INSTITUTO DE BIOQUÍMICA

FACULTAD DE CIENCIAS
UACh

2004
 INDICE DE CONTENIDOS Pág.
SOLUCIONES Y TAMPONES 3
PROBLEMAS SOLUCIONES 7
PH Y TAMPONES 8
PROBLEMAS TAMPONES 14
ANEXO MICROPIPETAS 17

BLOQUE PROTEÍNAS 19
SESIÓN 1 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD 21
SESIÓN 2 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS 23
SESIÓN 3 ELECTROFORESIS EN GEL POLIACRILAMIDA Y 26

TRANSFERENCIA
SESIÓN 4 ANÁLISIS DE WESTERN 30
PAUTA INFORME GLOBAL 32

BLOQUE ENZIMAS 35
SESIÓN 5 FRUCTOSA 1,6 BISFOSFATASA 41
SESIÓN 6 FOSFATASA ALCALINA 43

BLOQUE ÁCIDOS NUCLEICOS 47

SESIÓN 7 AISLAMIENTO ADN PLASMIDIAL Y GENÓMICO
SESIÓN 8 CARACTERIZACIÓN ADN RECOMBINANTE 54

DIGESTION ADN PLASMIDIAL Y GENÓMICO

TRANSFERENCIA DE SOUTHERN (DEMOSTRATIVO) 62
SESIÓN 9 AMPLIFICACIÓN PCR 66
ESQUEMA PCR 71
CUESTIONARIO 72
SOLUCIONES Y TAMPONES

I. SOLUCIONES

Una solución es una mezcla homogénea de dos o más componentes. El

componente que está en mayor proporción se llama solvente y el o los
componentes que están en menor proporción se llaman solutos. En soluciones
líquidas, el solvente es líquido en tanto que los solutos pueden ser sólidos,
líquidos o gases. La mayoría de las soluciones usadas en bioquímica son
soluciones acuosas (solvente agua).
Para caracterizar una solución no basta indicar sus componentes, sino
que también la proporción en que estos están presentes en la solución, es decir,
la concentración de cada uno de los solutos en la solución.

2
UNIDADES DE CONCENTRACIÓN

Las más usadas en la práctica son de dos tipos:

-. Unidades de concentración referidas a volumen: Indican cantidad de soluto

disuelto por unidad de volumen de solución.
Ej.: la molaridad, la normalidad, porcentaje p/v, g/l, etc.

-.Unidades de concentración referidas a peso: indican cantidad de soluto

disuelto por unidad de peso de solución o de solvente.
Ej.: % p/p, molalidad.

1.-Molaridad (M): número de moles de soluto por litro de solución.

Para preparar una solución de molaridad dada es necesario conocer
el peso molecular (PM) del soluto.

Se usan las relaciones:

Peso soluto (g) = número de moles de soluto

PM (g/mol)

N moles de soluto = M
Volumen solución (l)

Ej.: Una solución 1 M (1 molar) de NaCl contiene 1 mol (58,8g) de NaCl por
litro. Un mol de NaCl corresponde a un valor igual al número de Avogadro de
moléculas, que es 6,023 x 1023.
La concentración de iones en solución también se indica en unidades molares,
en este caso el ión es la molécula.

Ejemplos: Consideremos la solución 1 M de NaCl. Los enlaces iónicos de la red

cristalina de cloruro de sodio se rompen al disolverse la sal.

NaCl ------------- Na+ + Cl-

Por cada mol de NaCl sólido se forma 1 mol de Na + y un mol de Cl-. Luego:

Concentración de Na+ = 1M
Concentración de cloruro = 1 M
Para las moléculas más complejas como MgCl2

3
 MgCl2 ------------- Mg+2 + 2 Cl-

Una solución de cloruro de magnesio 1M contiene:

Concentración de Mg+2 = 1 M
Concentración de cloruro = 2 M

Las concentraciones de soluciones diluidas se suele expresar en

unidades que son submúltiplos de M:

Milimolaridad (mM): número de milimoles de soluto por litro de

solución.
La milimolaridad y los otros submúltiplos se definen en forma análoga:
Milimolaridad (mM): 1 mmol = 10-3 moles, luego 1mM = 10-3 M
Micromolaridad (M) 1mol = 10-6 moles, luego 1M = 10-6 M
Nanomolaridad (nM) 1 nmol = 10-9 moles, luego 1nM = 10-9 M

2. Normalidad (N): Número de pesos equivalentes (PE) de soluto

por litro de solución. Solamente para algunos compuestos se define
un PE, y este siempre tiene relación con la reactividad del
compuesto.

En general: PE = PM
N
Ácidos y bases: n = N de protones que puede ceder (el ácido) o captar
(la base) por molécula. Compuestos que sufren reacciones redox: n= N de
electrones captados (agente oxidante) o cedidos (agente reductor) por
molécula.

3. Peso de soluto/volumen de solución en g/l, mg/l: Esta es la

forma más sencilla de indicar la concentración de una solución, es la
forma más usual, aparte de la molaridad.

4. Porcentaje peso/volumen (% p/v): Peso de soluto en gramos por

100 ml de solución (g%). Se habla de porcentaje ya que 100 ml de
una solución acuosa relativamente diluida pesan aproximadamente
100g. Para soluciones muy diluidas se usa el submúltiplo mg% = peso
del soluto en mg por 100 ml de solución.

4
5. Porcentaje peso/ peso (%p/p): Peso en gramos de soluto por
100 gramos de solución. La concentración de la mayoría de los
ácidos comerciales viene dada en %p/p. Aquí la proporción de soluto
puede ser mayor que la proporción del solvente. Ej.: H 2SO4 96%.
Para poder transformar %p/p a concentración molar o normal es
necesario conocer la densidad (d) de la solución.

Ejemplo: Calcular la molaridad de HCl comercial del 28%, densidad 1,15 (kg/l).
Primero calculamos cuanto pesa 1 litro de la solución.

1 l x 1,15 (kg/l) = 1,15 kg = 1150 g

Ahora calculamos el peso de HCL puro contenido en este litro:

100 g de solución contienen 28 g, por lo tanto 1150 g de solución

contienen 1150g x 0,28 = 322g

Finalmente, calculamos a cuántos moles corresponde este peso de HCl: PM del

HCl = 36,5 (g/mol)

322 (g) = 8,82 moles

36,5 (g/mol)

Hemos calculado que 1 litro del ácido comercial contiene 8,82 moles de HCl, es
decir, su concentración es 8,82 M.

6. Molalidad (m): Número de moles de soluto por 1000 gramos de

solvente. Esta unidad de concentración se usa solamente para
ciertos cálculos físico-químicos. Expresar la concentración en estas
unidades presenta la ventaja de que se hace independiente de la
temperatura. Al contrario, una concentración expresada en
unidades referidas a volumen, como la molaridad, varía con la
temperatura, ya que ésta afecta el volumen. Para soluciones acuosas
diluidas m es prácticamente igual a M.

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

5
 Para preparar una solución de un soluto dado se puede usar el soluto puro
(generalmente sólido) o una solución concentrada de él en el mismo solvente
(solución stock). Este último caso constituye una dilución.

Para diluciones rige la relación:

V1 x C1 = V2 x C2
V1 = volumen de la solución concentrada
C1 = concentración de la solución concentrada
V2 = volumen de la solución diluida
C2 =concentración de la solución diluida

C1 y C2 pueden ser unidades de concentración de cualquier sistema referido a

volumen.

Ejemplo: En un matraz aforado de 100 ml se colocaron 10 ml de una solución

2M de cloruro de sodio y se aforó con agua. ¿Cuál será la concentración de la
solución resultante?

Nuestro sentido común nos dice que la respuesta será 0,2 M, ya que la solución
se diluyó 10 veces. El cálculo según la relación dada sería:

C2 = V1 x C1 = 10 ml x 2M = 0,2 M
V2 100 ml
PROBLEMAS SOLUCIONES

1.- a) ¿Cuántos g de NaOH sólido se requieren para preparar 500 ml de una

solución 0,04 M?

b) Exprese la concentración de la solución preparada en a) en términos

de N, g/l, (% p/v).

2.- ¿Cuántos mililitros (ml) de H 2SO4 3M se requieren para preparar 500 ml de

una solución de H2SO4 de concentración?
a) 0,05 M b) 0,002 N

3.- Describa la preparación de 3 litros de HCl 0,25 M, utilizando una solución

comercial concentrada de HCl (32% p/p, d= 1,16 kg/l).

6
4.- 50 ml de H3PO4 85% p/p, d= 1,71 g/ml se diluyeron a 200 ml con agua.
Calcule la normalidad de la solución.

5. a) ¿Cuántos ml de NaCl 0,5 M se necesitan para preparar 2 litros de NaCl 2

mM?

b) ¿Cuántos ml de KCl 0,3 M se necesitan para preparar 2 litros de solución 50

mM?

6.- Ud. dispone de varias soluciones concentradas: NaCl 2M; KCl 0,5 mM;
MgCl2 100 mM y CaCl2 1,3 M. A partir de esto, describa la preparación de 2 l de
una solución que contenga NaCl 120 mM, KCl 35 M, MgCl2 0,03mM y Na2SO4
0,06 M.

7.- Respecto de la solución preparada en 6, calcule la concentración para el

anión Cl- y para el catión Na+.

pH Y TAMPONES

ACIDOS Y BASES

Según la definición de Bronstedt:

ÁCIDO: es un compuesto que tiende a ceder protones al medio.

BASE: es un compuesto que tiende a captar protones del medio.

En medio acuoso, la reacción correspondiente de un ácido HA será:

HA + H2O -- H3O+ + A –

u obviando la participación del agua:

HA -- H+ + A- (1)

7
Considerando esta reacción en el sentido inverso, la especie a- puede captar

protones. A- es la base conjugada de HA.

Similarmente para una base B:

B- + H+ - BH+ (2)

BH+ es el ácido conjugado B.

Ejemplos de bases según Bronstedt son los compuestos orgánicos básicos, que

deben su basicidad al grupo funcional amino.

FUERZA DE ACIDOS Y BASES

Un ácido o una base fuerte es el que está completamente

disociado en solución. En cambio, un ácido débil está solamente parcialmente

disociado y la base parcialmente protonada.

Ácidos fuertes son: HCl, HNO3, HClO4, H2SO4 (ambos protones), H3PO4

(solamente el primer protón que se disocia). Bases fuertes son: NaOH, KOH,

etc. Ácidos y bases débiles: prácticamente todos los ácidos y bases orgánicos

pertenecen a este grupo.

Ácidos y bases débiles

Consideremos a modo de ejemplo el ácido acético, HOAc.

Fórmula estructural: CH3- COOH

Este ácido débil posee un solo protón ácido. En solución acuosa coexisten en

equilibrio moléculas de la especie protonada con moléculas del anión acetato

(OAc) y protones. La relación entre la concentración de las especies nombradas

a una temperatura determinada está dada por la constante de equilibrio de la

reacción de disociación, llamada constante de acidez, Ka:

8
 HOAC ---- OAc- + H+ (3)

Ka = OAc H+

HOAc

Ka de HOAc (25 C): 1,78 x 10-5

Se suele expresar la acidez a través del pKa en vez de usar Ka:

pKa = - log Ka

pKa de HOAC (25 C)=4,75

Se cumple:

que a mayor Ka ======== menor pKa ===== mayor acidez

Con el fin de comprender mejor el significado de la constante de

acidez, calcularemos la concentración de las especies presentes en una solución

0,1 M de HOAc.

Según la ecuación 3

H+ = OAc = x

HOAc = 0,1 –x

El valor numérico de Ka indica que HOAC estará poco disociado, luego podemos

aproximar:

HOAc = 0,1

Reemplazando en la expresión de Ka

Ka = x2 = 1,78 x 10-5

0,1

x = 1,33 x 10-3 M

Es decir, en nuestra solución:

9
 HOAc = 0,1 M

OAc = H+ = 1,33 mM

Comprobamos que la aproximación hecha fue correcta.

El pH de la solución es igual a pH = - log (1,33 x 10 -3) = 2,88

Para una base débil B se puede definir la constante de basicidad K b

Kb = BH+

B H+

Sin embargo, lo usual es caracterizar las bases débiles a través de la constante

de acidez de su ácido conjugado BH + (invirtiendo la reacción 2). Para un par

ácido/base conjugada se cumple:

Ka x Kb = Kw y

Kw = H+ x OH- = 10-14 (25 C)

Kw = constante de disociación del agua

ECUACIÓN DE HENDERSON-HASSELBACH

En forma análoga a lo visto para HOAC, para un ácido débil HA:

Ka = A- H+

HA

Despejando H+ y aplicando log se obtiene

pH = pKa + log A- Ecuación de Henderson-Hasselbach

HA

Esta ecuación establece la relación entre pH y la proporción entre la especie

protonada y desprotonada. Se usa para calcular el pH de la mezcla de un ácido

10
débil con un ácido fuerte o una base fuerte de un ácido débil con su sal,
mezclas tampón, etc.
Solución tampón (solución amortiguadora o buffer): Es una solución cuyo pH se
mantiene prácticamente constante cuando se le agregan pequeñas cantidades
de ácido o base. Las soluciones tampón son sistemas formados por un ácido
débil y su base conjugada o por una base débil con su ácido conjugado.

Zona tamponante de un sistema tampón: Es el intervalo de pH en el cual el

sistema posee propiedades de tampón, depende del valor del pK a de la especie
protonada. Un tampón es "bueno" aproximadamente 1 unidad de pH alrededor
del pKa. Los valores de pKa para algunos tampones de uso común en bioquímica
están contenidos en la tabla 1. También se usan mezclas de dos diferentes
sistemas tampón, ejemplos: Tampón Tris/fosfato,
trietanolamina/dietanolamina.

Capacidad de una solución tampón: La capacidad de una solución tampón

indica la cantidad de ácido o de base que es capaz de absorber sin cambiar
fuertemente su pH y depende de:
- pH: es máxima para pH = pKa
- Concentración: a mayor concentración, mayor capacidad tamponante.

Concentración de una solución tampón: Es la suma de las concentraciones de

la especie protonada y de la especie desprotonada.

Compuesto pKa (20ºC)

Ácido fosfórico (pka1) 1,96
Glicina 2,45
Ácido cítrico (pKa1) 3,10
Ácido fórmico 3,75
Ácido acético 4,75
Ácido cítrico (pKa2) 4,75
Ácido cítrico (pKa3) 5,40
MES (ácido conjugado) 6,15
Imidazol (ácido conjugado) 7,00
Ácido fosfórico (pKa2) 7,21
HEPES (ácido conjugado) 7,55
Trietanolamina (ácido conjugado) 7,77
TRIS (ácido conjugado) 8,08
Ácido fosfórico (pKa3) 12,30

11
Selección de un tampón:

Las variables a considerar son en primer lugar:

a) El pH al cual deseamos trabajar

b) La capacidad que necesitamos

Otros aspectos importantes pueden ser:

c) Solubilidad de los compuestos
Ejemplo: Una desventaja de los buffer de fosfato es la baja solubilidad de
sus sales.
d) Variación del pH con la temperatura:
Ejemplo: Una desventaja de los tampones de Tris es que su pH varía
notoriamente con la temperatura.
e) Volatilidad: Algunos sistemas tampón presentan la ventaja de ser volátiles.
Ejemplo: Acetato de amonio, bicarbonato de amonio.
f) Transparencia a la luz U.V.: Cuando se desea detectar un compuesto por
absorciometría, es necesario usar un buffer que sea suficientemente
transparente a la longitud de onda de la determinación.
g) Interacciones entre el sistema tampón y las sustancias en estudio.
Ejemplo: influencia de un sistema tampón sobre la actividad de determinada
enzima.

Cálculos relacionados con la preparación de tampones:

Ejemplo: Se desea preparar un litro de buffer acetato 0,1 M de pH = 4,60 a

partir de ácido acético 2 M y acetato de sodio.
La ecuación de Henderson-Hasselbach permite calcular la razón de las
concentraciones de HOAc y OAc - necesaria para que el pH de la solución sea
igual a 4,60:

pH = pKa + log [OAc-] ; reemplazando el pKa de HOAc y el pH:

[HOAc]

4,60 = 4,75 + log [OAc-]

[HOAc]

log [OAc-] = -0,15 [OAc-] = 0,708

[HOAc] [HOAc]

Por otra parte: [HOAc] + [OAc-] = 0,1 (todas las concentraciones en M)

12
[HOAc] = 0,1 - [OAc-] Reemplazando: [OAc-] = 0,708
0,1 - [OAc ]
-

[OAc-] = 0,0708 - 0,708 [OAc-]

[OAc-] = 0,0708 = 0,0415 M

1,708

[HOAc] = 0,1 - 0,0415 = 0,0585 M

Se desea preparar un volumen igual a un litro, luego se necesitan 0,0415 moles

de acetato de sodio.

NaOAc: PM = 82 por lo tanto 0,0415 moles = 3,4 g

HOAc: se aplica la relación de las diluciones

V1 = 1 (l) x 0,0585 M = 0,0293(l)

2M
En conclusión: Para la preparación de la solución: en un matraz aforado de 1
litro se colocan 3,4 g de acetato de sodio más 29,3 ml de HOAc 2 M y se afora
con agua.

13
 PROBLEMAS TAMPONES

1. ¿Cuáles son a) H+, b) OH-; c) pH; de una solución de un ácido fuerte HX de

concentración 5 mM?

Resp.: a) 5 x 10-3 M c) 2,30 b) 2 x 10-12 M

2. a) La concentración de iones H+ de una muestra de orina es 2 x 10-7 M. ¿Cuál

es su pH?
b) El pH de una muestra de suero es 7,4 ¿Cuál es la concentración de iones
hidrógeno?

Resp.: a) 6,7 b) 4 x 10-8 M

3. ¿Cuántos iones de a) H+ y b) OH- están presentes en 250 ml de una solución

de pH = 4?

Resp.: a) 1,51 x 1019 b) 1,51 x 1013

4. ¿Cuántos milílitros de HCl 0,05 N se requieren para neutralizar

exactamente 20 g de NaOH?

Resp.: 10000 ml = 10 litros

5. ¿Cuántos g de NaOH sólido se necesitan para preparar?:

a) 250 ml de una solución 0,08 M y
b) 500 ml de una solución de NaOH a pH 9,7?

Resp.: a) 0,8 g b) 1,00 mg

6. El pH de una solución 0,02 M de ácido débil HA es 4. a) ¿cuál es el grado de

ionización de HA en la solución? b) ¿cuál es el Ka?

Resp.: a) 0,5% b) 5,03 x 10-7

7. El Ka de un ácido HA es 1,6 x 10 -6 a) ¿Cuáles son pH y grado de ionización del

ácido en una solución 10-3 M? b) Calcular el pKa

Resp.: a) 4,40; 4% b) 5,80

14
 8. ¿Cuál es la concentración de ácido acético y acetato en un tampón acetato
de concentración 0,1 M y pH 6,0? El Ka para el ácido acético es 1,78 x 10 -5

Resp.: 94,7 mM; 5,3 mM ([OAc-] y [HOAc] respectiv.)

9. Calcule el pH de las soluciones obtenidas al mezclar 10 ml de NaOH 0.01 M,

con 90 ml de: a) H2O b) NaCl 0,1 M c) una solución que contiene 0,05 M
HOAc y 0,05 M NaOAc. ¿Cuál será el valor inicial del pH de la solución?
Discuta los resultados.

Resp.: a) 11 b) 11 c) 4,77

10. ¿Cuál es el pH de una solución que contiene acetato potásico 0,3 M y

ácido acético 0,15 M? (pKa ácido acético = 4,75)

Resp.: 5,05

11.¿Cuál es el pH de una solución que contiene NH 4Cl 0,1 M y NH3 0,2 M? pKb
NH3 = 4,6.

Resp.: pH 9,7

12. Se preparó un "buffer" disolviendo en agua 5 x 10 -3 moles de ácido fórmico

y 7 x 10-3 moles de formiato de sodio en un volumen final de 1 l. El Ka del
ácido fórmico es 1,8 x 10-4.
a) calcular el pH de la solución resultante
b) si esta solución se diluyera 10 veces ¿cuál sería el pH final?

Resp.: a) 3,89 b) 3,89

13. Calcular el pH de una solución formada cuando a 200 ml de ácido acético 0,5
M se le añaden 100 ml de NaOH 0,1 M. pKa ácido acético = 4,75

Resp.: 3,8

14. Los tampones Tris/HCl se pueden obtener agregando HCl a una solución de
Tris.
Tris = Tris (hidroximetil) aminometano Fórmula estructural: (CH 3OH)3
CNH2 PM: 121,1 Ácido conjugado: Tris H +, pKa = 8,1. Calcule la cantidad en
gramos de Tris y el volumen de HCl 1 M que se requiere para preparar 1 l
de un buffer Tris/HCl 0,2 M, pH 7,5. Resp.: 24,2 g; 160 ml

15
15. Una solución amortiguadora contiene ácido acético 0,1 M y acetato de sodio
0,1 M. Calcular el pH después de la adición de 10 ml de HCl 0,1 N a 90 ml
del amortiguador.

Resp.: 4,65

16. Describir la preparación de 2 litros de tampón fosfato 0,15 M, pH 6,9

partiendo de:
a) solución 2 M de H3PO4 y solución 1 M de KOH
b) soluciones 1 M de KH2PO4 y Na2HPO4
c) KH2PO4 sólido y K2HPO4 sólido

Resp.: a) 150 ml H3PO4 2 M b) 200 ml KH2PO4 c) 27,2 g KH2PO4

400 ml KOH 1 M 100 ml Na2HPO4 17,4 g K2HPO4

17. La piridina es una base orgánica que reacciona con los H + para formar
Pyr-H+ Para Pyr-H+: pKa = 5,36. Se desea preparar un tampón de
piridina/HCl de pH 5,5 titulando 50 ml de piridina 0,1 M con HCl 0,1 M.
¿Cuánto HCl se gastará? ¿Cuál será la concentración del tampón?

Resp.: 21 ml; 0,070 M

OBSERVACION: Grado de ionización de un ácido es la fracción de la

concentración total que se encuentra disociada, se suele expresar como
porcentaje.

16
 Anexo micropipetas

a.- Embolo para aspirar y expulsar el

d
líquido

b.- Perilla de ajuste de volumen

c.- Eyector de Tips

d.- Perilla para accionar el eyector de Tips

e.- Tip de polipropileno (desechable)

e
FIGURA 1:

Las micropipetas P-20 y P-200 utilizan Tips amarillos y la P-1000 usa Tips
azules. Cada micropipeta ajustable tiene un rango de trabajo
recomendado, así por ejemplo el rango recomendado para la P-20 es de 2
- 20 (l), para la P-200 es de 20 –200 l y para la P-1000 es de 200 –
1000l. Fuera de estos rangos el error aumenta.
Para pipetear un volumen dado, se debe usar la pipeta más cercana al
volumen deseado. Ej: Para medir 10 microlitros (l), se debe seleccionar la
pipeta P-20 y a continuación girar la perilla de ajuste (b) hasta que aparezcan
los números:
1
Este valor representa 10,0 l, 0
el número subrayado 0
representa los decimales
(e

Para medir 100 l, usar P-200 y 1

girar la perilla hasta: 0
0
En la P-200 no figura el
decimal y hay que estimarlo
en la escala graduada

17
Para el caso de la P-1000 sólo figuran las tres primeras cifras. Ej: 1000 l o
1ml figuran como 100 y la última cifra se estima en la escala graduada.

* ¡¡¡¡ La perilla de ajuste de volumen (b) no debe girarse más

allá de los valores máximos indicados para la pipeta!!!!

A continuación insertar en la punta de la pipeta un tip (e) y dejarlo bien

ajustado. Utilizar la pipeta en posición vertical respecto del líquido. Sumergir
sólo la punta del tip en la solución que se desea medir. Presione el botón o
émbolo (a) hasta la primera posición. Aspire el volumen soltando la presión
sobre el émbolo gradualmente (sin sacar el dedo). Para expulsar el volumen
medido ahora deberá presionar el émbolo hasta la segunda posición (fondo).
Para eyectar el tip presione la perilla (d).

18
 BLOQUE I PROTEÍNAS

PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA PROTEÍNA DE FUSIÓN

GLUTATION-S-TRANSFERASA/ GLUCOQUINASA MEDIANTE
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD EN GLUTATIÓN SEFAROSA 4B.

INTRODUCCIÓN

Se aisló un clon desde una biblioteca genómica de un microorganismo patógeno

de peces Renibacterium salmoninarum que contenía una secuencia codificante

para una enzima, la glucoquinasa. Se deseaba estudiar dicha enzima pero por

las características de lento y fastidioso crecimiento del patógeno no se podía

obtener material suficiente para purificar de allí la enzima. Para obviar este

problema se decidió subclonar la región codificante del gen de glucoquinasa

(glk) en un vector de expresión plasmidial (pGEX4-T) de manera que la región

codificante de glk quedara ligada en marco de lectura correcto con la región

codificante del extremo amino de la enzima glutatión-S-transferasa. Esta

construcción quedó bajo el comando del promotor tac localizado río arriba del

codón de inicio del gen de fusión. El promotor tac presenta bajos niveles de

expresión basal sin embargo es inducible por el análogo de lactosa,

isopropiltiogalactósido (IPTG). Por lo tanto bajo condiciones de crecimiento

con inductor en el medio las bacterias hospederas (cepa Escherichia coli

ZSC103) sintetizarán cantidades importantes de esta proteína de fusión, la

cual podrá ser purificada posteriormente desde el lisado bacteriano mediante

cromatografía de afinidad.

Cabe destacar que la cepa hospedera (ZSC103) utilizada es mutante

para el gen de glucoquinasa y por lo tanto posee una actividad de glucoquinasa

despreciable.

19
 PRINCIPIOS DE CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
UN LIGANDO ESPECÍFICO ES UNIDO
COVALENTEMENTE A LA RESINA PARA
RESINA PERMITIR LA POSTERIOR SEPARACIÓN DE
LA PROTEÍNA DE INTERÉS. EN ESTE CASO EL
LIGANDO ES EL GLUTATIÓN

MEZCLA DE
PROTEÍNAS EN LA
MUESTRA

UNIÓN DE PROTEÍNA
ESPECÍFICA Y LAVADO DE
PROTEÍNAS UNIDAS
INESPECÍFICAMENTE

ELUCIÓN PROTEÍNA
ESPECÍFICA

FIGURA 2: Cromatografía de afinidad

promotor

tac GST glk pGEX4-T GST-glk

Proteína de fusión GSTglk

N terminal C- terminal

Esquema construcción proteína recombinante de fusión

20
 SESIÓN 1

SOBREEXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN GST-GLK

Previo a preparar la proteína de fusión en gran escala, se ensayaron diferentes

condiciones de cultivo e inducción para lograr una expresión óptima. Para el
procedimiento optimizado se tomó una colonia de la bacteria recombinante
ZSC103 (pGST-GLK) y se creció en 5 ml de medio Luria–Bertani durante 5-6 h
con agitación a 1000 rpm a 37C. Luego se adicionó al cultivo IPTG a una
concentración final de 0,1 mM y se cultivó durante 3 h más.

Luego se transfirió 1,5 ml de cultivo inducido a un tubo Eppendorf (material

con el cual Ud. partirá).

Procedimiento

1.- Centrifugar el cultivo durante 5 seg (“spin-down”).

2.- Descartar el sobrenadante (mediante trampa de vacío)

3.- Resuspender el sedimento bacteriano en 300 l de PBS 1x estéril y frío.

4.- Apartar una alícuota de 20 l para tener el control de proteínas totales del

lisado bacteriano. Rotule el tubo como PROTEINAS TOTALES.

5.- El resto de la suspensión bacteriana se lisa por sonicación (6 ciclos de 10

seg a 25 W con vástago de 2 mm). Mantener el tubo Eppendorf en hielo

durante el proceso.

6.- Luego centrifugar el lisado a 13.000 rpm durante 20 min.

7.- Traspasar el sobrenadante a un tubo limpio y adicionar el inhibidor de

proteasas fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) a una concentración final de 0,1

mM. Rotule el tubo como PROTEÍNAS SOLUBLES.

21
8.- Resuspender el pellet en 50l de PBS y adicionar PMSF hasta 0,1 mM final.

Rotule el tubo como PELLET.

Purificación de la proteína de fusión por cromatografía de

afinidad en “batch”.

Procedimiento

1.-Se le entregará por mesón un stock de suspensión de la resina Glutatión-

Sefarosa-4B al 50% en PBS 1x.

2.- Agregue a 250l del sobrenadante obtenido en la etapa anterior 20 l de la

resina (suspenda bien la resina antes de agregarla) y mezcle suavemente a
temperatura ambiente por 5 min.

3.- Adicione luego 0,1 ml de PBS 1x y centrifugue la suspensión por 5 segundos.

(La resina quedará en el fondo del tubo).

4.- Remueva cuidadosamente el sobrenadante y traspáselo a un tubo Eppendorf

nuevo. Rotule el tubo como LAVADO.

5.- Repita 3 veces el lavado de la resina con PBS 1x.

5.- Después del último lavado, la proteína se eluirá en 10 l de tampón

glutatión-reducido (Tris-HCl 50 mM pH 8,0/glutatión reducido 10 mM)
incubando 5 minutos a temperatura ambiente.

6.- Centrifuge por 5 min más para separar la resina.

7.- Remueva el eluido y traspáselo a un tubo nuevo rotulado como ELUIDO

8.- En esta etapa Ud. tendrá las fracciones correspondientes a:

PROTEÍNAS TOTALES; PROTEÍNAS SOLUBLES; PELLET; LAVADO Y

ELUIDO.

9.- En la próxima sesión se determinará la concentración de proteínas a las

fracciones de proteínas SOLUBLES, PELLET Y LAVADO para determinar la

cantidad a cargar al gel para cada una de estas muestras. De las fracciones de

proteínas totales cargar 5 l y del eluido la totalidad (10 l).

22
 SESIÓN 2

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

INTRODUCCIÓN:

Se han descrito muchos métodos diferentes para la determinación

cuantitativa de proteínas. Estos métodos difieren entre si en cuanto a su

sensibilidad, exactitud, precisión, interferentes, estabilidad y sencillez. La

selección del método a utilizar se realiza considerando las características de

las muestras que se desean analizar, las cuales pueden ser desde extractos

crudos de tejidos animales o vegetales, fluidos biológicos de interés en

bioquímica clínica (suero, plasma u orina), muestras obtenidas en el curso de la

purificación de una proteína, fracciones cromatográficas hasta muestras de

una proteína pura. En general los métodos utilizados para la determinación

cuantitativa de proteínas consisten en la determinación absorciométrica

directa o en ensayos de tipo colorimétrico, turbidimétrico o fluorométrico.

La mayoría de las proteínas presentan un máximo de absorbancia a 280

nm aproximadamente, debido principalmente a la presencia de residuos de

triptófano y tirosina, y en mucha menor proporción fenilalanina. Los residuos

de histidina, cisteína y cistina también presentan bandas de absorbancia en el

ultravioleta cercano, pero se encuentran a menores longitudes de onda y son de

menor intensidad. La posición exacta del máximo de absorbancia, así como el

coeficiente de extinción molar de una proteína depende de su composición

aminoacídica. Por consiguiente, solamente para soluciones de una proteína pura,

conocida, cuyo coeficiente de extinción se ha determinado previamente, se

puede calcular la concentración a partir de su absorbancia.

23
MÉTODO DE BRADFORD

FUNDAMENTO:

Este método utiliza la propiedad del colorante azul de Coomasie G-250 de

unirse a las proteínas. El colorante libre presenta un máximo de absorción a

465 nm mientras que cuando está unido a proteínas éste se encuentra a 595

nm. El ensayo estándar sirve para el rango de concentraciones de 0,1 a 1 mg/ml.

La curva de calibración es ligeramente curva.

Interferencias: Detergentes y álcalis reducen el color. Se

recomienda medir a los 10 minutos de reacción, debido a que el color no es

estable en el tiempo, ya que la proteína y el complejo colorante-proteína

comienza a precipitar debido al medio ácido. Este efecto es especialmente

significativo a las concentraciones de proteínas mayores. Por otra parte, el

complejo proteína-colorante tiende a unirse a las cubetas tiñéndolas, por lo

cual se recomienda un lavado final con etanol.

MATERIALES:

Preparación del Reactivo de Bradford:

Disolver 100 mg de azul de Coomasie G-250 (Sigma) en 50 ml de etanol

95% (siempre queda un ligero residuo insoluble). Agregar lentamente 100 ml de

ácido fosfórico 85% p/v y luego completar a 1000 ml con agua destilada. Dejar

el reactivo en reposo todo un día y luego filtrar. El reactivo debe filtrarse

toda vez que presente residuo o que el blanco de reactivo medido contra agua

presente una absorbancia mayor a 0,5. (Se entregará preparado).

Solución patrón de albúmina de bovino 1mg/ml (Se entregará preparada).

Espectrofotómetro y cubetas plásticas

24
PROCEDIMIENTO:

Complete la tabla calculando los volúmenes de estándar y agua destilada

requeridos para las diferentes concentraciones que se utilizarán en la curva de
calibración. En los tubos los volúmenes de muestra, estándar y agua indicados
en la tabla:

Tubos Agua Estándar Muestra Reactivo Concentración

dest. (l) (l) color mg/ml
(l) (ml)
1 100 -- -- 1 0
2 1 0,1
3 1 0,2
4 1 0,4
5 1 0,6
6 1 0,8
Proteínas 90 -- 10 1
solubles
Pellet 90 -- 10 1
Lavado 90 -- 10 1

- Agite bien los tubos, incube durante 10 min. a temperatura ambiente y mida

la absorbancia a 595 nm contra el blanco.

Observación: Si alguna de las muestras presenta una absorbancia mayor que el

tubo de mayor concentración de la curva de calibración será necesario repetir

la determinación realizando una dilución mayor. Por ej: tomando 5 l de

muestra en lugar de 10 l y completar con agua destilada hasta 100 l.

Grafique los valores de la curva de calibración en papel milimetrado y calcule la

concentración de las muestra por interpolación en el gráfico. Considere las

diluciones previas realizadas a las muestras (en caso necesario) para el cálculo

final de su concentración.

25
 SESIÓN 3

ELECTROFORESIS DISCONTINUA EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN

CONDICIONES DESNATURANTES

PROCEDIMIENTO:

1.- Se monta el sistema de placas de vidrio bien limpias con etanol (secas) con
los espaciadores laterales e inferior de teflón, afirmados con las pinzas. Una
vez que se ha verificado que los espaciadores ajusten sin dejar espacios entre
ellos se prepara la mezcla del gel separador, excepto que no se le agrega el
catalizador TEMED.

2.- Se mezcla bien la solución, se toma 1 ml con micropipeta y se transfiere a

un tubo limpio y seco. A este ml se le adiciona 10 l de TEMED, se mezcla
rápido y se vierte entremedio de las placas en posición vertical. Esperar que
este “taco” polimerice (entre 15-20 min).

3.- Una vez que esto ha ocurrido agregar los 20 l de TEMED al resto de la
mezcla del gel separador, mezcla bien y verter hasta aprox. 2/3 de la altura de
las placas.

4.- Adicionar con suavidad por los extremos superiores isopropanol hasta que
se forme un frente recto en el borde superior del gel. Dejar polimerizar el gel
por aprox. 40 min. Controlar con la mezcla sobrante en el tubo. No mover el gel
hasta que la mezcla en el tubo haya polimerizado.

5.- Una vez que el gel separador polimerizó enjuagar con una pisceta con agua
destilada para remover los restos de acrilamida sin polimerizar. Secar la
superficie con papel filtro y agregar en seguida la mezcla del gel espaciador
introduciendo rápidamente la peineta de 75 mm verificando que no queden
burbujas en los surcos ya que esto alteraría posteriormente la migración de las
muestras. Dejar polimerizar unos 20-30 min.

6.- Una vez solidificado el espaciador, retirar la peineta y el espaciador

inferior. Remover las pinzas laterales e introducir las placas en la cámara de
manera que el vidrio más corto quede en contacto con el tampón de corrida una
vez llenada la cámara.

26
7.- Comenzar el llenado de la cámara teniendo cuidado de que no queden
burbujas atrapadas en el extremo inferior del gel.

27
8.- Llenar la cámara con tampón de manera que los surcos queden llenos.

9.- Conectar los cables a la fuente de poder de manera que las muestras
migren hacia abajo del gel. (Ánodo o polo positivo en el borne inferior)

10.- Cargar las muestras (ver preparación de muestras) y correr a 25 mA

hasta que el indicador del frente iónico (azul de bromofenol) llege a aprox. 1
cm del borde inferior del gel.

11.- Desarmar las placas, removiendo primero los espaciadores laterales y luego
hacer palanca con una espátula delgada para separar la placa superior del gel.

12.- Cortar aquella parte del gel que será fijada y teñida, sin incluir el gel
espaciador el cual es removido después de marcar la orientación de las
muestras con un corte en una de las esquinas inferiores del gel separador.

13.- La porción del gel que será teñida se fija primero en una solución de
isopropanol 25%/ ácido acético 10% durante 1 h. La fijación tiene el propósito
de que las proteínas no difundan desde el gel y además de que se remueva el
exceso de SDS previo a la tinción.

14.- El gel se tiñe luego en una solución de azul de Coomasie (ver sección
soluciones) durante 1 hora.

15.- Finalmente se destiñe el gel poniéndolo a calentar en el horno microondas

en una fuente Pyrex con tapa y cubierto de agua destilada. El calentamiento se
realiza hasta que el agua ebulla durante 10 –15 minutos. Ojo: Es conveniente ir
chequeando el desteñido entremedio para evitar que se destiña demasiado.

16.- En estas condiciones el gel puede ser fotografiado o su imagen capturada

digitalmente.

Preparación de las muestras:

Tomar un volumen correspondiente a una cantidad de proteína entre 10 y

30 g de proteína de las diferentes muestras y agregar el tampón de muestra
(5X) de manera que corresponda a 1/5 del volumen total. De la fracción de
eluido y de la fracción de proteínas totales tomar (10 l) y proceder igual que
con las demás muestras.
Además se incluirá en el gel una muestra correspondiente a un estándar
de peso molecular para poder determinar posteriormente el peso molecular de

28
las proteínas purificadas en forma experimental. Dicho estándar se entregará
preparado. Todas las muestras se hierven en Baño María (100º C) por 2-4 min.
Luego se centrifugan (Eppendorf) y se cargan al gel en un orden establecido
(VER FIGURA 3)

PREPARACIÓN DE GELES

Advertencia: para preparar los geles utilizar guantes ya que la acrilamida

es neurotoxica.

Los volúmenes indicados corresponden a un gel grande para un minigel

preparar la mitad.

20 ml MEZCLA GEL SEPARADOR 12,5%

SOLUCIÓN DE ACRILAMIDA: BISACRILAMIDA 30:0,8% 8,1 ml

TRIS-HCl 1,5 M pH 8,8 5,0 ml
SDS 10% 0,3 ml
PERSULFATO DE AMONIO 10% 75 l
(PREPARADO FRESCO)
AGUA DESTILADA C.S.P. 20 ml
TEMED 20 l

5 ml MEZCLA GEL ESPACIADOR 5%

ACRIL: BIS 30:0,8% 0,8 ml

TRIS-HCl 0,5 M pH 6,8 0,6 ml
SDS 10% 75 l
PERSULFATO DE AMONIO 10% 15l
AGUA DEST. C.S.P. 5 ml
TEMED 10 l

TAMPÓN DE MUESTRA 5X (4 ml)

AGUA DEST. 2,0 ml

TRIS-HCl 0,5 M pH 6,8 0,5 ml
GLICEROL 0,4 ml
SDS 10 % 0,8 ml
- MERCAPTOETANOL 0,2 ml
AZUL DE BROMOFENOL 0,05 p/v 0,1 ml

TAMPÓN DE CORRIDA 10X (1 LITRO)

TRIS BASE 30 g
Glicina 144 g

29
SDS 10 g

SOLUCIONES PARA PAGE-SDS

A.- Acrilamida-bisacrilamida 30%-0,8% (30,8% total) se prepara en agua

destilada y dependiendo de la pureza y calidad de la acrilamida, a veces es
necesario tratarla con carbón activado y posteriormente filtrarla.
B.- Tampón gel separador: Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) guardar refrigerado.
C.- Tampón gel espaciador: Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) refrigerar.
D.- Persulfato de amonio 1% (p/v) preparado fresco cada semana.
E.- Temed (N, N, N`, N`-tetrametiletilendiamina) solución comercial guardar
refrigerada.
F.- SDS 10% (p/v) guardar a temperatura ambiente.
G.- Solución de teñido: azul de Coomasie R 0,3% en metanol 50%/ácido
acético 10%. Se disuelve el azul de Coomasie en metanol (agitar durante varias
horas en un recipiente tapado). Posteriormente filtrar, agregar el ácido
acético y el agua.

MUESTRA CÁTODO

DIRECCIÓN DE
MIGRACIÓN

ÁNODO

FIGURA 3:

30
 ANÁLISIS DE WESTERN

“Semi-dry blot” o electrotransferencia en cámara semi seca

Procedimiento:

1.- Luego de marcar el gel (borde inferior), medirlo (cm 2) y de remover el gel
espaciador, se sumerge el gel a transferir en tampón Tris-glicina-metanol (25
mM TRIS-HCl pH 9,4; 192 mM glicina, 20% metanol) durante 30 min a temp.
ambiente.
2.- Se cortan 6 papeles Whatmann 3MM y una membrana de nitrocelulosa de
las dimensiones del gel.
3.- Se sumerge la membrana en H2O destilada por 5 min.
4.- Humectar 2 hojas de papel filtro en tampón ánodo 1 (TRIS-HCl 0,3 M pH
10,4/ metanol 20%) y ponerlas una a una en el centro de la placa de grafito
(ánodo). Remover las burbujas.
5.- Humectar una hoja de papel filtro en tampón ánodo 2.
6.- Colocar la membrana pre-tratada y luego el gel equilibrado.
7.- Colocar una hoja de papel filtro sumergida en tampón cátodo (TRIS-HCl 25
mM pH 9,4/ac. aminocaproico 40 mM y metanol, 20%), sobre el gel y luego los
2 filtros restantes.
8.- Conectar la cámara y aplicar corriente constante ej. 2,5 mA/cm 2 x 45 min
o 0,8 mA/cm2 durante 1 a 2h.
9.- Una vez finalizada la transferencia, secar la membrana y teñir el gel
transferido con azul de Coomasie R (Para chequear la eficacia de la
transferencia).
10.- El secado se puede hacer a 37C x 1h o a temp. amb por más tiempo.

Observaciones: La membrana de nitrocelulosa siempre debe ser manipulada

con pinzas y para secarla envolverla en papel filtro.

Fijación y tinción del gel con azul de Coomasie R

1.- Fijar el gel con agitación en 25% isopropanol/7% ácido acético durante al
menos 1 h.
2.-Teñir también con agitación durante 1 h en la solución de azul Coomasie-R
3.- Para desteñir poner en fuente Pyrex y enjuagar rápidamente con agua
destilada el exceso de colorante y luego llenar el recipiente con agua destilada
y calentar al microondas (máxima potencia) durante 5 min en principio. Se
repite el procedimiento hasta que el fondo esté claro.

31
 SESIÓN 4

INMUNODETECCIÓN

Procedimiento:

1.- La membrana se incuba primero por 1h en BLOTTO (leche descremada

5%/PBS/Tween 20 0,05%) para bloquear los sitios inespecíficos.

2.- Luego se incuba con el primer anticuerpo diluido 1:5.000 en el mismo Blotto
y se incuba por al menos 1h.

3.- Realizar 3 lavados cortos con PBS e incubar luego por 1h más con el
segundo anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (anti IgG de conejo
preparada en cabra y conjugado con fosfatasa alcalina dilución 1/2000). La
dilución del segundo anticuerpo se hace en el mismo tampón que el primero.

4.- A continuación se realizan 3 lavados cortos con PBS y se equilibra la

membrana en tampón de fosfatasa (TRIS-HCl 0,1M pH 9/NaCl 0,1M/MgCl 2
0,05 M) por 5 min.

5.- Finalmente se preparan 5 ml de tampón de la enzima al que se adicionan los

sustratos NBT (4,4l por cada ml de tampón) y BCIP (3,3 l por cada ml de
tampón) y se revela la actividad en la oscuridad (generalmente, las bandas
inmuno-reactivas aparecen a los pocos minutos). Una vez reveladas las bandas,
se detiene la reacción lavando con agua desionizada primero y luego con EDTA
0,2 M.

Bibliografía específica

1.- Concha, M.I. & León, G. (2000) Cloning, functional expresión and partial
characterization of the glucose kinase from Renibacterium salmoninarum.
FEMS Microbiology Letters Vol: 186, 97-101.

2.- Concha, M.I. (1999) Análisis y expresión de un gen comprometido en la

invasividad de Renibacterium salmoninarum. Tesis doctoral –Doctorado Biología
celular y Molecular-Facultad de Ciencias UACh. pg. 159

32
 PAUTA PARA INFORME GLOBAL

I.-RESUMEN: DEBE SER DE APROX. 300 PALABRAS Y DEBE

ESPECIFICARSE EN ÉL BREVEMENTE LOS EXPERIMENTOS
REALIZADOS Y LOS RESULTADOS MÁS IMPORTANTES
OBTENIDOS.

II.- INTRODUCCIÓN: DEBE SER DE APROX. 1 PÁGINA Y DEBE

SEÑALARSE EN ELLA LA INFORMACIÓN PREVIA EXISTENTE QUE
PERMITA ENTENDER Y ANALIZAR LOS RESULTADOS OBTENIDOS.

III.- RESULTADOS: SE DEBEN INFORMAR TODOS LOS RESULTADOS

OBTENIDOS EN ORDEN SECUENCIAL.

 LOS RESULTADOS DE GELES (FOTOGRAFÍAS), ESQUEMAS Y

GRÁFICOS SERÁN ENUMERADOS COMO FIGURA 1, 2, ETC...

 LOS DATOS NUMÉRICOS SE INFORMARÁN EN TABLAS

TAMBIÉN ENUMERADAS.

 CADA FIGURA O TABLA DEBERÁ TENER UN TÍTULO Y UNA

LEYENDA EXPLICATIVA.

 PARA FINES DE ORIENTACIÓN SE ACONSEJA GUIARSE POR

LOS FORMATOS UTILIZADOS POR REVISTAS DEL ÁREA
DISPONIBLES EN BIBLIOTECA TALES COMO: JOURNAL OF
BIOLOGICAL CHEMISTRY; JOURNAL OF BIOCHEMISTRY O
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES
USA (PNAS).

(Ver ejemplos en Anexos I y II)

IV.- DISCUSIÓN: EN ESTA SECCIÓN DEBE ANALIZARSE LOS

RESULTADOS OBTENIDOS DESTACANDO AQUELLAS OBSERVACIONES,
MÁS RELEVANTES.

EN EL INFORME SE DEBE INDICAR CLARAMENTE A QUE CURSO

CORRESPONDE; TÍTULO DEL PRÁCTICO, NOMBRE DEL ALUMNO,
PROFESORES A CARGO DEL PRÁCTICO Y FECHA.

33
 A

EcoRI HindIII EcoRI SmaI SmaI HindIII

pglk glk
200pb
EcoRI
1 2 3 4 5 6 7
kb

23,1-
9,4-
4,4-
2,3-
2,0-

9,4 –
4,4 –
2,3.-
2,0.-

Figura 15: Reconstrucción del gen de glucoquinasa en el plasmidio

recombinante pMICglk. Panel A: mapa físico del inserto del plasmidio
pMICglk. En verde, el promotor; la flecha roja representa la región codificante.
Panel B: Fraccionamiento de los DNAs plasmidiales digeridos con EcoRI en
gel de agarosa al 0,8%. Panel C: Productos de la digestión del DNA plasmidial
con SmaI.

ANEXO I: Ejemplificación de la presentación de una figura

34
Anexo II: Ejemplificación de la presentación de una Tabla

Tabla 1: Actividad de glucoquinasa en diferentes lisados bacterianos



a b
cepa de E. coli Actividad específica de glucoquinasa
(nmol NADPH min -1 mg-1 proteína)

HB101 66,0

ZSC103 3,8

ZSC103 (pUC19) 3,3

ZSC103 (pPMV189) 263,0

ZSC103 (pPMV189) 317,2

+IPTG

ZSC103 (pPMV981) 3,0




a
Las cepas de E. coli utilizadas aparece en letras mayúsculas y entre paréntesis, se
indica el plasmidio que contienen. Los genotipos de las cepas de E. coli utilizadas se
indican en Materiales y Métodos.

b
Los valores de actividad específica indicados en la tabla corresponden al promedio
de ensayos realizados por triplicado.

35
36
 BLOQUE II ENZIMAS

LA FRUCTOSA 1,6-BISFOSFATASA

INTRODUCCIÓN:
Las enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas específicas,
es decir, hacen aumentar su velocidad. En la Figura 1 se muestra la variación
de la cantidad de producto con el tiempo para una reacción catalizada por una
enzima (cinética de aparición de producto). Como el volumen es constante, la
concentración de producto varía en forma similar.

24 -

20 -
PRODUCTO
(moles) 16 -

12 -

8 -

4 -

0
0 5 10 15 20

TIEMPO (MIN)
FIGURA 1

La pendiente de esta curva corresponde a la velocidad de reacción.

Se aprecia que durante cierto tiempo inicial la velocidad se mantiene constante
(la "curva" es una recta) y posteriormente decae. Para el estudio de reacciones
con catálisis enzimática siempre se determinan velocidades iniciales, Vo, es
decir, se utiliza únicamente el rango de tiempo en el cual la velocidad se
mantiene constante. Tenemos que:

Vo = cantidad de producto formado (moles)

Tiempo (minutos)
Igualmente:
Vo = cantidad de sustrato consumido (moles)
Tiempo (minutos)
Existen dos diferentes tipos de ensayos de actividad enzimática:

37
i) Ensayos de tiempo fijo: se detiene la reacción después de un tiempo
determinado y se mide la concentración de producto formado. Ejemplo: el
ensayo de fructosa-1,6-bisfosfatasa que se realizará en el presente práctico.

ii) Ensayo cinético: se mide un parámetro que representa la concentración de

producto (por ejemplo absorbancia o intensidad de fluorescencia) en forma
continua o a una serie de tiempos muy próximos durante el transcurso de la
reacción, obteniéndose un gráfico similar a la Figura 1. Midiendo el valor de
la pendiente de la zona lineal se obtiene la velocidad inicial. Ejemplo: el
ensayo cinético de fosfatasa alcalina.
En este práctico se trabajará con la enzima fructosa 1,6-bisfosfatasa de
riñón de cerdo.

FRUCTOSA-1,6-BISFOSFATASA DE RIÑON DE CERDO

La fructosa-1,6-bisfosfatasa (FBPasa) es una enzima que cataliza la

reacción:

fructosa-1,6-P2 ----------> fructosa-6-P + Pi

Esta reacción in vivo es una de las etapas irreversibles de la

gluconeogénesis, por lo tanto, las propiedades de la enzima que la cataliza son
fundamentales para la regulación de esta vía metabólica. En mamíferos, la
enzima se encuentra principalmente en el hígado y el riñón, los órganos en los
cuales la gluconeogénesis es importante para la mantención del nivel de glucosa
sanguínea. Por su importancia la enzima ha sido muy estudiada, habiéndose
logrado su purificación y caracterización desde diversas fuentes, tanto
animales como vegetales. La mayoría de las FBPasas purificadas comparten una
serie de propiedades, como ser:

- poseen un pH óptimo neutro (pH 7,5).

- utilizan como cofactores metales divalentes (Mg +2, Mn+2).
- tienen una alta especificidad de sustrato, pues sólo hidrolizan
fructosa-1,6-P2 y en algunos casos fructosa-1-P y sedoheptulosa-bisfosfato.
- exhiben alta afinidad por su sustrato (Km < 5 M) y son inhibidas por
exceso de sustrato.
- presentan inhibición por AMP y por fructosa-2,6-P2.
- son activadas por cationes monovalentes (K+, NH+4).
La enzima que se usará en este práctico se purificó de alrededor de 500 g
de corteza de riñón de cerdo, por un procedimiento de cuatro etapas
consecutivas.

38
 I. Homogeneización y tratamiento a pH 4,5
II. Tratamiento a 55° C, eliminación de las proteínas desnaturadas
III. Fraccionamiento con sulfato de amonio. Se usa el precipitado obtenido
entre 47% y 65% de saturación.
IV. Cromatografía en Sefarosa-azul y elución con AMP 0,2 mM.

Después de cada etapa se determinaron la actividad enzimática

(U/ml) a través del ensayo correspondiente y la concentración de proteínas
totales (mg/ml) a través de un ensayo de proteínas. Considerando además los
volúmenes totales de solución se construyó la siguiente Tabla de purificación:

Etapa Volumen Activ. Proteínas Activ. Purific. Rend.

total Total totales Espec.
ML U MG U/MG veces %
I 860 12.700 60.200 0,21 1 100
II 690 10.700 28.300 0,38 1,8 84
III 60 9.400 13.000 0,72 3,4 74
IV 7 4.100 116 35,3 168 32,3

Para analizar la tabla de purificación es necesario conocer los

siguientes conceptos:

Unidad de actividad : Cantidad de enzima que cataliza la transformación

Enzimática (U) de 1 mol de sustrato a producto por minuto (a
cierta temperatura, y en condiciones definidas,
óptimas.)

Actividad específica : Número de unidades de enzima por mg de proteínas

Purificación : actividad específica (etapa X)

activ. específica (etapa de referencia)

Rendimiento (%) : actividad total (etapa X) x 100

actividad total (etapa de referencia)

En la tabla presentada se usó la etapa I como etapa de referencia

para calcular la purificación y el rendimiento.
La actividad específica se usa como un criterio de pureza de una
muestra de una enzima. Así, la actividad específica de la FBPasa aumenta
durante su aislamiento pues se van descartando otras proteínas contaminantes,
hasta alcanzar un valor máximo, una vez que la enzima ha sido purificada a

39
homogeneidad.

INHIBICION POR AMP DE LA FRUCTOSA-1,6-BISFOSFATASA

Numerosos estudios cinéticos han mostrado que AMP y fructosa-2,6-P2 son

inhibidores potentes y específicos de la FBPasa (I 0,5 = 20 y 2,5 M,
respectivamente) y que sus efectos son sinergísticos. La inhibición por AMP es
cooperativa (nH = 2,4), reversible y no competitiva con respecto al sustrato.
(Los valores citados corresponden a FBPasa renal de cerdo). Además, la
inhibición es de tipo alostérico, pues el inhibidor se une a un sitio específico,
diferente al sitio activo.

La acción del AMP, junto con la de fructosa-2,6-P2, es fundamental para la

regulación del metabolismo de carbohidratos pues fosfofructoquinasa, la
enzima que cataliza la síntesis de fructosa-1,6-P2 a partir de fructosa-6-P,
reacción glicolítica inversa a la de FBPasa, es a su vez activada por
fructosa-2,6-P2 e inhibida por exceso de ATP. Por lo tanto, un bajo nivel de
AMP y fructosa-2,6-P2, favorece la vía gluconeogénica pues aumenta la
actividad de FBPasa e inhibe la de fosfofructoquinasa. A la inversa, una
disminución del nivel de ATP (sube por lo tanto la concentración de AMP) hace
aumentar la actividad de fosfofructoquinasa y disminuir la de FBPasa,
favoreciendo entonces la glicólisis.

CURVA DE SATURACION POR MAGNESIO

La fructosa-bisfosfatasa requiere como cofactor Mg +2. Al estudiar el

efecto que tiene este ión sobre la velocidad de la reacción FBPásica, se obtiene
una curva hiperbólica (Fig. 2), semejante a las observadas al estudiar la
velocidad de la reacción en función de la concentración de sustrato (curva
correspondiente a la ecuación de Michaelis-Menten), lo cual permite un análisis
similar. La concentración de Mg +2 necesaria para obtener la mitad de la
velocidad máxima es la constante de activación por Mg +2 (Ka Mg+2). El valor de la
constante se obtiene a través de un gráfico de los dobles recíprocos (Fig. 3).

40
 V
1/V

-1 / Ka

1 / V máx

[Mg+2 ] 1/ [Mg+2 ]

FIGURA 2 FIGURA 3

El valor de Ka Mg+2 de la FBPasa renal de cerdo, determinado en presencia de

150 mM K+, es igual a 1,1 mM.

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE FRUCTOSA-1,6-BISFOSFATASA

En el práctico se medirá la actividad fructosa-1,6-bisfosfatásica como la

velocidad de liberación de fosfato (Pi) a partir de fructosa-1,6-P2 a pH 7,5 y
30°C en presencia de MgSO4. Se determinará la cantidad de Pi liberado, por el
método de Fiske y Subbarow. Este método se basa en que el fosfato reacciona
con ácido molíbdico formando ácido fosfomolíbdico, el cual es reducido
posteriormente por ácido 1-amino- 2-hidroxi-4-naftalenosulfónico (ANSA)
originándose óxido de molibdeno de color azul. La reacción enzimática se
iniciará por la adición de una alícuota de enzima y se detendrá al tiempo
predeterminado con la solución de molibdato ácido (esta solución contiene
ácido sulfúrico 2,5 M, el cual desnatura instantáneamente a la enzima). Es
necesario considerar que el medio de reacción con el cual se efectúa el ensayo,
contiene normalmente una concentración de fosfato no despreciable (esto se
debe principalmente a cierta inestabilidad del sustrato). Para que este fosfato,
que no se generó por acción enzimática, no falsee los resultados se hace un
ensayo de "tiempo cero" de incubación, en el cual se agrega el molibdato ácido
antes que la enzima. El correspondiente valor de absorbancia, A o, se restará de
los valores obtenidos en los demás ensayos, calculándose a partir de estas
absorbancias corregidas las cantidades de fosfato realmente liberadas por
acción enzimática.

En el presente práctico se estudiará la inhibición por AMP de la

41
FBPasa
Es importante hacer notar, que no se ha elegido como ejemplo ilustrativo la
determinación experimental de la Km para el sustrato, Fru-1,6-P 2, pues la alta
afinidad de la enzima (Km < 5 M) hace imposible su determinación usando el
método Fiske y Subbarow (rango de Pi determinable = 0,1-1 mM).

PARTE EXPERIMENTAL

Materiales:

- Baños termorreguladores, cronómetros.

- Reactivos para la determinación de fosfato:
Molibdato de amonio al 2,5% en ácido sulfúrico 5N (molibdato ácido)
Disolver 25 g de heptamolibdato de amonio tetrahidrato en 200 ml de
agua. Preparar 500 ml de H2SO4 10 N a partir de H2SO4 concentrado.
Método: agregar el ácido concentrado (139 ml H 2SO4 96%) a
aproximadamente 350 ml de agua destilada, lentamente y en baño de
hielo. Aforar. En un matraz aforado de 1 l colocar la solución de la sal,
agregar los 500 ml de ácido sulfúrico 10 N y aforar con agua destilada.

Reactivo de Eiconogen o reactivo reductor. Se pesan 29 g de NaHSO 3

(bisulfito de Na) o Na2S2O5 (pirosulfito de Na) y 1 g de Na2SO3, (sulfito
de Na) disueltos en 200 ml de H2O. Para disolver las sales se calienta
levemente. Después agregar 0,5 g de ácido 1, 2, 4 aminonaftol sulfónico,
disolver y dejar enfriar. Finalmente filtrar filtrar la solución y mantener
a 4 C en un frasco ámbar. La solución así guardada es estable
aproximadamente 1 mes.

Solución patrón de fosfato, KH2PO4 0,5 mM.

FBPasa (15 g/ml)

Tampón Tris-HCl 0,5 M pH 7,5; EDTA 1 mM (tampón Tris 0,5M)

Fructosa bisfosfato 10 mM

MgSO4 50 mM

K2SO4 0,4 M

42
 AMP 200 M
SESIÓN 5

Procedimiento:

Enjuague todos los tubos de ensayo con agua destilada antes de su uso, ya
que el fosfato procedente de restos de detergente falsea los resultados.
Elimine los restos de agua lo más posible.

Se medirá la velocidad de la reacción enzimática en ausencia de AMP (en

duplicado) y en presencia de 10, 20, 30, 40 y 50 M AMP. En forma previa al
práctico, prepare el protocolo, en forma de una tabla, en la cual se detalla para
cada tubo la concentración de AMP así como el volumen (ml) de cada uno de los
reactivos que debe contener. Los tubos 1 a 7 deben tener la misma composición
que el T0 (tiempo cero), exceptuando la concentración de AMP, lo cual se logra
variando los volúmenes de AMP 200 M y de agua.

TUBO T0 1 2 3 4 5 6 7
AMP (M) 0 0 0 10 20 30 40 50
Tampón Tris, ml 0,1
FBP 10 mM, ml 0,1
K2SO4 0,4 M, ml 0,2
MgSO4 50 mM, 0,1
ml
AMP 200 M 0
H2O destilada, 0,4
ml
FBPasa, ml 0,1

Con el objetivo de minimizar los efectos del error propio del pipeteo y de
ahorrar tiempo, no pipetee todos los volúmenes indicados en la tabla sino que
prepare un medio común. El medio común debe contener todos los componentes
que se repiten para los 8 tubos (cuidado: no agregue la enzima). Prepare un
pequeño exceso de este medio (volumen para 10 tubos).

Distribuya el medio común en los tubos. Agregue la solución de AMP y al

agua según su protocolo.
Tempere los tubos, excepto To, 5-10 minutos a 30º C.
Inicie la reacción agregando la enzima (mezcle con Vortex). Inicie la
reacción de los tubos 1 a 7 a intervalos de 30 segundos, deje los tubos en el
baño. Después de un tiempo de reacción de 5 minutos para cada tubo detenga
las reacciones, agregando 0,5 ml de molibdato ácido. Deje los tubos en la

43
gradilla.

44
 Agregue el molibdato ácido y después la enzima al tubo T 0. Prepare los tubos
para el blanco y el estándar del ensayo de Fiske y Subarow usando
respectivamente 1 ml de agua y 1 ml de la solución estándar y agregue el
molibdato ácido a estos tubos.
Agregue sucesivamente 3,3 ml de agua y 0,2 ml de reactivo de Eiconogen a
todos los tubos. Espere 10 min. Mida A660 nm, calibrando con el blanco.

EVALUACIÓN DE LOS DATOS EXPERIMENTALES

Confeccione una tabla que contenga para T 0 y los tubos 1 a 7: A, A-A 0

(A0 es A del tubo T0), moles de Pi formados; velocidad de reacción en
moles/min y concentración de AMP. Calcule la velocidad de reacción en
ausencia de AMP, Vo, promediando los valores obtenidos.
Determine el valor de la constante de inhibición, I0.5, y del
coeficiente de Hill (n), por ajuste de los datos a la ecuación de Hill para
inhibición cooperativa. Este ajuste se realizará en la sesión de trabajos
prácticos siguiente. La ecuación es:

V = V0 (I0.5)n / (I0.5)n + [AMP]n 

Calcule la actividad específica de la solución de enzima.

45
 SESIÓN 6

FOSFATASA ALCALINA

Las fosfatasas son enzimas que catalizan la hidrólisis del enlace de un

grupo fosfato a un compuesto orgánico. Las fosfatasas alcalinas de humano se
encuentran localizadas principalmente en el hígado, placenta, huesos e
intestino. El nombre de esta enzima alude a que presenta un máximo de
actividad a pH alcalino. La hepatitis, obstrucciones biliares y enfermedades
óseas producen un aumento de la concentración de la enzima en la sangre, por
lo cual la determinación de su actividad en el suero es un análisis de rutina en
el laboratorio clínico.
Existen varios métodos para la determinación de fosfatasa alcalina. En
el presente práctico se usará un ensayo cinético que emplea el sustrato
artificial p-nitrofenil-fosfato. Sustratos artificiales son de uso común en
ensayos de actividad de proteasas, óxido-reductasas, esterasas, lipasas, etc.
Típicamente los sustratos artificiales facilitan la determinación por existir una
diferencia considerable entre sus propiedades espectrópicas y las del
producto correspondiente, que se refleja en un cambio de absorbancia o de
emisión (fluorescencia) durante la reacción. Para poder usar un sustrato
artificial se requiere que la enzima lo acepte como sustrato.
La hidrólisis del p-nitrofenil-fosfato genera p-nitrofenol, el cual existe
como anión en solución alcalina. El anión p-nitrofenolato presenta una banda de
absorción cuyo máximo se encuentra a 400 nm, que le confiere un color
amarillo, mientras que la solución del p-nitrofenil-fosfato es prácticamente
incolora. Para la determinación de actividad enzimática se usa la longitud de
onda 405 nm, para evitar una pequeña interferencia del sustrato, encontrada a
400 nm.

Reacción catalizada:

O― PO3 -2
O-

+ H2O + PO4 -3 + 2 H+

NO2 NO2

En el ensayo cinético se lleva a cabo la reacción en la cubeta de un

espectrofotómetro que tiene un portacubetas termorregulado y se mide el
aumento de la absorbancia en el tiempo. El ensayo permitirá determinar en el

46
práctico la actividad enzimática (U/ml) de soluciones de fosfatasa alcalina. Los
objetivos del presente práctico son:

1. Estudiar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad

de la reacción catalizada.
2. Determinar la actividad específica de la fosfatasa alcalina usada en el
práctico.

PARTE EXPERIMENTAL

Instrumentos y materiales:

- Espectrofotómetros Genesys 2 ó 5 con baños circuladores termorregulados.

- Cubetas plásticas de 1 ml y camino óptico (l) igual a 1 cm
- Pipetas automáticas
- Tubos Eppendorf
- p-Nitrofenil-fosfato de sodio 60 mM en agua
- Tampón glicina NaOH 0,2 M pH 10,3 con 2 mM MgSO4 y 2 mM ZnSO4.
- Solución de fosfatasa alcalina de concentración (mg/ml) conocida (muestra)
- Tampón Tris/HCl 20 mM pH 8,0

Procedimiento:

1) Preparación de soluciones de fosfatasa alcalina de diferente concentración

A partir de la solución de la enzima de concentración 0,1 mg/ml prepare

soluciones de concentración 0,025; 0,05 y 0,075 mg/ml, diluyendo con tampón
Tris/HCl 20 mM pH 8,0. Prepare 200 l de cada solución, en tubos Eppendorf.
Mezcle las soluciones por inversión de los tubos tapados (no use Vortex),
posteriormente centrifugue algunos segundos para que las soluciones vuelvan al
fondo de los tubos.

2) Programación de los espectrofotómetros

 Retorne al menú principal desde el programa A/%T/C con la tecla EXIT

 Escoja el programa de cinética (cinética simple o cinética avanzada)
 Con la tecla SET UP TESTS fije:

Longitud de onda : 405 nm

Referir a long. de onda : apagado
Tiempo intervalo : 5 seg.
Tiempo total del ensayo : 80 seg.

47
Tiempo inicial de retardo : 0 seg.

48
 Retorne al programa de cinética (EXIT)

3) Ensayos de actividad enzimática

Coloque una cubeta con agua destilada como blanco (posición 1) en el

espectrofotómetro.
Prepare el medio de reacción mezclando en una cubeta:
Tampón glicina : 0,50 ml
p-NO2-fenilfosfato 60 mM : 0,10 ml
Agua destilada : 0,35 ml

Tempere en el espectrofotómetro durante 5-10 min a 37 ºC.

Agregue 50 l de la solución de enzima, tape con Parafilm, mezcle
rápidamente por inversión de la cubeta, coloque la cubeta en el instrumento
frente al haz de luz e inicie el programa cinético (“medir”).
Al término del tiempo del ensayo aparece en la pantalla del
espectrofotómetro el gráfico de la absorbancia en función del tiempo así
como el valor de A/min. Con el objetivo de conocer mejor el programa
cinético, para su primer ensayo de actividad, obtenga la tabla de los datos
numéricos e inspecciónela.

En el Genesys 5:
Para obtener la tabla de datos, así como para retornar al gráfico se utiliza
“modo de pantalla”.

En el Genesys 2:
Se usa “proceso post” y “función de pantalla” para obtener la “forma
tabular”.
Retorne al programa de cinética posteriormente e imprima (imprima
solamente para el primero de los ensayos de actividad).
En forma similar mida los valores de A/min para las otras 3 soluciones de la
enzima. No es necesario inspeccionar la tabla de datos cada vez.

Informe

a) Evaluación de datos: A partir de la velocidad de la reacción en A/min

calcule la concentración de p-nitrofenol generada por minuto. El coeficiente
de extinción de este compuesto a pH alcalino a 405 nm es  =17.900 M-1 cm-1.
Considerando el volumen de reacción (1 ml) calcule la cantidad de micromoles
del producto generado por minuto (velocidad de reacción en moles/min),

49
 que por definición es igual al número de unidades de actividad enzimática (U)
presentes en el test.
Considerando el volumen de solución enzimática agregada, calcule su
actividad enzimática (U/ml).
Considerando la concentración de la solución enzimática (mg/ml) calcule la
actividad específica.

b) Presentación de resultados: Confeccione una tabla de datos conteniendo

para cada concentración de enzima los valores de A/min, velocidad de
reacción (moles/min), actividad enzimática (U/ml) y actividad específica
(U/mg). Grafique velocidad de reacción (moles/min) en función de
concentración de la solución de enzima.

50
 BLOQUE III ÁCIDOS NUCLEICOS

SESION 7

A. AISLAMIENTO DE ADN PLASMIDIAL

INTRODUCCIÓN:

La propagación de segmentos individuales de ADN se logra

mediante el clonamiento del ADN. Esto involucra la purificación del gen,
análisis y reinserción en una célula huésped en particular. En general, el ADN
de interés carece de la habilidad de propagarse en la célula hospedera y por lo
tanto se liga a una molécula portadora, o vector que es capaz de replicarse en
el hospedero.
Los vectores más frecuentes que se utilizan para clonar
fragmentos de ADN y propagarlos en Escherichia coli son los plasmidios,
bacteriofágo lambda, cósmidos y bacteriófago M13. Estos son capaces de
replicarse en forma autónoma en E. coli aún cuando se les ha insertado un ADN
extraño. Los plasmidios son elementos genéticos extracromosomales que se
encuentran en una variedad de especies bacterianas y levaduras pero están
ausentes en eucariontes. Son de doble hebra, circulares y fluctúan entre 1 a
200 kb. Uno de los vectores más comunes es el plasmidio pUC19. Este ADN de
2.686 pares de bases contiene un gen que le otorga a las bacterias portadoras,
resistencia al antibiótico ampicilina y otro gen utilizado como marcador de
selección (lacZ) que codifica para la enzima -galactosidasa. Son portadores
además de la secuencia "ori" correspondiente al origen de replicación y de una
variedad de sitios de restricción que permiten insertar fragmentos extraños
para su propagación, proceso denominado clonamiento) o subclonamiento, si el
fragmento se traslada a un segundo vector (Fig. 1).
oriC
LacZ :gen beta galactosidasa

Sitio de múltiple
clonamiento

gen resistencia Promotor lacZ

ampicilina

Fig 1: Mapa físico del plasmidio pUC19

51
FIGURA 2: Detalle del sitio de múltiple clonamiento del pUC19

TAREA 1: Investigue como funciona el gen lacZ como marcador de

selección

Una vez clonado el ADN, el plasmidio recombinante (portador de

ADNs de distinto origen) se incorpora artificialmente a bacterias mediante la
técnica de transformación. Este procedimiento permeabiliza temporalmente
las células para la entrada de DNAs pequeños. En relación a la célula huésped,
la más utilizada es E. coli no sólo por la facilidad de manipulación tanto genética
como bioquímicamente sino también por ser el huésped natural de muchos
plasmidios y bacteriófagos. Existe una gran variedad de cepas bacterianas que
han sido producidas especialmente para ser utilizadas en clonamiento. Entre los
genotipos de interés se pueden mencionar: una mejor eficiencia de
transformación, carencia de la actividad de restricción/modificación,
crecimiento y propagación de bacteriófagos, cepas deficientes en proteasas
para el crecimiento y expresión del vector.

Los plasmidios utilizados como vehículos de clonamiento, deben cumplir

con algunos requisitos básicos, entre los cuales cabe mencionar:

 La capacidad de replicarse en forma independiente o autónoma

(portador de la secuencia "ori") en la célula bacteriana.

 La presencia de, por lo menos, un gen marcador que le confiera a las

células un nuevo fenotipo seleccionable. Por ejemplo: resistencia a un
antibiótico (e.j. ampicilina, “amp”").

 Una región de inserción de ADNs foráneos para la construcción de

moléculas de ADN recombinantes (sitio de múltiple clonamiento),
conteniendo un espectro completo de sitios únicos de cortes para
enzima de restricción. Algunos o todos estos sitios de restricción
deben estar localizados en uno de los genes marcadores de manera
que la inserción de un nuevo fragmento de ADN, inactiva su expresión
o funcionalidad facilitando la identificación del ADN recombinante.

52
  Esto se complementa con la expresión de un segundo gen marcador
en la misma molécula plasmidial, que le otorga un fenotipo
característico a la colonia transformada.

 Las restricciones impuestas por consideraciones de bioseguridad, las

cuales impiden la difusión de ciertos plasmidios.

 La eficiencia de la transformación en bacterias disminuye con el

incremento del tamaño molecular del plasmidios. Por lo cual, el tamaño
molecular de estos vectores debiera ser lo más bajo posible.

 Idealmente, el plasmidio debiera estar presente en múltiples copias

en la célula bacteriana facilitando así tanto el rendimiento en
cantidad del plasmidio como la expresión de los genes insertados

OBJETIVO DEL TRABAJO PRACTICO

Este práctico tendrá como objetivo central el aislamiento de

diferentes plasmidios recombinantes provenientes de una genoteca de cDNA
de hígado de carpa e identificar entre ellos aquel o aquellos que contengan un
cDNA que codifique para la apolipoproteína A-I (apoA-I) de este pez. Los
clones que se utilizarán fueron aislados durante un rastreo primario y
secundario de la genoteca con una sonda poco específica y por lo tanto lo más
probable es que varios de los clones seleccionados no correspondan a apoA-I.
Durante la construcción de la genoteca los insertos de cDNA fueron ligados
direccionalmente al vector plasmidial pBluescript SK- (Fig. 3) y la genoteca fue
propagada en la cepa bacteriana de E. coli XL-1Blue MRF, deficiente en la
actividad de restricción. Se aislarán estos ADN recombinantes con el
propósito de caracterizar parcialmente el inserto de ADN exógeno que éste
porta y posteriormente identificar, mediante amplificación por PCR con
partidores específicos, a los clones de apoA-I. La caracterización del inserto
incluirá: determinar la presencia de sitios de reconocimiento para
determinadas endonucleasas de restricción y a partir de los patrones de corte
obtenidos determinar el mapa físico parcial del ADN plasmidial, la orientación
en que se encuentra ligado el inserto en el vector y el tamaño del inserto.

53
Figura 3: Mapa físico de pBluescript SK- y su region de clonamiento múltiple

METODOLOGIA:

Se empleará el procedimiento de extracción por lisis bacteriana

por ebullición (Sambrook y col., 1989). Este procedimiento se aplica de rutina
para el rápido rastreo de plasmidios recombinantes.
El ADN plasmidial se aislará a partir de cultivos líquidos de Escherichia
coli recombinantes crecidas hasta fase estacionaria (cultivo de toda la noche).
El rendimiento y la pureza del ADN obtenido por este método son compatibles
con la posterior amplificación, análisis de restricción y para el uso en la
mayoría de las reacciones de modificación del ADN.

54
 AISLAMIENTO DEL ADN PLASMIDIAL

PROCEDIMIENTO:

1.- TRANSFERIR EL CULTIVO LÍQUIDO BACTERIANO A UN TUBO

EPPENDORF (APROX. 1,2 ml)

2.- CENTRIFUGAR EN CENTRÍFUGA EPPENDORF DURANTE 3 MINUTOS A

10.000 RPM Y A TEMPERATURA AMBIENTE.

3.- ELIMINAR EL SOBRENADANTE EN RECIPIENTE CON CLORO Y

RESUSPENDER POR AGITACIÓN EN VORTEX EL SEDIMENTO
CELULAR, CON 110l DE SOLUCIÓN STETL. ESTA SE PREPARA
ADICIONANDO 10l DE LISOZIMA (50mg/ml) A 1 ml DE SOLUCIÓN
STET JUSTO ANTES DE USAR).

4.- HERVIR LA MUESTRA EN UN FLOTADOR A BAÑO MARÍA (100 C)

DURANTE 1 MINUTO

5.- CENTRIFUGAR LOS TUBOS A MÁXIMA VELOCIDAD A TEMPERATURA

AMBIENTE DURANTE 10 MINUTOS.

6.- TRANSFERIR EL SOBRENADANTE A UN TUBO EPPENDORF LIMPIO

CUIDANDO DE NO CONTAMINAR CON EL SEDIMENTO DE
CONSISTENCIA MUCOSA. ADICIONAR UN VOLUMEN IGUAL (POR LO
GENERAL 100l) DE ISOPROPANOL Y VORTEXEAR POR UNOS
SEGUNDOS.

¿POR QUÉ ES IMPORTANTE NO TRANSPASAR EL SEDIMENTO? ¿QUÉ

CONTIENE?

7.- CENTRIFUGAR DURANTE 15 MINUTOS A TEMPERATURA AMBIENTE.

8.- ASPIRAR EL SOBRENADANTE CUIDADOSAMENTE Y ADICIONAR 0,5

ml DE ETANOL 70% SUAVEMENTE POR LA PARED CONTRARIA DE
DONDE ESTA EL SEDIMENTO.

9.- DEJAR EN REPOSO DURANTE 3 MINUTOS Y ELIMINAR EL EXCESO DE

ETANOL CON MICROPIPETA.

10.- CENTRIFUGAR BREVEMENTE Y LUEGO REMOVER TODO EL ETANOL

REMANTENTE CON MICROPIPETA.

55
11.- SECAR EL SEDIMENTO EN SPEED-VAC POR 5 MINUTOS O A
TEMPERATURA AMBIENTE HASTA QUE ESTE SECO (APROX. 15 MIN).

12.- DISOLVER EL PRECIPITADO DE ADN PLASMIDIAL EN 25l DE

TAMPÓN TE pH 8,0.

13.- UTILIZAR 5 l DE LA PREPARACIÓN PARA DIGESTIÓN CON LA(S)

ENZIMA(S) DE RESTRICCIÓN DE INTERÉS.

REACTIVOS

SOLUCIÓN STET (SIN LISOZIMA)

8% (p/v) SACAROSA
50mM TRIS-HCl, pH 8,0
50mM EDTA
5% TRITÓN X-100. FILTRAR A TRAVÉS DE FILTRO ESTÉRIL DE O,45 m
Y ALMACENAR A 4 C.

LISOZIMA
50 mg/ml DE LISOZIMA EN AGUA DESTILADA
FILTRAR A TRAVÉS DE FILTRO ESTÉRIL DE 0,45 m Y ALMACENAR EN
ALÍCUOTAS DE 20 l A 70 C.
EL STOCK DE LISOZIMA NO SE PUEDE VOLVER A CONGELAR

TAMPÓN TE pH 8,0
TRIS-HCL 10 mM pH 8,0
EDTA 1 mM pH 8,0

AISLAMIENTO DE ADN GENÓMICO

1. Objetivo de la Actividad:

Analizar las propiedades físicas y bioquímicas de la molécula de DNA en

las distintas etapas de extracción a partir de tejido animal. Manipular y
observar a simple vista el DNA genómico, la macromolécula clave de la vida.

Material:

 Trozo de tejido, aproximadamente 500 mg de hígado de ratón (puede ser

de otra especie)

56
PBS (phosphate buffered saline): Disolver 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2HPO4;

0,24 g KH2PO4 en 800ml H2O destilado, ajustar a pH 7.4 con HCl, aforar a 1

l y autoclavar.

 NaCl 2M

 Etanol 100% frío

 Etanol 70% frío

 TE: 10mM Tris / HCl pH 7.4, 1mM EDTA

Procedimiento:

1. Agregar 3ml de la solución de PBS fría a 500 mg de un trozo de hígado

contenido en un tubo Falcon de 15 ml mantenido en hielo.

2. Homogenizar con ultraturrax, intensidad máxima UNA VEZ por 3

segundos.

3. Centrifugar a 4000 rpm, 7 min a temperatura ambiente, descartar el

sobrenadante.

4. Resuspender el pellet en 3ml PBS 1x cuidadosamente.

5. Agregar 3 ml NaCl 2M y mezclar por inversión suavemente!

6. Agregar 2ml etanol 100% y mezclar SUAVEMENTE, rotando el tubo dos

veces.

7. Extraer el ADN genómico enrollándolo en una pipeta Pasteur y trasvasijarlo

a un tubo Falcon conteniendo 2 ml de etanol 70%. Lavar por 2 minutos.

8. Dejar la pipeta Pasteur con el ADN enrollado al aire, a temperatura

ambiente por 10 min, para que se seque.

9. Resuspender el DNA en un tubo conteniendo 1ml de buffer TE a

temperatura ambiente, desenrollándolo de la pipeta Pasteur.

Referencia:
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning – a
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

57
 SESIÓN 8

DIGESTION DEL ADN CON ENZIMAS DE RESTRICCION.

Experimentos realizados por Arber y Linn (1968) y Meselson (Meselson y

Yuan, 1968) han demostrado que en el fenómeno de restricción y modificación
controlado por un huésped. La restricción se produce a consecuencia de la
acción de una endonucleasa capaz de cortar enzimáticamente al DNA
infectante, mientras que la modificación es el resultado de la metilación del
DNA del huésped. La metilación de algunas bases en la secuencia de DNA
reconocidas por endonucleasas de restricción, protegen al ácido nucleico del
organismo huésped frente a la digestión por sus propias nucleasas. De esta
forma, el organismo se vuelve inmune frente a la restricción. El DNA exógeno
que no está metilado, es reconocido tan pronto como ingresa a la célula
bacteriana y es digerido inmediatamente e inactivado.
Las endonucleasas de restricción del tipo II reconocen sitios de DNA
específicos que coinciden con el sitio del corte. Estas enzimas son muy
estables y solamente necesitan Mg+2 como cofactor. Según Smith y Nathans
(1973) cada enzima está representada por tres letras derivadas del nombre
del género de la bacteria de la cual la enzima es purificada. Así por ejemplo
Hae viene de Haemophilus aegypticus, Sma de Serratia marcenscens. Distintos
serotipos del mismo organismo se identifican por la adición de una cuarta letra.
Hinf, e.g. representa la enzima aislada del serotipo f de Haemophilus influenza.
Ocasionalmente, es posible aislar dos o más enzimas de la misma cepa
bacteriana; estas se distinguen normalmente por números romanos, como
HaeII o HaeIII. Varias endonucleasas del tipo II reconocen secuencias de
tetra-, penta- o hexanucleótidos en el DNA. Estas secuencias de
reconocimiento por convención se escriben de izquierda a derecha en la
dirección del 5’ - 3’. Por lo tanto, GAATTC representa 5’-GAATTC-3’. La
mayoría de estas secuencias tienen un eje de simetría rotacional. Por ejemplo
en la secuencia de reconocimiento de EcoRI

5’-GAATTC-3
3’-CTTAAG-5’

la lectura es idéntica en sentido 5´ a 3´. El corte hidrolítico de las dos hebras

de DNA ocurre dentro la secuencia de reconocimiento. Ese proceso genera
términos 3’ o 5’ simple hebra recesiva o protuberante (cortes escalonados).
Otras enzimas cortan de tal manera que los fragmentos de DNA resultantes
tienen extremos romos. Los extremos en el 3’ siempre llevan el grupo hidróxilo
y los del 5’ siempre el grupo fosfato.

58
 Los extremos de DNA de una molécula digerida por una enzima, pueden
formar apareamiento de bases complementarias (extremos cohesivos) con
otras moléculas de DNA que proporcionan los mismos extremos. Esta
importante observación fue descrita por primera vez por Mertz y Davis (1972)
cuando estudiaban la enzima EcoRI (G/AATTC).
Las digestiones por endonucleasas de restricción están fuertemente
influenciadas por las condiciones de la reacción, ej. pH, concentración de sal,
Mg+2 y temperatura. Desviaciones de las condiciones óptimas de la reacción
podrían cambiar la especificidad del corte o inhibir la actividad enzimática.

Patrones de cortes de enzimas de restricción de tipo II:

5’-GpApApTpTpC-3’ 5’-GOH 3’
      
3’-CpTpTpApApG- 5’ 3’-CpTpTpApAp-5’

EcoRI Extremo 5’ protuberante

5’-CpTpGpCpApG-3’ 5’-CpTpGpCpAOH 3’
      
3’-GpApCpGpTpC-5’ 3’-Gp 5’

PstI Extremo 3’ protuberante

5’-GpGpCpC-3’ 5’-GpGOH 3’
     
3’ CpCpGpG-5’ 3’-CpCp 5’

HaeIII Extremos romos

59
MATERIALES:

 ADN plasmidial (miniprep) aproximadamente 1g/l y/o ADN genómico

 Tampones enzimas de restricción (10x: tampones de reacción concentrado)

 Enzimas de restricción, 10 U/l

 Tampón de carga: 30% glicerol

0,25% azul de bromofenol
0,25% Xylene cyanol

DIGESTION DEL ADN PLASMIDIAL CON ENZIMAS DE

RESTRICCIÓN

PROCEDIMIENTO:

1.- Ud. deberá buscar en un catálogo las características de las enzimas que

utilizará así como también el tampón requerido para la reacción y las

condiciones de temperatura y tiempo de incubación recomendados.

2.- Por lo general, las digestiones analíticas se realizan en un volumen final de

20 l que contiene los siguientes componentes:

MEZCLA DE REACCIÓN

ADN PLASMIDIAL (MINIPREP) 5l

TAMPÓN DE REACCIÓN 10X 2l
AGUA DESIONIZADA ESTÉRIL 12 o 12,5 l
ENZIMA DE RESTRICCIÓN 0,5 l (5 Unid.)
20 l totales

3.- La mezcla de reacción se incuba a la temperatura óptima de la enzima por al

menos 1 hora.

60
4.- Luego se centrifuga la muestra y se le agrega solución de carga para

separar los productos de la digestión en un gel de agarosa.

La solución de carga se utiliza a una concentración (6X) o 6 veces concentrada

y contiene: (azul de bromofenol 0,25% y glicerol al 30% en agua). En este caso

se adicionan 4l (1/6) a los 20l de muestra. El glicerol se utiliza para

aumentar la densidad de la muestra y evitar que se salga de los pocillos del gel,

y el colorante (azul de bromofenol) se utiliza para visualizar la migración del

frente iónico.

CARACTERIZACIÓN DEL ADN RECOMBINANTE

CUANTIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DEL ADN PLASMIDIAL

Tanto los ácidos nucleicos como los nucleótidos libres poseen un máximo

de absorción a 260 nm y por ello se puede estimar su concentración tomando

en consideración su absorbancia a esta longitud de onda.

Un parámetro que se utiliza bastante para determinar el grado de

pureza del ácido nucleico aislado es la determinación de la razón A 260/A280. En la

medida que la razón es igual o mayor a 1,8, se considera que el nivel de pureza

es aceptable.

Pregunta: ¿Por qué este cuociente es un indicio de la pureza del ADN?

Para un ácido nucleico purificado y sin degradación se consideran las

siguientes relaciones:

Una solución de ARN de una concentración de 40g/ml presenta una A260 = 1

Una solución de ADN doble hebra de 50g/ml  A260 = 1.

Una solución de ADN hebra simple de 37g/ml  A260 = 1.

61
Si se conoce la secuencia o la composición y tamaño del ácido nucleico en

cuestión se puede calcular su coeficiente de extinción molar y de esta forma

determinar su concentración en forma más precisa.

Procedimiento:

1) Preparar diluciones del ADN a medir. Por ej.:

tubo 1: 5l en 995 l de H2O

tubo 2: 10l en 990 l de H2O

2.) Cuantificar espectrofotométricamente. Prender la lámpara de deuterio

(D2) y seleccionar en el menú del instrumento la opción: relación de
absorbancias (por defecto el instrumento trae programada la razón
A260/A280. Utilizar cubeta de cuarzo para las mediciones. Ajustar el cero
del instrumento con un blanco de agua (H2O).

3.) Medir la relación de absorbancias de las diluciones de ADN.

4.) Estimar la concentración del ADN tomando en cuenta el factor de

dilución.

5.) Estimar la pureza de la preparación de ADN, tomando en consideración el

cuociente obtenido.

El cuociente de DNA puro corresponde a: A260/A280 = 1,8 - 2,0

FRACCIONAMIENTO ELECTROFORETICO DEL ADN DIGERIDO EN

GELES DE AGAROSA.

La electroforesis en geles de agarosa es usada para resolver

fragmentos de DNA lineales en base a su peso molecular. Los fragmentos

pequeños migrarán más rápido que los más grandes, y la distancia de migración

en el gel varía en forma inversamente proporcional al log del peso molecular.

Esto sólo es válido en un rango de pesos moleculares el cual varía dependiendo

62
de la concentración de agarosa del gel. El tamaño de los fragmentos puede por

tanto determinarse experimentalmente separando en el mismo gel estándares

de tamaño conocido.

Dependiendo del tamaño de los fragmentos a separar se preparará un gel

de agarosa entre 0,8 -1 % (p/v) en tampón TAE 1X (Tris-acetato 40 mM, EDTA

1mM), conteniendo además 0,1 mg/ml de bromuro de etidio. Como tampón de

corrida se utilizará TAE 1X y como solución de carga para las muestras, la

solución 6X antes mencionada.

OBS: AVERIGUAR QUE CONCENTRACIÓN DE AGAROSA LE PERMITE

SEPARAR LINEALMENTE FRAGMENTOS DE ADN DE UN TAMAÑO

ENTRE 2 Y 0,5 KPB

PREPARACIÓN DEL GEL

Para preparar un gel grande se requiere preparar aproximadamente 120

ml de solución de agarosa. Se pesa la agarosa y se vacía en un matraz

Erlenmeyer de 250 ml, se le adicionan 90 ml de agua destilada y esta mezcla se

funde en el horno de microondas a una potencia de 70% y agitando

ocasionalmente, luego se adiciona 2,4 ml de tampón TAE 50X y se afora en

probeta hasta 120 ml con agua destilada. Se mezcla rápidamente transfiriendo

de vuelta la agarosa al matraz Erlenmeyer se le adicionan 2 l de solución stock

de bromuro de etidio 10 mg/ml (Ojo: compuesto mutagénico) y se mezcla

rápidamente para evitar que la agarosa se solidifique.

Finalmente se vacía la solución en el molde sellado con cinta adhesiva y

con la peineta puesta. Se deja solidificar por 20-30 min y luego se remueven

las cintas, se sumerge el gel en el tampón de corrida dentro de la cámara, se

63
remueve la peineta, se cargan las muestras y el estándar y se corre el gel a 100

mA por 30-60 minutos dependiendo de la separación deseada.

Una vez que el colorante ha migrado cerca de 2/3 de la longitud del gel,

se apaga la fuente de poder y se examina el gel bajo la luz ultravioleta

(transiluminador).

Se le entregará adicionalmente el estándar de tamaños moleculares que

deberá cargar al gel en un pocillo lateral. Cuando los fragmentos deADN a

separar son  500 pb y  que 10.000 pb, se utiliza comúnmente como estándar

el ADN del fago lambda () digerido con la enzima HindIII.

El gel será fotografiado o la imagen digitalizada. Luego tomando en

cuenta las migraciones relativas (cm) de los fragmentos respecto de los

estándares, se calculará el tamaño de los fragmentos obtenidos y se construirá

un mapa físico parcial del inserto de ADN en estudio.

Construir una tabla con las distancias migradas desde el origen (cm) de cada

uno de los fragmentos que constituyen el estándar de pesos moleculares y los

fragmentos de ADN de tamaño desconocido de la muestra. En otra columna

indicar el logaritmo decimal del peso molecular de los estándares. Construir la

curva de calibración correspondiente e interpolar los valores para la muestra.

64
Nota: El estándar de peso molecular utilizado será el DNA del bacteriófago 
digerido con HindIII que genera los siguientes fragmentos: 23,1; 9,4; 6,6; 4,4;
2,3; 2,0; 0,56 y 0,12 kilo pares de bases (kb). El fragmento más pequeño
frecuentemente no es detectado

65
 TRANSFERENCIA DE SOUTHERN

INTRODUCCIÓN:

Este procedimiento se realiza para detectar una determinada secuencia

de ADN por hibridación de este ADN, previamente separado por

electroforesis, desnaturado in situ y transferido a una membrana, con una

sonda complementaria marcada y desnaturada.

La transferencia por capilaridad de las moléculas de ADN desde el gel a

un soporte sólido más resistente, como una membrana de nitrocelulosa o nylon,

permite realizar todas las etapas (prehibridación, hibridación y lavados) sin

problemas de fractura del soporte y además permite eliminar mediante el

proceso de prehibridación en forma muy importante la unión de sonda a sitios

inespecíficos.

OBSERVACIÓN: El procedimiento de Southern blot sólo se realizará en

forma demostrativa para todo el curso y hasta la etapa de

montaje solamente.

TRATAMIENTO DEL GEL

1.- Sumergir el gel en 500 ml de HCl 0,25 M por 10 min. con agitación suave

(10,4 ml de 37% HCl o 12N). Esta etapa solo se requiere cuando se han

separado fragmentos de ADN de 15kb o más. Esta etapa puede contribuir a

la transferencia de fragmentos de ADN de 15 kb o mayores, gracias a que

produce depurinización en el ADN lo que genera “nicks”.

2.- Enjuagar 5 veces con agua destilada desionizada, utilizando aprox. 200 ml

cada vez.

3.- Cubrir el gel con aprox. 300 ml de solución de denaturación y agitar

suavemente durante 15 minutos (dos veces).

66
4.- Cubrir el gel con solución de neutralización (2 x 15 min.).

5- Finalmente dejar el gel en 20X SSC hasta su transferencia.

TRATAMIENTO DE LA MEMBRANA

1.- Cortar un trozo de papel de nitrocelulosa y dos trozos de papel filtro 3MM

del tamaño del gel y prehumedecer la membrana en agua desionizada.

Chequear que no haya manchas secas en ella.

2.- Transferir la membrana a solución 20X SSC.

3.- Montar el blot según esquema. (Ver Esquema pg. 66).

4.- Cambiar varias veces papel absorbente y transferir durante al menos 10 h

5.-Desmontar el blot, y secar el filtro al vacío a 80 ºC por 2 horas.

6.- Prehibridar el filtro incubando en solución de prehibridación

(200l/cm2) a 42 ºC por una a dos horas en una bolsa de hibridación.

7.- Desechar la solución de prehibridación y reemplazar por la solución de

hibridación, que contiene la solución de prehibridación con la sonda

marcada radiactivamente (32P, CUIDADO!) e incubar toda la noche a 42

ºC.

Observación: La sonda radioactiva debe haber sido previamente

desnaturada por calentamiento >94 ºC durante 3 min y luego enfriada

rápidamente en hielo.

8.- Recuperar la solución de hibridación en un tubo Falcon y lavar el filtro con

las siguientes soluciones:

1º. 2x SSC, 0,1 % SDS a temperatura ambiente 5 min

2º. 2x SSC, 0,1 % SDS a 42 ºC ,15 min
3º. 1x SSC, 0,1 % SDS a temperatura ambiente 15 min., por dos
veces
4º. 0,5x SSC, 0,1 % SDS a temperatura ambiente 15min

67
 Observación: Las condiciones de hibridación y la estrictez de los lavados

dependerán de la sonda utilizada. Si la sonda es homóloga (100%

complementaria y de un tamaño superior a 100 pb se puede lavar el blot

a máxima estrictez lo que equivale a una temperatura de 65 ºC y baja

concentración de sal (ej. 0,5xSSC).

¿Cómo influye la concentración de la sal en la estabilidad del híbrido

formado? ¿Por qué?

9.- Envolver la membrana en film plástico y exponer en cassette con placa

autoradiográfica a -80 ºC durante toda la noche. Revelar la placa

autoradiográfica y comparar la señal positiva de la autoradiografía con la

imagen del gel; identificar el fragmento de DNA de interés

sobreponiendo la foto del gel con la placa autorradiográfica.

SOLUCIONES

BUFFER DE DENATURACION
1,5 M NaCl (87.66 g)
0,5 M NaOH (20 g)
Completar a 1 l con H2O destilada

BUFFER DE NEUTRALIZACIÓN
1,5 M NaCl (87,66 g)
0,5 M Tris base (60,55 g)
Ajustar a pH 7.5 utilizando HCl conc. y completar a volumen de 1 l Almacenar a
temperatura ambiente.

50X TAE
242 g Tris base
51,1 ml glacial ácido acético
100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0)
Completar a 1 l con agua desionizada y almacenar a temperatura ambiente.

68
Esquema de la Transferencia de Southern
(Southern blot)

SESIÓN 9

AMPLIFICACION DE SECUENCIAS GENICAS (PCR) E HIBRIDACIÓN

MOLECULAR

INTRODUCCIÓN:

69
 SESIÓN 9

AMPLIFICACION DE SECUENCIAS GENICAS (PCR) Y SEPARACIÓN

ELECTROFORETICA EN GEL DE AGAROSA

La reacción de la polimerasa en cadena (PCR) es un método rápido y de alta

sensibilidad mediante el cual es posible aislar secuencias génicas presentes en
una copia en una mezcla compleja de ADNs. Este procedimiento se ha
convertido por lo tanto en una importante herramienta tanto en el campo de la
investigación biológica como en el diagnóstico clínico ya que permite en forma
rápida y específica el aislamiento y caracterización de genes y ARNs.

La amplificación de secuencias génicas in vitro consiste básicamente en

la síntesis de un segmento específico de DNA utilizando como partidores dos
oligonucleótidos de secuencia complementaria a las regiones laterales del
segmento génico que se desea generar. Se distinguen por lo tanto un partidor
complementario a la hebra superior y otro diferente complementario a la hebra
inferior. La reacción involucra: desnaturación por calentamiento del ADN
(separación de las hebras), apareamiento de los partidores a las hebras de
ADN y extensión de estos con ADN polimerasa. Los partidores hibridan con las
hebras separadas de la secuencia a amplificar y orientados de modo que la
síntesis de ADN por la ADN polimerasa ocurra entre los dos oligonucleótidos.
Ciclos sucesivos de amplificación doblan la cantidad del ADN sintetizado de
manera que se acumula exponencialmente el segmento de interés en 2 n, en
donde n corresponde al número de ciclos realizados.

PARAMETROS QUE AFECTAN LA ESPECIFICIDAD, FIDELIDAD Y

RENDIMIENTO.

La reacción de PCR debe ser optimizada en cada caso, especialmente

cuando se aplica al diagnóstico o análisis de la secuencia generada. Una
reacción estándar contiene de 105 a 106 moléculas de DNA templado, 20 pmoles
de cada partidor, 50 M de cada dNTP, 2 unidades de la enzima Taq ADN
polimerasa y el buffer de la enzima conteniendo las condiciones salinas
apropiadas. La reacción se inicia desnaturando el ADN en un equipo
termociclador que permite programar el número requerido de ciclos.
Generalmente se utilizan 25 a 35 ciclos de PCR usando condiciones de
temperatura que varían entre: desnaturación a 94-96 oC, 30 segundos,
apareamiento del partidor a 50-60 oC, 30 segundos y extensión del partidor a
72 oC, 1 minuto. El ciclo culmina con 5 minutos de extensión a 72 oC.

70
 Posteriormente, el ADN sintetizado se analiza en geles de agarosa
teñido con bromuro de etidio.

La disponibilidad de una DNA polimerasa termoestable aislada de

especies bacterianas de Thermus aquaticus (Taq), ha simplificado esta
reacción ya que es estable a las repetidas alzas de temperatura (94-95 oC)
requeridas para la separación de las hebras del templado, evitando así la
necesidad de tener que añadir la enzima en cada ciclo. La temperatura óptima
de actividad de la Taq DNA polimerasa está entre 70 a 80 oC con una actividad
específica de 150 nucleótidos por segundo por molécula de enzima,
dependiendo de la naturaleza del templado.

La frecuencia de error de copia más baja estimada para la enzima

(dependiendo del origen de la enzima) ha sido de aproximadamente 5 x 10 6 por
nucleótido incorporado por ciclo al utilizar concentraciones de dNTP de 200
M cada uno, Mg+2 de 1,5 mM (25 ciclos a 54-55 oC temperatura de
apareamiento del partidor). En general, dependiendo del largo y secuencia del
segmento a amplificar, los cuatro dNTP deben usarse a baja concentración
(20-200 M) para minimizar la extensión de partidores apareados en otras
regiones del templado. Por ejemplo, para sintetizar 10 pmoles de un fragmento
de 400 pares de bases es suficiente utilizar 20 M de cada dNTP en 100 l de
reacción. La concentración de Mg +2 es importante de considerar pues afecta el
apareamiento del partidor, desnaturación de las hebras, actividad de la enzima
y fidelidad de copia y formación de dímeros de partidor. Una concentración
óptima fluctúa entre 0.5 y 2.5 mM Mg+2.

Otro factor importante a considerar en la reacción de PCR es el

apareamiento de los partidores. La temperatura y tiempo requerido para la
formación del ADN templado-partidor dependerá de la composición de bases,
largo y concentración de los partidores. Una temperatura óptima al respecto es
5 oC bajo el Tm de los partidores. Generalmente la temperatura de
apareamiento fluctúa entre 50 a 60 oC. El aumento de la temperatura de
apareamiento aumenta la posibilidad de discriminar partidores apareados
erróneamente y evita extender nucleótidos no complementarios al extremo 3'.
Por esta razón, resulta conveniente agregar la enzima después de la etapa de
desnaturación, durante el apareamiento del partidor. De igual manera, una
eficiente extensión dependerá del largo y concentración de la secuencia a
amplificar.
Las condiciones iónicas son también fundamentales para el éxito de la
reacción de amplificación. La Taq ADN polimerasa es sensible a las
concentraciones de iones magnesio e iones monovalentes. La concentración de

71
Mg+2 dependerá de la concentración de dNTP por cuanto estos tienen la
capacidad de unir el ión.
Una de las razones más frecuentes de falla de la reacción de PCR es la
incompleta desnaturación del ADN templado. Normalmente se utiliza 95 oC por
30 segundos o 97 oC por 15 segundos, sin embargo esto dependerá de la
composición nucleotídica del ADN y será necesario aumentarla en casos de
amplificar secuencias ricas en guanina-citosina (GC). La desnaturación
incompleta conduce al re-apareamiento del ADN reduciendo la concentración
del templado en la reacción. Por otra parte, tiempos de desnaturación muy
prolongados afectan la actividad de la enzima. La vida media de la Taq ADN
polimerasa es superior a 40 minutos 95 oC.
Finalmente, es indispensable incluir en los ensayos el control de la
reacción. Para esto, se realizan reacciones en paralelo en que no se incluye el
ADN templado o se puede hacer utilizando un templado que carece de la
secuencia blanco.

MATERIALES:

1. Puntas de pipetas, tubos Eppendorf de 0,6 ml, guantes.

2. Todo este material se utiliza estéril y UV irradiados para eliminar trazas

de ADN contaminante.

3. Termociclador

REACTIVOS UTILIZADOS

 ADN templado

 Taq ADN polimerasa

 4dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP)

 Tampón de la enzima 10 x

 Oligonucleótidos partidores (cebadores)

 Agua libre de nucleasas

 Vaselina estéril

72
TODA LA MANIPULACIÓN DE REACTIVOS SE HACE CON GUANTES
CUIDANDO DE NO CONTAMINARLOS

PROCEDIMIENTO:

REACCION DE AMPLIFICACION (PCR)

a) Se adiciona 1 l del ADN templado conteniendo aprox. 10 ng al tubo

rotulado con su nombre. Mantener el tubo cerrado.

b) Programar el termociclador de acuerdo con el templado y partidores a

utilizar. El ciclo de temperaturas se determina basándose en el cálculo
de la Tm de los DNAs partidores. Tm = 2 (AT) + 4 (GC).

c) Preparar un “mix” por mesón que contenga todos los reactivos menos el
ADN templado y la vaselina. Los volúmenes de los reactivos a utilizar
para cada reacción le serán entregados por los profesores. Uds.
deberán calcular las cantidades requeridas para n+1 tubos (siendo n =
al número de alumnos del mesón).

d) Agregar 24 l del “mix” a cada tubo y mezclar.

e) Agregar por último 20 l de vaselina sobre la mezcla de reacción.

f) Prepara un tubo por mesón que corresponda a un control negativo, es

decir sin el templado o utilizando un templado distinto que no hibride
con los partidores.

Ojo: Siempre es recomendable partir agregando el templado o agua y

los demás reactivos al tubo correspondiente al control negativo para
evitar así contaminación con los controles positivos.

¿Por qué es necesario realizar un control negativo cada vez?

¿Cómo interpretaría el resultado si el control negativo le da positivo?

El programa siempre parte con una etapa inicial de calentamiento del ADN
templado a 94 ºC durante 2 a 5 minutos para desnaturarlo y eliminar
posibles DNasas y proteasas que inactivan al ADN y a la polimerasa,
respectivamente.

73
 Para analizar el producto de amplificación por electroforesis en geles de
agarosa se tomará una alícuota de la reacción (ej: 15 l, cuidando de no
remover la vaselina). Para ello se presiona el émbolo de la micropipeta hasta la
primera posición, se sumerge el tip hasta el fondo del tubo y se succiona
lentamente el volumen soltando la presión del émbolo gradualmente. Finalmente
se limpia el tip por fuera para eliminar la vaselina que quedó por fuera. Se
agrega el tampón de muestra 6x TAE (3 l) y se aplica al gel. El gel se prepara
al 1% agarosa en tampón TAE tal como se detalla en la página 60.
NOTA: Puesto que esta técnica es extremadamente sensible, el mayor
inconveniente que esto acarrea es la alta posibilidad de una contaminación del
material con el que se trabaja. Ello se reflejaría eventualmente en que los
controles negativos den positivos. Es por ello que es vital trabajar con el
máximo cuidado evitando cualquier posibilidad de contaminación con ADN. Por
este motivo, previo a la reacción de amplificación, se irradia todo el material
plástico estéril (pipetas, puntas, tubos, guantes) con lámpara germicida UV
durante 20-30 min.

Esquema reacción de PCR (1er ciclo)

5’•••―――――――――――――――••• 3’ ADN templado

3’•••―――――――――――――――••• 5’

+ desnaturación ADN templado

 enfriamiento y apareamiento
partidores

5’•••―――――――――――――――••• 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ •••―――――――――――――――••• 5’

dNTPs-Mg+2  Taq polimerasa

72 C

5’•••―――――――――――――――••• 3’
 5’

5‘  Extensión de partidores

3’•••―――――――――――――――••• 5’

74
EL INFORME GRUPAL SE CONFECCIONARÁ UTILIZANDO LA MISMA
PAUTA INDICADA AL FINAL DEL BLOQUE I.

BIBLIOGRAFIA

1. Mertz, J.E. and Davis, R.W. (1972). Cleavage of DNA by RI restriction

endonuclease generates cohesive ends. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,
3370-3374.
2. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning. A
Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York.
3. Catálogos e.j. Life Technologies, Promega, Invitrogen o New England Biolabs.
4. Purificación de plasmidios. H.C.Birnboim (1983) Methods in Enzymology vol.
100
5. Digestión de DNA con enzimas de restricción. R.Fochs y R. Blakesley (1983)
Methods in Enzymology Vol. 100
6. Análisis electroforético de fragmentos de DNA en geles de agarosa. G.H.
Johnson y L.I. Grossman (1977) Biochemistry 16: 4217- 4224.

CUESTIONARIO

Extracción de DNA

1. ¿Qué actividad enzimática tiene lisozima?

2. Discuta el efecto del tratamiento con calor y con SDS.

3. Señale el efecto de las sales en la solubilidad de los ácidos nucleicos.

4. Discuta la utilización de solventes orgánicos como isopropanol o etanol en la

precipitación de ácidos nucleicos.

5. Discuta: ¿qué contaminantes se esperarían encontrar en la preparación de

ADN plasmidial o genómico realizada? Sugiera un procedimiento de
purificación a seguir.

6. Discuta si la cuantificación del ADN plasmidial que realizó midiendo

absorbancia a 260 nm es exacta o no.

75
7. ¿Cuántas bandas espera observar en el gel para el ADN plasmidial digerido
y sin digerir? (Asuma que la enzima de restricción cortará en un sitio único)
Explique.

8. ¿Qué resultado espera obtener después de la digestión de ADN genómico

con la misma enzima de restricción? Fundamente su respuesta.

Enzimas de restricción

9. ¿Qué son las enzimas de restricción?

10. Asuma que el plasmidio pBR322 es portador de un fragmento foráneo de

DNA de un tamaño de 1230 pares de bases. Este fragmento fue clonado
en el sitio BamHI del vector y es portador de un sitio EcoRI a 200 pares
de bases de un extremo.

TAREA:

a) Construya un mapa de restricción del vector recombinante indicando la

posición del fragmento clonado y la ubicación en el inserto del sitio
EcoRI.

b) Qué experimento haría para demostrar que efectivamente su diseño

propuesto es el correcto. Describa sus resultados.

Electroforesis y Southern blot.

11. ¿Cómo influye la concentración de la agarosa en la resolución de la

separación de los fragmentos de DNA de distintos tamaños? ¿Qué
concentración de agarosa usaría para separar bien dos fragmentos de
DNA de tamaño de 1000 bp y 1200 bp?

12. ¿Por qué se desnatura el ADN en el gel antes de transferir y fijarlo al

soporte de nitrocelulosa?

13. La hibridación molecular se realiza por el apareamiento de hebras simples

de ácidos nucleicos. ¿Qué factores influyen en la especificidad de la
hibridación?

76
 Problemas PCR
14. Calcule la Tm de los partidores universales T3 y T7 presentes en el ADN
plasmidial que Ud. utilizará en el práctico.

15. Calcule la cantidad de copias de un gen único, de 1500 pares de bases de

largo, contenidos en 200 ng de DNA cromosomal bacteriano (4 x 10 6
pares de bases).

16. Mencione al menos 3 factores que afectan la reacción de PCR.

17. Características de la enzima Taq DNA polimerasa.

MCG/AMZ

77