Informe Laboratorio de Genética Molecular

“Amplificación por PCR de un fragmento del gen que codifica para

la proteína GAPDH humana utilizando DNA genómico como
molde”

Profesora : Marcela Bravo

Alumna : Karen Esteves Zúñiga
Fecha : 24/09/15
INTRODUCCIÓN

La técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction), o reacción en cadena de la Polimerasa, es una técnica in
vitro de síntesis de DNA, que permite multiplicar el número de copias de un gen o fragmento de DNA de
interés, en condiciones controladas ,por acción de la enzima Taq polimerasa, a través de la repetición de
ciclos de: denaturación ,hibridación y elongación de estos fragmentos de DNA, produciendo así un aumento
exponencial de la cantidad de DNA ,que posteriormente se puede visualizar mediante técnicas
electroforéticas (Depix 2012).

La reacción de esta técnica como se mencionó anteriormente consta de 3 etapas básicas de repetición
(denaturación ,hibridación y elongación) ,estas etapas conforman un ciclo que se repite entre 30 a 40 veces
siendo lo más común una repetición de 35 ciclos, que ocurre en una máquina conocida como el
termociclador, la cual aumenta o disminuye la temperatura de los tubos que contienen la reacción de PCR en
periodos cortos de tiempo. La realización para este práctico se efectuó en 32 ciclos en siete pasos
establecidos, que se mencionará en detalle en el ítem procedimientos.

En la etapa de denaturación, se aplica una alta temperatura (92-95°C),esta temperatura permite la separación
de la doble hebra de DNA ,dejándolo como hebra simple, favoreciendo así la separación de proteínas unidas
al DNA como histonas y la eliminación de estructuras secundarias. En la siguiente etapa que corresponde a la
Hibridación, se disminuye la temperatura (50-60°C),a esta temperatura los partidores, los cuales tienen una
secuencia complementaria al DNA de interés y que se une al DNA en sentido 5´ 3´,esto permite que
dichos partidores se unan a la hebra simple del DNA.La última etapa de elongación, se efectúa a 72 °C,
temperatura a la cuál la Taq Polimerasa extiende la longitud de los partidores ,añadiendo los diferentes
nucleótidos libres en el orden que le va dictando la secuencia de nucleótidos de la cadena que actúa como
molde (Iram Pablo Rodríguez Sánchez 2004).

Para que la amplificación ocurra, se debe hacer una mezcla de reacción de los siguientes componentes en el
siguiente orden: agua mili Q, el buffer o tampón, magnesio como cofactor enzimático de la polimerasa, los
cuatros deoxiribonucleótidos trifofatos(dNTPs), primers Forwards y Reverse en exceso , la muestra de DNA, y
finalmente la Taq Polimerasa.

Las aplicaciones de esta técnica en las diversas áreas de la biología, es útil porque, permite la identificación
de distintos individuos a quienes pertenecen restos de sangre o de otros tejidos, diagnóstico tanto de
enfermedades genéticas, como enfermedades infecciosas producidas por patógenos virales, bacterianas y
hongos, medir la expresión de un determinado gen, además esta técnica no sólo estudiar organismo vivos
,sino también restos fósiles ,congelados o momificados, finalmente también se ha visto cómo en años
recientes ,métodos de PCR para determinar la huella genética en humanos, que actualmente son aplicados
en el ganado (Cunningham EP 2001).
OBJETIVOS:

 Conocer la técnica de PCR

 Amplificar el gen GAPDH humana desde DNA genómico purificado de sangre.

MATERIALES

 Termociclador
 Taq polimerasa
 Buffer PCR 5 X
 MgCl2 25Mm
 Mezcla dNPs 2.5 mM(dATP, dCTP, dGTP, y dTTP)
 Primers mix 25 µM
 Matraz 50 ml

h-GADPHFormard (Bam HI)

5’- GATC GAATTC CAC CAC CAT GGA GAA GGC TGG-3’

5’- GCGC GAA TTC GGC AGT GAT GGC ATG GAC TGTG- 3’

 cDNA(DNA genómico)
 H2O DEPC
 Buffer carga DNA 6X(12% glicerol, 60mM EDTA pH 8.0 , 0.6% SDS, 0.15% azul de bromofenol)
 SYBR-Safe
 Microondas
 Agarosa 0.7 %
 microonda
 Buffer TBE 10X (1M tris, 1M ácido Bórico, 20mM EDTA)
Buffer de carga DNA 6X (12% glicerol, 60mM EDTA pH 8,0 0,6% SDS, 0,003% azul de bromofenol)
 SYBR – Safe
 Estándar de 1kb.
- 6 Eppendorf de 0.6 ml
5 Eppendorf de 1.5 ml
 Cámara de electroforesis horizontal
 Micropipeta 20uL y 1000Ul
 Transiluminador
PROCEDIMIENTO :

 Se preparó la mezcla de PCR, realizadas en medidas y orden establecidas por el profesor a cargo
(Tabla.1), además de un programa termo circulante definido (Tabla.2).

Tabla 1.Mix de PCR

Orden y concentración de Para 1 reacción Para 6 reacción

componentes
Agua mili Q 8,45 uL 50,7uL
Buffer o tampón 5X 3λ uL 18uL
Magnesio 25 mM 0,9uL 5,4uL
dNTPs 2.5 mM 1,2uL 7,2uL
Mix Primers 25 µM 0,3uL 1,8uL
Muestra cDNA 1uL 6uL
Taq Go – taq 0,15uL 0,9uL

Para el mix PCR, que se realizó a un volumen total de 90µl en 6 reacciones, se obtuvo un promedio de 15 µl.

Según el orden que muestra la tabla 1, en un solo tubo Eppendorf se agregó una mezcla de todos los
componentes en 14uL, al final se agregó el cDNA completando los 15uL promedio.

Luego el tubo que contiene el mix , se colocó en el Termociclador utilizando un programa según a los
siguientes parámetros mostrados en la Tabla 2:

Tabla 2. Programa termo circulante

PASOS TIEMPO TEMPERATURA

STEP 1 2 minutos 95 °C
STEP 2 1 minuto 95 °C
STEP 3 1minuto 60 °C
STEP 4 1minuto 60°C
STEP 5 Volver 32 veces al STEP 2
STEP 6 10 Minutos 72°C
STEP 7 Indefinido 4°C

Para el STEP 1 hasta STEP 2 es correspondiente a una desnaturación

En la temperatura de Annealing, dado en el STEP 3, fue calculado en 5°C menos que el Tm de los Primers
El STEP 5 corresponde a una extensión.
El STEP 6 corresponde a una extensión final, y el STEP 7 es el tiempo de mantención.
Para el tiempo de extensión, se calculó utilizando la relación 1000pb por 1min
Finalmente, se obtuvo un fragmento esperado de 619pb.
RESULTADOS

FIG 1: GELES DE AGAROSA 0.7%.Según los resultados de electroforesis de muestras GADPH y P0 en PCR
,se apreció bandas según los estándares100pb Base Gene Ruler #SM0243 ( VER ANEXO) y los P0, las
muestras de GADPH se observó unas bandas tenues.

DISCUSIÓN

La elaboración de la técnica de electroforesis, fue para verificar el funcionamiento del PCR y si era posible
obtener bandas en las muestras de GADPH y P0, de ello se observó ausencia de bandas en GADPH, en P0
hay presencia de bandas la cual fueron muy tenues, por lo tanto el PCR no se realizó de forma correcta, al
compararlo con el estándar se debió haber observado bandas mucho más grandes, ya que el estándar es de
100pb y las muestras de GADPH esperado es de 619pb. Para las bandas tenues obtendas en P0 podría
corresponder a los Primers y los dNTPs.

La técnica PCR no funcionó debido a:

1. No hubo buen funcionamiento de la taq polimerasa ,debido a que si hubiera funcionado se observaría
alguna banda en la muestra de GADPH, por lo tanto en P0 se comprueba el error obtenido.(Las
muestras fueron recibidas por la docente a cargo del práctico y por lo tanto estas muestras no se
encuentran dañadas)
2. El DNA no estaba íntegro, debido a la poca cantidad obtenida
3. Error de pipeteo en el práctico.
ANEXO:

Estándar 100pb Base Gene Ruler #SM0243

CUESTIONARIO:

1.-¿Cuál es el origen de la Taq polimerasa y por qué se usa esta enzima?

Fundamento

La Taq DNA Polimerasa es una enzima termoestable de aproximadamente 94 kDa, aislada de la eubacteria
Thermus aquaticus(bacteria que vive en manantiales calientes y fuentes hidrotermales), y la
polimerasa Taq que de ella se extrae, ha sido caracterizada como una extremoenzima, capaz de soportar las
condiciones de alta temperatura requeridas durante el proceso de PCR sin desnaturalizarse. Por esta razón
ha reemplazado a la ADN polimerasa proveniente de E. coli .(Saiki, RK; et al. 1988).

2.-¿Qué es la temperatura de anneling?

Fundamento

Es la temperatura a la cual los primers se unen al ADN molde, mediante complementariedad de bases. Los
mismos hibridizan en regiones específicas de la hebra sencilla de DNA. La temperatura de “annealing”
depende del Tm de los iniciadores (Típicamente se utilizan 5 grados por debajo del Tm más bajo de los dos
iniciadores).
BIBLIOGRAFIA

Chávez Planes MA, Díaz Brito J, Pérez U, Delfín J. «Temas de enzimología.» (Facultad de la Universidad de la Habana)
Tomo 2 (1990).

Cunningham EP, Meghen CM. «Sistemas de identificación biológico:Marcadores genéticos.» Scientific and Technical ,
2001: 491-499.

Depix, María Soledad. Fundamentos y Aplicaciones de Técnicas de Biología Molecular en el laboratorio. Primera Edición.
Santiago: Universidad Santo Tomás, 2012.

Iram Pablo Rodríguez Sánchez, Hugo A.Barrera Saldaña. La reaccion en cadena de la Polimerasa a dos décadas de su
invención. Vol. VII. 3 vols. Universidad Autónom de Nueva León, 2004.

P., Prácticas de biología molecular. Concepción J. Puerta B. y Claudia P. Ureña. Prácticas de Biologia Molecular. Pontificia
Universidad Javieriana, 2005.

Westermeir, Reiner. Electrophoresis in Practice. 2006.

Saiki, RK; et al. (1988). «Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA
polymerase.»