available in most
realizarla en un laboratorio que trabaje en un Sistema countries, including Mexico. These limitations can
de Gestión basado en la norma internacional ISO/ be overcome using the new dPCR technique, which
IEC 17025:2005, y usar MRC generados por una allows quantification of the copy numberof a DNA
institución competente (Žel et al., 2006), los cua- sequence in a sample by amplifying a single copy
les, en muchos eventos con modificación genética, by division of the sample in digital arrays. With
no están disponibles inmediatamente en la mayoría this technique, individual DNA molecules can be
de los países, incluyendo México. Estas limitaciones obtained from each of the hundreds of small wells
pueden ser superadas por la nueva técnica dPCR, where the reaction takes place. This quantification
la cual permite cuantificar el número de copias de is a linear response, and a reference calibrant is not
una secuencia de ADN en una muestra a través de necessary. The technique is based on the concept of
la amplificación desde una sola copia por división de boundary dilutions used to enrich minority sequences
la muestra en arreglos digitales. Esta técnica permite by a partitioning process. In this process, the potential
obtener moléculas individuales de ADN en cada uno differences between the standard and the sample
de los cientos de pozos pequeños donde se realiza la under study by effect of the matrix do not exist, as in
reacción; esta cuantificación es una respuesta lineal y qPCR, where the amplification cycle determines the
no necesita calibrante como referencia. Se basa en el initial concentration of the DNA sequence analyzed
concepto de diluciones límite usadas para enriquecer by interpolation with the calibration curve (Corbisier
secuencias minoritarias por un proceso de partición. et al., 2010). The dPCR technique is not used to
En este proceso no hay diferencias potenciales por quantify GM maize leaf samples.
efectos de la matriz entre el estándar y la muestra in- Therefore, the objective of this study was to
vestigada, como en la qPCR, donde el ciclo de am- evaluate the quantification of mixtures in mass
plificación determina la concentración inicial de la fractions and copy number of the MON810 event.
secuencia de ADN analizada por interpolación con The MON810 event is a genetic construction
una curva de calibración (Corbisier et al., 2010). La generated by the Monsanto Company® (Monsanto
técnica de dPCR no se usa para cuantificar muestras Company, 2002) for commercial ends; it contains
en hoja de maíz GM. a part of the open reading frame (ORF) of the
Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue eva- cry1Abgene from the Gram positive bacteria Bacillus
luar la cuantificación de mezclas en fracción masa y thuringiensis (Monsanto Company, 2002; CERA,
en número de copias del evento MON810. El even- 2012), a construction that was introduced into
to MON810 es una construcción genética generada the maize genome (commercial maize: YielGard®-
con fines comerciales por Monsanto Company® (Mon- Monsanto Company®). The transformation allows the
santo Company, 2002) que contiene una parte del maize type MON810 to express a fragment of the
marco abierto de lectura (ORF) del gen cry1Ab de la 91 kDa protein CryA1b(CERA, 2012), which is a
bacteria Gram positiva Bacillus thuringiensis (Mon- peptide that confers resistance to damage by insects
santo Company, 2002; CERA, 2012), construcción of the Lepidoptera order (Monsanto Company,
que se introdujo en el genoma de maíz (maíz comer- 2002).It was first released into the environment in
cial: YielGard®-Monsanto Company®). La transforma- the United States in 1995 (CERA, 2012).
ción permite expresar a este tipo de maíz MON810
un fragmento de la proteína CryA1b de 91 kDa Materials and Methods
(CERA, 2012), un péptido que confiere resistencia a
daño por insectos del orden Lepidóptera (Monsanto Sampling
Company, 2002) y cuya liberación al ambiente fue
primero en los EE.UU. en 1995 (CERA, 2012). The study was conducted in CNRDOGM of SENASICA.
Under the permit for release into the environment 094/2010
Materiales y Métodos (CIBIOBEM, 2010) in July 2011, 51 maize (Zea mays) leaves,
which contained the MON810 event, were collected randomly
Toma de muestra from a GM crop in Chihuahua, and 32 leaves were collected
from conventional maize. Each leaf (conventional and GM)
El estudio se realizó en el CNRDOGM del SENASICA. A was assigned a code with which it was identified throughout the
partir del permiso de liberación al ambiente 094/2010 (CIBIO- study.
GEM, 2010), en julio de 2011 se recolectaron aleatoriamente
51 hojas de maíz (Zea mays) de un cultivo GM proveniente de Conditioning
Chihuahua, que contenía el evento MON810 y 32 hojas de maíz
convencional. A cada hoja (convencional y GM) se le asignó un The presence of the MON810 event or the absence of
código con el cual se identificaron durante todo el estudio. modification was verified in segments of less than 3 cm from the
apex of all of the leaves. With the rest of each leaf, lots of 1±0.05 g
Acondicionamiento were formed, labeled and stored at -20 °C.
GGA CTC TAA CGT-3’ (r) 5’-GCC ACC TTC CTT TTC 2 mL (100 ng) template DNA and sterile water to complete the
CAC TAT CTT-3’; (s) 5’-(FAM)-AAC ATC CTT TGC 20 mL. Each PCR analysis carried outin duplicate included a
CAT TGC CCA GC-(TAMRA)-3’. Cada reacción se preparó negative control with cotton (Gossypium hirsutum) seed DNA for
a un volumen final de 20 m L, con 10 m L de Master Mix, sonda the response to the endogenous hmgA maize sequence, a sample
e iniciadores, con concentración final de 180 nM y 300 nM, res- of unmodified maize for the case of the MON810 sequence, and
pectivamente, 2 m L (100 ng) de ADN molde y la cantidad sufi- blank reagents (without DNA). Thermocycling conditions were
ciente de agua estéril para completar los 20 m L. Cada análisis por one cycle at 50 °C for 2 min followed by one cycle at 95 °C for
PCR incluyó testigos negativos, con ADN de semilla de algodón 10 min and 40 amplification cycles at 95 °C for 10 s, alignment
(Gossypium hirsutum) para la respuesta a la secuencia endógena de and extension at 60 °C for 1 min.
maíz hmg, una muestra de maíz no modificado para la secuencia
MON810, y un blanco de reactivos (sin ADN), por duplicado. Preparation of GM mixtures
Las condiciones de termociclado fueron 1 ciclo a 50 °C por 2 min,
luego 1 ciclo a 95 °C por 10 min y 40 ciclos de amplificación de GM mixtures were prepared to 0.1, 1 and 10 % with moist
95 °C por 10 s, alineamiento y extensión de 60 °C por 1 min. lyophilized leaves identified as positive (GM) and negative
(conventional) in terms of the presence of the specific MON810
Elaboración de mezclas GM event (Table 1). Moist leaves were placed in a mortar and
crushed with liquid nitrogen until particle size appeared to be
Mezclas GM al 0.1, 1 y 10 % se prepararon con hojas húmedas homogenous. An amount of GM leaf corresponding to the
y liofilizadas identificadas como positivas (GM) y negativas (con- mass percentage was weighed and conventional leaf was added
vencionales) a la presencia del evento específico MON810 (Cua- to complete 10 g; the mixture was homogenized. Four 2±0.2 g
dro 1). Las hojas con humedad se colocaron en un mortero, se subsamples were obtained from the 10 g of mixture. Each
trituraron con nitrógeno líquido hasta que el tamaño de partícula subsample was placed in a clean mortar. The same procedure was
pareciera homogéneo. La cantidad de hoja GM correspondiente carried out for 0.1 and 1 % mixtures. Mixtures were subjected
al porcentaje masa fue pesada, se agregó hoja convencional hasta to the process of particle size reduction with liquid nitrogen in
completar 10 g y la mezcla se homogeneizó. De los 10 g se ob- a mortar, until the smallest and the most homogeneous particles
tuvieron cuatro submuestras, de 2±0.2 g, y cada una se colocó possible were achieved. The same procedure was applied to
en un mortero limpio. El mismo procedimiento se realizó para the mixtures with lyophilized leaves, but the mixtures had
las mezclas de 0.1 y 1 %. Las mezclas se sometieron al proceso a total weight of 2 g and were divided into four 200±20 mg
de reducción de tamaño de partícula, con nitrógeno líquido, en subsamples. DNA was extracted after conditioning with the
mortero, hasta alcanzar el tamaño menor y homogéneo de partí- method described above.
cula posible. El mismo procedimiento se aplicó a las mezclas con
hojas liofilizadas, pero las mezclas tuvieron 2 g de peso total y se Quantification by qPCR
dividieron en cuatro submuestras de 200±20 mg cada una. El
ADN fue extraido después del acondicionamiento con el método Results of the quantification of the GM mixtures with the
ya descrito. dPCR technique were compared with the quantification of the
Cuantificación por qPCR MON810 sequence and the endogenous gene hmgA by qPCR,
with a calibration curve for each sequence, in the dynamic interval
Los resultados de la cuantificación de las mezclas GM con of 0.1 to 100 ng DNA from a MON810 genetically modified
la técnica de dPCR se compararon con la cuantificación de la leaf (100 % GM). The amount of GMO in the mixtures was
secuencia MON810 y del gen endógeno hmgA por qPCR, con calculated with the calibration curves and the concentration was
una curva de calibración para cada secuencia, en el intervalo di- expressed in percentage (m/m) according to equation 1 (EURL-
námico de 0.1 a 100 ng de ADN de una hoja con la modificación GMFF and ENGL, 2010):
genética MON810 (100 % GM). La cantidad de OGM en las
mezclas se calculó con las curvas de calibración y la concentra-
ng de secuencia GM
ción se expresó en porcentaje (m/m) de acuerdo con la ecuación OMG(%) = × 100 (1)
ng de secuencia hmgA
1 (EURL-GMFF y ENGL, 2010):
de calibración debieron poseer linealidad y pendiente entre -3.1 results, characterized by the standard deviation of the results
y -3.6 para ser usadas en la cuantificación. (equations 3 to 6) (Trapmanet al., 2009):
La estimación de la incertidumbre asociada al porcentaje de
OGM se obtuvo de la distribución estadística de los resultados,
ésta se caracterizó mediante la desviación estándar de los resulta-
dos (ecuaciones 3 a 6) (Trapman et al., 2009):
d i + buRSD g
uc = u Cref
2
IP
2 (3)
Para obtener la incertidumbre expandida se usa la ecuación. where U: expanded uncertainty; uc: typical uncertainty
combined; k: coverage factor (equal to 2, represented by a
U=(uc)k (5) confidence interval of 95 %).
donde U: incertidumbre expandida; uc: incertidumbre típica Finally, relative uncertainty is obtained from the quotient
combinada; k: factor de cobertura (igual a 2 representado por un between expanded uncertainty and the average GMO percentage,
intervalo de confianza del 95 %) as shown in equation 6.
Quantification by dPCR
donde U Relativa: incertidumbre relativa de la medición; U:
incertidumbre expandida; x: Promedio en % de OGM de cada The dPCR assays were conducted in the platform OpenArray®
medición. Real-Time PCR System, which consists of an OpenArray® Digital
PCR plate with 3072 perforations arranged in 48 sub-arrays of
Cuantificación por dPCR 64 wells with a capacity of 33 nL each. These have been treated
to permit retention of liquids inside the wells. Each well of the
Los ensayos de dPCR se hicieron en la plataforma OpenArray® Open Array™ plate was filled by the AccuFill™ System (ABI, ibid)
Real-Time PCR System, que es una placa OpenArray®Digital from a well of a plate with 384 wells according to the distribution
PCR con 3072 perforaciones, las cuales están en 48 sub-arreglos established previously in the software. A plate with 384 wells
de 64 pozos con capacidad de 33 nL cada uno. Estos fueron served to fill eight OpenArray® Digital PCR plates (Figure 1).
tratados para permitir la retención de líquidos dentro del pozo. Initially, the dPCR technique was validated by comparing the
Cada pozo de la placa Open ArrayTM fue llenado por el equi- value (copy number or mass fraction) reported in the certificates
po AccuFill™ System (ABI, ibid) desde un pozo de una placa of the reference materials with that obtained experimentally.
de 384 pozos de acuerdo con la distribución ya establecida en Of the plasmid ERM®-AD413 (EUR22948EN-2007), the
el programa. Una placa de 384 pozos sirvió para cargar 8 placas concentration of the MON810 sequence in copy number of three
OpenArray®Digital PCR (Figura 1). nominal concentrations, 50, 100 and 200 copies, corresponding
Inicialmente se validó la técnica de dPCR comparando el va- to 0.33, 0.66 and 1.32 copies per reaction (Figure 2), respectively,
lor (en número de copias o fracción masa) reportado en los certi- were evaluated with and without enzymatic digestion (Bhat et al.,
ficados de los materiales de referencia con el obtenido experimen- 2009). Of the MRC DMR436IIa (flour) (CENAM, Querétaro,
talmente. Del plásmido ERM®-AD413 (EUR22948EN-2007), Mexico), the endogenous hmgA and MON810 sequences were
la concentración de la secuencia MON810 en número de copias quantified with two different amounts of DNA (0.1 and 1 ng)
de tres concentraciones nominales, 50, 100 y 200 copias, co- for amplification of each sequence (Figure 3).
rrespondientes a 0.33, 0.66 y 1.32 copias por reacción (Figura Once the technique was validated, the mixtures for 0.1, 1 and
2), respectivamente, se analizó con y sin digestión enzimática 10 %, were quantified, and series dilutions with factor 1:10 from
(Bhat et al., 2009). Del MRC DMR436IIa (harina) (CENAM, the DNA solution standardized to 50 ng mL-1 were carried out
Querétaro, México), se cuantificó la secuencia endógena hmgA until the concentrations required by the manufacturer to obtain
y MON810 con dos cantidades diferentes de ADN (0.1 y 1 ng) a copy number between 0.6 and 1.6 were attained. The amount
para la amplificación de cada secuencia (Figura 3). of DNA of each concentration for the amplification of the hmgA
Una vez validada la técnica, se cuantificaron las mezclas para sequence was 1 ng, 10 ng for the 10 % GM and 100 ngfor
0.1, 1 y 10 %, se realizaron diluciones en serie con factor 1:10 the 0.1 and 1 % mixtures. After quantifying the copy number
desde la solución de ADN estandarizada a 50 ng mL-1 hasta las of MON810 and hmgA with dPCR in the GM mixtures, the
concentraciones requeridas para obtener un número de copias quantity of GMO expressed in percentage was calculatedwith
entre 0.6 y 1.6, establecido por el fabricante. La cantidad de equation 7 (EURL-GMFF and ENGL, 2010).
ADN de cada concentración para la amplificación de la secuencia All cases were evaluated in quadruplicate and each included
hmgA fue 1 ng, para la secuencia GM al 10 % fue 10 ng y para the average of 11 sub-arrays used in the dPCR plate and one
las mezclas al 0.1 y 1 % fue 100 ng. Después de cuantificar el sub-array with no addition of DNA, as a reagent control for
número de copias de MON810 y hmgA en las mezclas GM con each concentration. The reaction volume per sub-array was 5 mL,
dPCR, la cantidad de OGM expresada en porcentaje se calculó that contained 2.5 mL of 1X TaqMan®OpenArray® Digital PCR
con la ecuación 7 (EURL-GMFF y ENGL, 2010). Master Mix (ABI, ibid), probe and primers (sequences described
Todos los casos se evaluaron cuadruplicados, y cada uno in- above) at a final concentration of 180 and 300 nM, respectively.
cluyó el promedio de 11 sub-arreglos usados en la placa de dPCR The thermocycling conditions were one cycle at 95 °C for 10 min
y un subarreglo sin la adición de ADN como control de reactivos and 40 amplification cycles at 95 °C for 20 s, alignment at 60 °C
para cada concentración. El volumen de reacción por subarreglo for 60 s and elongation at 72 °C for 30 s.
fue 5 mL, que contenían 2.5 mL de 1X TaqMan® OpenArray®
Digital PCR Master Mix (ABI, ibid), sonda e iniciadores (se-
cuencias ya descritas) a una concentración final de 180 y 300 nM, copias de secuencia GM
OGM (%) = × 100 (7)
respectivamente. Las condiciones de termociclado fueron: 1 ciclo copias de secuencia hmgA
a 95 °C por 10 min, y 40 ciclos de amplificación a 95 °C por 20 s,
alineamiento a 60 °C por 60 s y elongación a 72 °C por 30 s. Analysis of dPCR
OpenArray
384-Well
Sample plate
OpenArray AccufillTM
System
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
{
a
b OpenArray Digital
c PCR Plate
Subarray d
e
f
g 33 nL per reaction
h
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 1. Distribución de la mezcla de reacción desde la placa de 384 pozos a placa OpenArray®Digital PCR.
Figure 1. Distribution of the reaction mixture from a 384 wells plate to the well OpenArray®Digital PCR plate.
confianza de cada muestra analizada en la placa de OpenArray® and the total number of partitions analyzed (Corbisier et al.,
Digital PCR. Para cada muestra el programa genera el número 2010), according to equation 8. For each position of the sub-
de copias de cada subarreglo con un intervalo de confianza de array, the program assigns a positive value (1) when it detects an
95 %, mediante el conteo del número de reacciones positivas con amplification within the acceptable interval, or negative (0) when
relación al número de particiones usando la aproximación bino- there is no amplification. The program does not permit manual
mial de Poisson, basada en el número de particiones con pro- adjustment of the amplification cycle or Ct associated with each
ductos amplificados y el número total de particiones analizadas of the nano-reactions. The OpenArray® Digital PCR software
(Corbisier et al., 2010), de acuerdo con la ecuación 8. Para cada generates two-dimensional colored maps from the processed
posición del subarreglo el programa asigna un valor positivo (1) data that permit reviewing the result of the variation of copies in
cuando detecta una amplificación dentro de un intervalo acepta- each of the positions of the sub-arrays of the OpenArray® Digital
ble o negativo (0) si no hay una amplificación. El programa no PCR plate.
permite el ajuste manual del ciclo de amplificación o Ct asociado
con cada nano reacción. El programa OpenArray® Digital PCR
FG logFG1 − H IJ IJ
genera, desde los datos procesados, mapas en dos dimensiones
M=
H H C KK (8)
que permiten revisar mediante color el resultado de la variación
FG logFG1 − 1 IJ IJ
de copias en cada una de las posiciones de los subarreglos de la
placa OpenArray® Digital PCR:
H H CKK
FG logFG1 − H IJ IJ where M: number of molecules per panel; H: number of
M=
H H C KK (8) partitions the amplified product contains; C: total number of
FG logFG1 − 1 IJ IJ
H H CKK partitions analyzed.
50 L 50 L 50 L
50 100 200
copies / L copies / L copies / L
expected 0.33 0.66 1.32
copies per reaction copies copies copies
DRM 436IIa
5 L 5 L 5 L
Starting concentration
50 ng / L 5 ng / L 0.5 ng / L 0.05 ng / L
1 ng / L 0.1 ng / L
Figura 3. Diluciones del MRC DRM 436IIa para su cuantificación por dPCR.
Figure 3. Dilutions of MRC DRM 436IIa for quantification by dPCR.
donde M: número de moléculas por panel; H: número de parti- Statistical analysis of the results of dPCR
ciones que contienen producto amplificado; C: número total de
particiones analizadas. Digital PCR® software generates the average value and the
confidence interval for each quantification in copy number. For
Análisis estadístico de los resultados del dPCR the GM mixtures, where the results are expressed in percentage
of the GM sequence, relative to the endogenous sequence,
El programa Digital PCR® genera el valor promedio y un statistical analysis is done with equations 3 to 6, considering
intervalo de confianza para cada cuantificación en número de U(ref ) equal to zero, because no reference material is used. The
copias. Para las mezclas GM, donde los resultados se expresan uncertainty equations are referenced to the guide of uncertainty
en porcentaje de la secuencia GM con respecto a la secuencia measurement published by the JRC (Trapmanet al., 2009), but
endógena, el análisis estadístico se realiza con las ecuaciones 3 the uncertainty of the reference material in the calculation is zero
a 6, considerando U(ref ) igual a 0 porque no se usa material since the digital PCR does not need reference material for the
de referencia. Las fórmulas de incertidumbre están referenciadas quantifications.
a la guía de medición de incertidumbre publicada por la JRC
(Trapman et al., 2009), pero la incertidumbre del material de Results and Discussion
referencia en el cálculo es cero debido a que la PCR digital no
necesita un material de referencia para la cuantificación. Analysis of collected material
Figura 4. Recolección de muestras a partir del permiso de liberación al ambiente 094/2010 ubicado en el estado de Chihuahua
(CIBIOGEM, 2010), de un cultivo de maíz genéticamente modificado conteniendo el evento MON810 y de maíz con-
vencional.
Figure 4. Sample collection of genetically modified maize containing the MON810 event, based on permit 094/2010 for release
into the environment, in the state of Chihuahua (CIBIOGEM, 2010), and of conventional maize.
GM. Los resultados permitían esperar que las mez- Preparation of GM mixtures and DNA extraction
clas presentaran un comportamiento atípico, ya que
el valor calculado no correspondió al 50 % del valor GM mixtures of moist and lyophilized leaves
teórico. were analyzed according to the diagram in Figure 6
and to the quantities in Table 2. In all cases, DNA
Elaboración de mezclas GM y extracción de ADN concentrations above 50 ng mL-1 were obtained, and
so the mixtures were quantified.
Las mezclas GM con hojas frescas y liofilizadas
se analizaron según el diagrama en la Figura 6 y las Quantification of mixtures by qPCR
cantidades del Cuadro 2. En todos los casos se ob-
tuvieron concentraciones de ADN mayores a 50 ng The results of the quantification of the mixtures
mL-1, por lo cual se cuantificaron las mezclas. of moist samples using the calibration curve of the
100 % GM leaf were far from the theoretical values,
Cuantificación de las mezclas por qPCR even when considering the relative uncertainty
associated with the average expected values (Table
Los resultados de la cuantificación de las mezclas 3). There was an over estimation of the amount of
con muestras húmedas y uso de la curva de calibración GMO, relative to the theoretical values. We ruled
10
0.1 0.1
Rn
0.01
MON810 hmg
0.001
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
Cycle
de la hoja 100 % GM estuvieron lejos de los valo- out that the analytical factors were the origin of the
res teóricos, inclusive cuando se consideró la incer- deviation in the quantification results since the values
tidumbre relativa asociada con los valores promedio of amplification efficiency in the calibration curves
esperados (Cuadro 3). Una sobre estimación en la were found within the permitted range (Mazzara
cantidad de OGM se observó respecto a los valores et al., 2008; ENGL Working Group on Method
teóricos. Se descartó que los factores analíticos fueran Verification, 2011), 98.3 and 90.3 % for hmgA
el origen de la desviación en los resultados de cuanti- and MON810, both with R2³0.98. Moreover, the
ficación, ya que los valores de eficiencia de amplifica- calculated values of the relative standard deviation
ción en las curvas de calibración se encontraron den- in conditions of repeatability (RSDr) showed that
tro de los rangintervalos permitidos (Mazzara et al., the assay is precise, the deviations being less than 25 %,
2008; ENGL Working Group on Method Verifica- according to the European normativity (Mazzara
tion, 2011), 98.3 y 90.3 % para hmgA y MON810, et al., 2008; ENGL Working Group on Method
y ambas con R2³0.98. Además, los valores calcula- Verification, 2011). Relative uncertainty, applicable
dos de la desviación estándar relativa en condiciones only to experimental quantification, is acceptable
de repetibilidad (RSDr) mostraron que el ensayo es and comparable to results of similar publications
preciso, pues las desviaciones fueron menores de 25 %, (Mazzaraet al., 2008; ENGL Working Group on
de acuerdo con la normativa europea (Mazzara et Method Verification, 2011).
al., 2008; ENGL Working Group on Method Veri- Because the variation may have been due to
fication, 2011). La incertidumbre relativa, aplicable the moisture content of the leaves in the mixtures,
sólo a la cuantificación experimental, es aceptable y the lyophilized mixtures were quantified (Tables
comparable con resultados de publicaciones similares 2 and 4). The mixtures showed satisfactory results
10
0.1 0.1
Rn
0.001
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
Cycle
or
Preparation of mixtures:
10 %, 1 % y 1 % GM
Quantification of the % GM
qPCR assay dPCR assay
Comparision of results
vs
Figura 6. Diagrama experimental del estudio para la comparación en la medición del % OGM mediante las técnicas de qPCR y
dPCR.
Figure 6. Experimental diagram of the study for comparison of % GMO measurement with the techniques qPCR and dPCR.
Cuadro 2. Muestras para la elaboración de las mezclas de maíz genéticamente modificado (GM).
Table 2. Samples for preparation of the mixtures of genetically modified (GM) maize.
(Mazzara et al., 2008; ENGL Working Group on because they were comparable, precise (RSDr below
Method Verification, 2011). 25 % in all cases) and repeatable. The uncertainty
Esa variación podría deberse al contenido de of the measurement component in conditions of
humedad de las hojas en las mezclas, por lo cual, se repeatability, u(RSDIP), was reduced proportionally
cuantificaron las mezclas liofilizadas (Cuadro 2 y 4). to a minimal value with the increase in the percentage
Las mezclas mostraron resultados satisfactorios, por of the GM mixture. The value of u(RSDIP) decreased
Cuadro 3. Resultados de cuantificación por qPCR de mezclas de maíz genéticamente modificado (GM) húmedas.
Table 3. Results of the qPCR quantification of mixtures of moist genetically modified (GM) maize leaves.
Donde S: desviación estándar, RDRr: componente de medición en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad, U(RSDIP): Incer-
tidumbre del componente de medición en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad, U: incertidumbre. v S: standard deviation,
RDRr: measurement component in conditions of repeatability and reproducibility, U(RSDIP): Uncertainty of the measurement condi-
tion in conditions of repeatability and reproducibility, U: uncertainty.
Cuadro 4. Resultados de cuantificación por qPCR de mezclas de maíz genéticamente modificado (GM) liofilizadas.
Table 4. Results of qPCR quantification of lyophilized genetically modified (GM) maize mixtures.
Donde S: desviación estándar, RDRr: componente de medición en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad, U(RSDIP): incer-
tidumbre del componente de medición en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad, U: incertidumbre. v S: standard deviation,
RDRr: measurement component in conditions of repeatability and reproducibility, U(RSDIP): Uncertainty of the measurement condi-
tion in conditions of repeatability and reproducibility, U: uncertainty.
ser comparables, precisos (RSDr menores de 25 % and showed that the conditions of repeatability did
en todos los casos) y repetibles. La incertidumbre del not affect the precision of the result.
componente de medición en condiciones de repeti- Because the GM mixtures made from lyophilized
bilidad u(RSDIP) se redujo a un valor mínimo, pro- leaves furnished a value closer to the values in mass
porcionalmente con el incremento del porcentaje de fraction, the quantifications were carried out with
la mezcla GM. El valor de la u(RSDIP) disminuyó y these mixtures instead of the mixtures with moist
mostró que las condiciones de repetibilidad no afec- leaves.
taron la precisión del resultado. Having constructed the calibration curve with
Debido a que las mezclas GM elaboradas con ho- MRC EMR®-AD413 for the MON810 and hmgA
jas liofilizadas aportaron un valor más cercano a los sequences (Table 5), the copy numbers of the
valores en fracción masa, las cuantificaciones se reali- sequences of the 100 % GM leaf were quantified;
zaron a partir de estas mezclas, en lugar de las mezclas these sequences served as calibrant in the previous
con hojas húmedas. assays together with the GM mixtures.
Con la curva de calibración elaborada con el Cuadro 5. Datos de la curva de calibración con el MRC EMR
MRC EMR AD-413 para las secuencias MON810 AD-413.
Table 5. Data of the MRC EMR®-AD413calibration curve.
y hmgA (Cuadro 5) se cuantificó el número de copias
de dichas secuencias de la hoja 100 % GM, y sirvió
Secuencia blanco
como calibrante en las pruebas anteriores, junto con Parámetro de aceptación
hmgA MON810
las mezclas GM.
Una vez obtenido el número de copias se aplicó la Eficiencia (90-110 %) 94.574 92.593
ecuación 3 para calcular los valores en fracción masa Pendiente (-3.1 a -3.6) -3.459 -3.513
(Cuadro 6). Los resultados experimentales coincidie- R2 ³ 0.98 1.000 0.999
ron con el valor teórico predicho, pues con base en la
fisiología del maíz se espera obtener 50 % del mate-
rial genético modificado y los resultados experimen-
tales. Así, los valores obtenidos de Ur son los espera- Once the copy number was obtained, equation
dos, son precisos y reproducibles, ya que los valores 3 was used to calculate the values in mass fraction
de RSDr son menores a 25 % y coinciden con los (Table 6). The experimental results coincided with
criterios de aceptación establecidos por la regulación the predicted theoretical valuesince, based on maize
aplicable a los análisis de OGM en la Unión Europea physiology, 50 % was expected from the modified
(EURL-GMFF y ENGL, 2010) . genetic material and the experimental results. Thus,
the Ur results obtained are the expected results; they
Validación de la técnica de dPCR are precise and reproducible since the RSDr values
are below 25 % and coincide with the acceptance
Para validar la técnica se evaluó la concentración criteria established by the regulation applicable to
en número de copias del plásmido ERM®-AD413, GMO analysis in the European Union (EURL-
con y sin digestión enzimática, la amplificación se GMFF and ENGL, 2010).
realizó sólo de la secuencia MON810, y se analiza-
ron tres concentraciones nominales (Figura 7). De Validation of the dPCR technique
acuerdo con los resultados obtenidos, las concentra-
ciones nominales de valor menor (0.33 y 0.66 copias To validate the technique, the concentration in
por reacción, correspondientes a 50 y 100 copias), copy number of the ERM®-AD413 plasmid was
fueron comparables con el valor nominal esperado y, evaluated, with and without enzymatic digestion.
Cuadro 6. Evaluación de las mezclas de maíz genéticamente modificado (GM) liofilizadas por qPCR el plásmido EMR® AD-413
usado como calibrante certificado.
Table 6. Evaluation of lyophilized mixtures of genetically modified (GM) maize using the qPCR technique; the EMR®-AD413
plasmid used as a certified calibrant.
Donde S: desviación estándar, RDRr: componente de medición en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad, U(RSDIP): Incer-
tidumbre del componente de medición en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad, U: incertidumbre. v S: standard deviation,
RDRr: measurement component in conditions of repeatability and reproducibility, U(RSDIP): Uncertainty of the measurement condi-
tion in conditions of repeatability and reproducibility, U: uncertainty.
1.2 1.32
1.1
1.0
Copies per reaction
0.9 0.88
0.8
0.76
0.7
0.6
0.66
0.5
0.44 0.46
0.4
0.3
0.2 0.33 0.22
0.17
0.1
0
0 Expected Undigested Digested Expected Undigested Digested Expected Undigested Digested
plasmid plasmid plasmid plasmid plasmid plasmid
Samples
Figura 7. Resultados obtenidos de la medición en dPCR del material de referencia ERM®-AD413 digerido y sin digerir. Las barras
en la figura representan los intervalos de confianza generados por el software OpenArray® Real-Time PCR.
Figure 7. Results obtained of dPCR measure of the reference material ERM®-AD413, digested and undigested. The bars in the
figure represent the confidence intervals generated by the software OpenArray® Real-Time PCR.
con base en los valores del intervalo de confianza que Amplification was carried out only for the MON810
genera el software del equipo OpenArray® Real-Time sequence, and three nominal concentrations were
PCR, los resultados no mostraron diferencia con la analyzed (Figure 7). According to the results obtained,
evaluación del plásmido digerido y sin digerir. Estos the nominal concentrations of lower value (0.33
resultados condujeron a la evaluación con el plásmi- and 0.66 copies per reaction, corresponding to 50
do sin digerir. and 100 copies) were comparable with the expected
Los resultados de la cuantificación del DMR- nominal value. Moreover, based on the values of the
436IIa por dPCR mostraron que al utilizar 0.1 ng de confidence interval generated by the OpenArray®
la secuencia MON810 por subarreglo (42.1±3.6%) Real-Time PCR equipment software, the results of
fueron comparables con el reportado en fracción the evaluation with the digested plasmid were not
masa, al considerar la incertidumbre expandida con different from those with the undigested plasmid.
un factor de cobertura de 2 (Figura 8). These results led us to evaluate with the undigested
Lo anterior permitió concluir que los valores son plasmid.
comparables con los reportados en un certificado Results of the quantification of DMR-436IIa by
(Corbisier et al., 2007) emitido por institutos de me- dPCR showed that when 0.1 ng of the MON810
trología (IRMM y CENAM), que fueron obtenidos sequence was used by sub-array (42.1±3.6%),
con procedimientos estandarizados en laboratorios they were comparable with those reported in mass
acreditados (ISO Guide 34:2009) con la técnica de fraction, considering the expanded uncertainty with
qPCR, que es la más usada en pruebas moleculares a coverage factor of 2 (Figure 8).
debido al gran soporte técnico y validación en todo It was therefore concluded that the results are
el mundo. El presente estudio es el primero realizado comparable with the values reported in a certificate
en la plataforma de OpenArray® Real-Time PCR Sys- (Corbisier et al., 2007) issued by metrology
tem y aplica para medir secuencias GM. Los resulta- institutes (IRMM and CENAM) and obtained with
dos de validación permitieron seguir con la siguiente standardized procedures in accredited laboratories
etapa de cuantificación de las mezclas. (ISO Guide 34:209) with the qPCR technique,
54 DMR-436IIa quantification
52
52.55
50
48 45.69
Copi number ratio
47.27
46
44
42 42.13 41.49
39.22
40
38
37.35 38.57
36
34 35.48
32
0 Expected 0.1 ng 1 ng
Sample
Figura 8. Resultados obtenidos de la cuantificación por dPCR en fracción masa del MRC DMR-436IIa. Las barras en la figura
representan los valores de la incertidumbre expandida.
Figure 8. Results obtained in the quantification by dPCR in mass fraction of MRC DMR-436IIa.The bars in the figure represent
expanded uncertainty values.
Cuantificación de las mezclas de maíz por dPCR which is the most utilized in molecular experiments
because of the good technical support and
Las cuantificaciones de las mezclas con las secuen- worldwide validation. The present study is the first
cias hmgA y GM mostraron disminución del núme- to be conducted in the OpenArray® Real-Time PCR
ro de amplificaciones, proporcional al porcentaje de System platform applied in measuring GM sequences.
cada una de las mezclas para MON810 (Figura 9). The results of validation allowed continuing with the
La cuantificación de las mezclas por qPCR (Cuadro following step in the quantification of the mixtures.
7) permitió concluir que los valores obtenidos por
dPCR son más precisos, ya que se observa una rela- Quantification of maize mixtures by dPCR
ción proporcional entre el porcentaje GM obtenido
para la hoja 100 % GM y las mezclas elaboradas des- Quantifications of the mixtures with the hmgA and
de ella. Es decir, entre 0.031, 0.3, 3.69 y 41.87 % el GM sequences revealed a reduction in the number
factor de dilución fue cercano a 1:10, y corresponde of amplifications, proportional to the percentage
al factor de dilución usado para elaborar las mezclas of each of the mixtures for MON810 (Figure 9).
de manera gravimétrica. Quantification of the mixtures by qPCR (Table 7) led
La incertidumbre fue menor para la mezcla con to the conclusion that the values obtained by dPCR
concentración menor, comparada con la obtenida are more precise since a proportional relationship
por qPCR. Sin embargo, los resultados de la cuanti- was observed between the GM percentage obtained
ficación de la hoja 100 % GM y la mezcla 10 % GM for the leaf 100 % GM and that obtained for the
por qPCR fueron más cercanos al valor esperado; así, mixtures made from it. That is, in the 0.031, 0.3,
la cuantificación de esos dos materiales fue más exacta. 3.69 and 41.87 % mixtures there was a dilution
Los resultados de la cuantificación por dPCR y factor close to 1:10, corresponding to the dilution
qPCR para la hoja 100 % GM fueron 41.87 y 45.45 factor used in the gravimetric preparation of the
% (Cuadro 7); así, se consideraron comparables. En mixtures.
este caso la medición se realizó con el ADN de una Lower uncertainty was obtained for the mixture
sola hoja, en la cual se determinó la presencia de la with lower concentration, relative to that obtained
modificación genética de MON810. Entonces, los va- by qPCR. However, the results of the quantification
lores 41.87 y 45.45 % mostraron que en ningún caso with qPCR of the 100 % GM leaf and the 10 % GM
Fluorescence Fluorescence
429.422 387.670
Amplification of hmgA Amplification of MON810
339.338 sequence of 10 % GM 306.336 sequence of 10 % GM
mixture with 1 ng of DNA mixture with 10 ng of DNA
249.253 per subarray 225.002 per subarray
10 %
159.169 143.668
69.054 62.334
21.000 19.000
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Cycle number Cycle number
0 36 0 35
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 31 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 31
8 27 8 26
ETE96-Ct
ETF13-Ct
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 22 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 22
18 18
16 13 16 13
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 9 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 9
24 4 24 4
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 0
32 32
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96
Fluorescence Fluorescence
469.429 409.424
Amplification of hmgA Amplification of MON810
370.943 sequence of 1 % GM 323.539 sequence of 1 % GM
mixture with 1 ng of DNA mixture with 100 ng of DNA
272.457 per subarray 237.654 per subarray
173.971 151.770 1%
75.486 65.885
23.000 20.000
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Cycle number Cycle number
0 36 0 36
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 31 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 31
8 27 8 27
ETF19-Ct
ETF18-Ct
72.261 64.282
22.000 19.000
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Cycle number Cycle number
0 35 0 36
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 31 A3 A9 A11
A1 A2 A4 A5 A6 A7 A8 A10 31
8 27 27
ETF14-Ct
22 8
ETF17-Ct
Figura 9. Curvas y mapas de amplificación de Mezcla GM al 10, 1 y 0.1 %. Columna A, resultados de amplificación secuencias
hmgA. Columna B, resultados de amplificación de secuencia MON810.
Figure 9. Amplification curves and maps of the 10, 1 and 0.1 % GM mixtures. Column A, results of amplification of the hmgA
sequences. Column B, results of amplification of the MON 810 sequence.
Cuadro 7. Resultados de la cuantificación de 0.1, 1, 10 y 100 % de la hoja de maíz genéticamente modificado (GM) por las téc-
nicas qPCR y dPCR.
Table 7. Results of quantification of 0.1, 1, 10 and 100 % genetically modified (GM) maize leaf using the qPCR and dPCR
techniques.
dPCR qPCR
Muestra
%GM Urelativa %GM Urelativa
se alcanzó el 50 % teórico esperado. Esto puede atri- mixture were closer to the expected value; and thus,
buirse a la eficiencia de amplificación de la secuencia the quantification of these two materials was more
evento específica de MON810 (Figura 5), la diferen- exact.
cia entre el ciclo de amplificación (Ct) para la secuen- The results of quantification by dPCR and qPCR
cia hmgA y MON810 es de 2.7 ciclos; ambos con for the 100 % GM leaf were 41.87 and 45.45 %
contenido similar de ADN (100 ng por reacción). Es (Table 7) and were thus considered comparable. In
decir, la prueba de amplificación para MON810 po- this case, measurement was done with the DNA of
dría afectar la eficiencia requerida y generar una am- a single leaf, in which the presence of the MON810
plificación que el Ct no se presente exactamente un genetic modification had been determined. Thus,
ciclo después que el de la secuencia endógena. Esto the values 41.87 and 45.45 % showed that no case
está de acuerdo con la relación de Ct con el factor reached the expected theoretical 50 %. This may
de dilución, según la igualdad 2n= Factor de dilu- be attributed to the amplification efficiency of the
ción, donde n es la diferencia de Ct (EURL-GMFF y specific MON810 event sequence (Figure 5). The
ENGL, 2010): difference in amplification cycles (Ct) between the
De acuerdo con el valor teórico del 50 % GM hmgA sequence and that of MON810 was 2.7 cycles;
para la hoja de maíz, el factor de dilución entre la the two had similar contents of DNA (100 ng
secuencia hmgA y MON810 es 0.5, al substituir en la per reaction). That is, the amplification assay for
igualdad anterior, la diferencia de Ct esperada es 1. MON810 could affect the required efficiency and
generate an amplification whose Ct does not occur
Conclusiones exactly one cycle after that of the endogenous
sequence. This is according to the relationship
En el presente estudio la técnica de PCR digital between the Ct and the dilution factor, 2n=dilution
se validó usando materiales de referencia certificados factor, where n is the Ct difference (EURL-GMFF
por institutos de metrología nacional e internacional. and ENGL, 2010).
Los resultados fueron comparables entre los valores In accordance with the theoretical value of 50 %
reportados en los certificados y los determinados GM for the maize leaf, the dilution factor between
experimentalmente con la plataforma OpenArray® the hmgA and MON810 sequences is 0.5; when
Real-Time PCR System. Además, los resultados se this value is substituted in the above equation, the
expresaron en número de copias para ERM-AD413, expected difference in Ct is 1.
y en porcentaje GM para DMR-436IIa, lo cual con-
tribuye a la validación de la técnica en la cuantifica- Conclusions
ción de secuencias transgénicas. La cuantificación de
hojas de maíz por PCR en tiempo real y PCR digi- In this study, the digital PCR technique was
tal con la presencia del evento MON810 después de validated using reference materials certified by
validar la técnica permitió obtener los resultados de national and international metrology institutes.
cuantificación de mezclas por PCR digital más cerca- Comparable results were found between the values
nos a los porcentajes en fracción masa de las mezclas reported in the certificates and those determined
realizadas que los obtenidos por la técnica tradicional experimentally with the OpenArray® Real-Time
de PCR en tiempo real. PCR System platform. Moreover, it was possible to
La caracterización de cada hoja recolectada per- express the results in copy numberfor ERM®-AD413
mitió establecer la presencia o ausencia del evento and in percent GM for DMR-436IIa, contributing
MON810; a la vez, esto condujo a realizar las mezclas to the validation of the technique for quantifying
genéticamente modificadas en fracción masa al 0.1, 1 transgenic sequences. Quantification of maize
y 10 %, con una hoja 100 % GM como calibrante leaves by PCR in real-time and digital PCR with
para los ensayos por PCR en tiempo real y el tejido the presence of the MON810 event after validating
liofilizado, lo cual mejoró la cuantificación. Con las the technique enabled quantification of mixtures by
mezclas liofilizadas se obtuvieron resultados compa- digital PCR closer to the percentages in mass fraction
rables entre las dos técnicas PCR en tiempo real y obtained by the traditional real-time PCR technique.
digital. Los resultados por PCR digital son los más Characterization of each collected leaf established
próximos a los valores esperados en fracción masa de the presence or absence of the MON810 event.
las mezclas. In turn, this led to genetically modified mixtures
En conclusión, la técnica de PCR digital a través of 0.1, 1 and 10 % in mass fraction, relative to a
de la plataforma OpenArray® Real-Time PCR Sys- 100 % GM leaf as calibrant for real-time PCR
tem es aplicable para cuantificar el material vegetal assays. Lyophilization of the leaf tissue improved
genéticamente modificado y puede utilizarse en la quantification. With the lyophilized mixtures, the
caracterización de materiales de referencia, usados results obtained with the two PCR techniques,
como calibrantes, en pruebas de PCR en tiempo real. real time and digital, were comparable. The results
obtained by digital PCR are those closest to the
Literatura Citada expected values in mass fraction of the mixtures.
In conclusion, the digital PCR technique using
Bhat, S., J. Hermann, P. Armishaw, P. Corbisier, and K. R. Ems- the platform OpenArray® Real-Time PCR System is
lie, K. 2009. Single molecule detection in nanofluidic digital
applicable to quantification of genetically modified
array enables accurate measurement of DNA copy number.
Anal. Bioanal. Chem. 394: 457-467. plant material and can be used in the characterization
CERA (GM Crop Database Center for Environmental Risk As- of reference material used as calibrants in real-time
sessment). 2012. ILSI Research Foundation, Washington, PCR assays.
D.C. http://www.cera-gmc.org/GmCropDatabaseEvent/
MON810%20#. (Consulta: enero de 2015. —End of the English version—
CIBIOGEM (Comisión Intersecretarial de Bioseguridad de los
OGM). 2010. Registro Nacional de Bioseguridad de los Or-
ganismos Genéticamente Modificados. CIBIOGEM, CO- pppvPPP
NACYT. http://www.conacyt.gob.mx/cibiogem/index.php/
resoluciones/permisos. (Consulta: agosto de 2013).
Corbisier, P., Broeders, S., Charles, S., Trapmann, S., Vincent,
S. and Emons, H. 2007. Certification report. Certification
of plasmidic DNA containing MON 810 maize DNA frag-
ments. Certified Reference Material ERM®-AD413. Ins- repository/handle/111111111/22252. (Consulta: agosto de
titute for Reference Material and Measurements (IRMM) 2013).
and European Reference Materials (ERM). 37 p. https:// EUR22948EN–2007. CERTIFICATION REPORT. Certifica-
ec.europa.eu/jrc/sites/default/files/rm/ERM-AD413_report. tion of plasmidic DNA containing MON 810 maize DNA
pdf. (Consulta: agosto de 2013. fragments Certified Reference Materials ERM®-AD413.
Corbisier, P., S. Bhat, L. Partis, V. R. D. Xie, and K. R. Ems- European Commission Joint Research Centre. Institute
lie. 2010a. Absolute quantification of genetically modified for Reference Materials and Measurements. EUR 22948
MON810 maize (Zea mays L.) by digital polymerase chain EN, ISBN 978-92-79-07139-3, ISSN 1018-5593, DOI
reaction. Anal. Bioanalytical. Chem. 396: 2143-2150. 10.2787/49996.
ENGL Working Group on Method Verification. 2011. Verifi- EURL-GMFF (European Union Reference Laboratory for
cation of analytical methods for GMO testing when imple- GM Food and Feed) and ENGL (European Network of
menting interlaboratory validated methods. Joint Research GMO Laboratories). 2010. Compendium of Referen-
Centre and Office for Official Publications of the European ce Methods for GMO Analysis. Joint Research Centre and
Communities, 23 p. http://publications.jrc.ec.europa.eu/ Office for Official Publications of the European Communities.