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Análisis de técnicas de recuento de Microorganismos.

Ramírez S Julián A., Parra V John A1, Adalucy Alvarez-Aldana2

Resumen Abstract
El aislamiento y obtención de cultivos puros The isolation and obtaining of pure cultures
posiblemente hayan sido las bases más have possibly been the most important
importantes en el desarrollo de la bases in the development of Microbiology.
Microbiología. Los primeros trabajos en The first works in Microbiology were made
Microbiología se hicieron en unas under experimental conditions that did not
condiciones experimentales que no allow being certain that pure cultures had
permitían tener la certeza de que se been obtained. Later, microbiologists
hubieran obtenido cultivos puros. Más observed that, apparently, the
adelante, los microbiólogos observaron microorganisms had a great capacity for
que, aparentemente, los microorganismos variation in terms of their morphological
tenían una gran capacidad de variación en appearance and physiological
cuanto a su aspecto morfológico y characteristics. A pure culture is one that
características fisiológicas. Un cultivo puro contains a single class of microorganism. In
es aquel que contiene una sola clase de practice, pure cultures are useful for
microorganismo. En la práctica los cultivos different reasons: they keep viable
puros son útiles por diferentes razones: organisms, allow subcultures to be
mantienen los organismos viables, permiten subjected to different analyzes. To obtain
hacer subcultivos para someterlos a the above, it is necessary to resort to
diferentes análisis. Para obtener lo anterior counting techniques. There are methods
es necesario recurrir a las técnicas de that allow establishing the number of
recuento. Existen métodos que permiten microorganisms in a given sample. There
establecer el número de microorganismos are methods that quantify the number of
en una muestra dada. Hay métodos que cells, and there are others that quantify the
cuantifican el número de células, y existen total mass of the population. The objective
otros que cuantifican la masa total de la of this study is to know the different
población. El objetivo de este estudio es techniques used for the counting of
conocer las diversas técnicas utilizadas microorganism cells, as well as to evaluate
para el recuento de células de the effectiveness of each of these methods
microorganismos, al igual que evaluar la of cell counting.
efectividad de cada uno de estos métodos
Keywords: Neubauer chamber, McFarland
de conteo de células.
pattern, plate count, microbial growth
Palabras Clave: cámara de Neubauer,
patrón de McFarland, recuento en placa,
crecimiento microbiano.

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1Estudiantes de III semestre. Programa de Microbiología. Universidad Libre Pereira.
2Docente. Programa de Microbiología. Universidad Libre Pereira.
INTRODUCCIÓN partículas discretas y el crecimiento es
entendido como un aumento en el número
Un medio de cultivo es un conjunto de total de partículas bacterianas. Para otros,
nutrientes, factores de crecimiento y otros el crecimiento implica el aumento de los
componentes que crean las condiciones microorganismos capaces de formar
necesarias para el desarrollo de los colonias debido a que sólo se tiene en
microorganismos(1). La diversidad cuenta el número de microorganismos
metabólica de los microorganismos es muy viables, esto es capaces de crecer
amplia; por ello, la variedad de medios de indefinidamente. Para los fisiólogos
cultivo es también muy grande, no bacterianos, bioquímicos y biólogos
existiendo un medio de cultivo universal moleculares una medida del crecimiento es
adecuado para todos ellos(2). el incremento de biomasa. Para ellos, la
Los microorganismos son seres ubicuos síntesis macromolecular y un incremento
que han colonizado todos los tipos de en la capacidad para la síntesis de los
ecosistemas: el agua, el suelo, el aire, el componentes celulares es una medida del
resto de organismos. Por ello todas las crecimiento. Para este grupo la división
manipulaciones para conseguir cultivos celular es un proceso esencial pero menor
puros se deben realizar en un ambiente que rara vez limita el crecimiento, ya que lo
estéril que impida el acceso al medio de que limita el crecimiento es la capacidad
otros microorganismos diferentes a los que del sistema enzimático para utilizar los
deseamos aislar(3). Se deben crecer dentro recursos del medio y formar biomasa(5).
de recipientes y medios de cultivo El recuento en placa es uno de los métodos
previamente esterilizados. Los recipientes más utilizados para determinar cuál es el
más utilizados en el crecimiento de número de microorganismos viables en un
microorganismos son los tubos de ensayo, medio líquido. Cuando la concentración es
los matraces (ambos para los medios baja se procede a filtrar la muestra a través
líquidos) y las placas de Petri (para los de una membrana que será pasada al
cultivos sólidos)(4). medio de cultivo, en una placa de Petri. Los
El crecimiento de una población bacteriana microorganismos retenidos en la membrana
puede ser entendido desde diferentes se desarrollarán formando colonias,
perspectivas y de acuerdo a éstas se permitiendo su cuantificación. Cuando la
puede llegar a determinar la medida del concentración es alta, se procede a la
crecimiento mediante diversas preparación de diluciones seriadas en una
metodologías(3). Para algunos, el secuencia de 1:10, alcanzándose
-7
diluciones de 10 o mayores. Pequeñas
crecimiento es la capacidad para
multiplicarse que tienen las células alícuotas de esas diluciones son
individuales, esto es iniciar y completar una sembradas en medio nutritivo en placa,
división celular. De esta forma, se donde las bacterias se desarrollan
considera a los microorganismos como formando colonias. En las placas donde la

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1Estudiantes de III semestre. Programa de Microbiología. Universidad Libre Pereira.
2Docente. Programa de Microbiología. Universidad Libre Pereira.
concentración de la alícuota sembrada es El recuento microscópico es una técnica
muy alta, las bacterias formarán común, rápida y poco costosa que utiliza un
crecimiento másivo, pero si la equipamiento fácilmente disponible en un
concentración es muy baja, el número de laboratorio de microbiología. Para estos
UFC podrá ser muy bajo. Entre los dos recuentos se utilizan generalmente
extremos de las diluciones, alguna de las cámaras de recuentos, aunque también
placas contendrá un número de colonias pueden realizarse a partir de muestras
entre 30 y 300, permitiendo la filtradas en membranas y transparentadas
cuantificación(6,7). o teñidas con colorantes fluorescentes(9).
La mayor dificultad del recuento en cámara
Del método de recuento en placa se dividen es obtener reproducibilidad en el llenado de
dos variables muy utilizadas que son: la cámara con líquido. Otra dificultad es la
- El recuento en placa por siembra en adsorción de las células en las superficies
profundidad: que consiste en añadir del vidrio, incluyendo pipetas. Esta
medio de cultivo fundido y enfriado a adsorción es crítica en el proceso de
50ºC sobre placa de Petri que dilución de la muestra y se minimiza al
contiene una cantidad determinada realizar las diluciones en medios de alta
de la muestra diluida. Se tapa la fuerza iónica (solución fisiológica o medios
placa y se rota para mezclar la mínimos sin fuente de carbono(10)).
muestra en el agar. Cuando el agar Los recuentos microscópicos directos
solidifica se incuban las placas. Las permiten determinar el número de células
colonias se desarrollan tanto dentro microbianas, por observación directa en el
del agar como en la superficie. Es un microscopio. Presentan una gran ventaja ya
método generalmente utilizado para que la muestra puede utilizarse tal cual, o
el recuento de microorganismos puede prepararse una dilución tal como se
anaerobios facultativos o realiza para otros métodos de
microaerofilos. recuento(9,11).
- El recuento en placa por siembra en
superficie que consiste en la siembra El objetivo de este estudio es conocer
de un volumen conocido de la técnicas variadas de recuento de células de
dilución de la muestra sobre la microorganismos, al igual que medir la
superficie de un medio de cultivo en efectividad de estos métodos de conteo de
placa Petri. En este método todas microorganismos.
las colonias crecen sobre la
superficie del medio. Generalmente
se utiliza esta técnica para el
recuento de bacterias aerobias(8).

1Estudiantes de III semestre. Programa de Microbiología. Universidad Libre Seccional Pereira.


2Docente. Programa de Microbiología. Universidad Libre Seccional Pereira.
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METODOLOGÍA Los microorganismos utilizados en esta
práctica fueron Saccharomyces cerevisiae
Preparación de medios de cultivo. y Bacillus subtilis. Se formaron 2 baterías
Se prepararon dos medios de cultivo de tubos (correspondiente a las 2 especies
solidos (Agar PDA, Agar TSA) para permitir evaluadas) con un tubo correspondiente de
el crecimiento microbiano. 15De igual cada dilución.
manera se preparó la cantidad suficiente de Los medios de cultivo inoculados con la
caldo nutritivo de acuerdo con las cepa B. subtilis se incubaron a 37ªC por 24
indicaciones del fabricante para realizar las horas. Los de S. cerevisiae se incubaron a
diluciones de cada microorganismo (de 10-1 temperatura ambiente (TA) por el mismo
a 10-10). tiempo.
Procesamiento de las muestras. Recuento de células
Tanto los agares como el caldo nutritivo se Se contaron el número de UFC de cada
esterilizaron a 121°C durante 15 minutos. placa tanto de profundidad como de
Inoculación del medio de cultivo. superficie. Para la

cámara de Neubauer se utilizaron las RESULTADOS Y DISCUSIÓN:


diluciones 10-2 de ambos microorganismos
(12). Tras la realización de cada uno de los
pasos descritos en la metodología, se
obtuvieron los siguientes resultados

Tabla 1. Conteo de UFC en medios


sembrados por método de superficie
Tabla 2 Conteo de UFC en medios
Dilución Saccharomyces Bacillus sembrados por método de profundidad
siembra cerevisiae subtilis
en (número de (número Dilución Saccharomyce Bacillus
superficie UFC) de UFC) siembra en s cerevisiae subtilis
10-1 Incontable Incontable profundida (número de (número
10-2 Incontable Incontable d UFC) de UFC)
10-3 Incontable Incontable 10-1 Incontable Incontabl
10-4 Incontable Incontable e
10-5 Incontable Incontable 10-2 Incontable Incontabl
10-6 Incontable Incontable e
10-7 Incontable Incontable 10-3 Incontable Incontabl
10-8 Incontable Incontable e
10-9 Incontable Incontable 10-4 Incontable Incontabl
10-10 Incontable Incontable e

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2Docente. Programa de Microbiología. Universidad Libre Seccional Pereira.
4
10-5 Incontable Incontabl
e
10-6 Incontable Incontabl
e
10-7 Incontable Incontabl
e
10-8 Incontable Incontabl
e
10-9 Incontable Incontabl
e
10-10 Incontable Incontabl
e Fig. 2 Recuento de células de Bacillus
subtilis en cámara de Neubauer

Tabla 3 Promedio de células/mL del


recuento de las diluciones 10-2 de ambos
microorganismo en cámara de Neubauer Recuento siembra en superficie
Saccharomyces cerevisiae (tabla 1)
Dilución Saccharomyces Bacillus
cerevisiae subtilis Los resultados obtenidos en la siembra por
(cells/mL) (cells/mL) superficie no fueron los esperados puesto
10-2 1,0*108 4,6*107 que hubo contaminación de otros
microorganismos que dificultaron el
recuento de colonias en diversas diluciones
realizadas. También se presentó el
inconveniente de que hubo un crecimiento
masivo, por lo que no se formaron UFC en
algunas diluciones impidiendo el recuento
de estas (13).

Recuento siembra en profundidad


Saccharomyces cerevisiae (tabla 2)

Como en el recuento en placa anterior, los


Fig. 1 Recuento de células de resultados aquí también no fueron ideales.
Saccharomyces cerevisiae en cámara de
Por condiciones similares de contaminación
Neubauer
de otros microorganismos no fue posible el
conteo de las UFC en las diversas
diluciones. En el fondo de la placa el
crecimiento de la levadura fue bueno, en la
mayoría fue un crecimiento masivo. En
todas las diluciones fue posible apreciar la

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migración de algunas UFC a través del esta levadura o una mala inoculación del
medio hacia la superficie (14). medio líquido para la realización de una
turbidez similar a la del patrón de
Recuento siembra en superficie Bacillus McFarland 2(12).
subtilis (tabla 2)
Recuento en cámara de Neubauer
Los resultados obtenidos en la siembra por Bacillus subtilis (tabla 3)
vertido superficial con este microorganismo
tampoco fueron las ideales. Crecimientos Con respecto a la constante del número de
masivos probablemente por humedad del células respectiva al patrón de McFarland
medio, presencia de microorganismos utilizado para la inoculación del medio del
contaminantes. No fue posible realizar un cual fue tomada la muestra para esta
conteo de las colonias puesto que en la práctica, este fue el resultado más preciso.
mayoría fueron formaciones de más de 300 El conteo de células dio por resultado
unidades formadoras de colonia (13–15). 46100 cells/mm3 (fig. 2) que en unidades de
mL equivale a 4,6*107 cells/mL, dato que es
Recuento siembra en profundidad de cierta forma cercano al valor de la
Baciluus subtilis (tabla 2) constante de McFarland 6,0*108
Como en el recuento anterior, no fue cells/mL(16).
posible contar el número de UFC en la CONCLUSIONES
placa debido a la opacidad del medio,
además de factores como los que afectaron Se evaluaron algunos de los métodos más
las placas anteriormente nombradas no utilizados para el recuento de
permitieron que se llevase a cabo el microorganismos determinando así las
recuento (13). ventajas y desventajas de cada uno.
Aunque existan muchos tipos de recuento
Recuento en cámara de Neubauer de células, algunos mejores que otros, la
Saccharomyces cerevisiae (tabla 3) gran mayoría siempre tendrá desventajas.
Los resultados del número de células por Unas de las desventajas del recuento por el
este método fueron de 100 cells/mm3 (fig. método de siembra en profundidad y en
1) que al ser convertidas a la unidad superficie son: el tiempo prolongado que se
utilizada para el patrón de McFarland fue necesita para la preparación de los medios
de 1,0*105 cells/mL. La muestra para este y el riesgo de contaminación por otros
recuento fue tomada de la dilución 10-2. En microorganismos que pueden afectar el
comparación con el número de células medio de cultivo.
dadas por el patrón de turbidez de Una de las ventajas del recuento de células
McFarland, la diferencia es mucha, por lo viables es precisamente que forman UFC.
que no es un resultado ideal. Esto puede Mientras que en recuentos microscópicos
significar una inhibición del crecimiento de no se tiene la certeza de si se trata de una
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2Docente. Programa de Microbiología. Universidad Libre Seccional Pereira.

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célula viva o muerta, a menos de que esta Bioinformation [Internet]. 2015 [cited
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Sin duda una de las ventajas del método http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
microscópico es que por medio de este se 26124557
puede brindar información adicional sobre 4. Brugger SD, Baumberger C, Jost M,
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si el tamaño de la célula del 5. Schaechter M. A brief history of
microorganismo es muy pequeña esta será bacterial growth physiology. Front
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