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FACULTAD DE CIENCIAS
UACh
2004
INDICE DE CONTENIDOS Pág.
SOLUCIONES Y TAMPONES 3
PROBLEMAS SOLUCIONES 7
PH Y TAMPONES 8
PROBLEMAS TAMPONES 14
ANEXO MICROPIPETAS 17
BLOQUE PROTEÍNAS 19
SESIÓN 1 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD 21
SESIÓN 2 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS 23
SESIÓN 3 ELECTROFORESIS EN GEL POLIACRILAMIDA Y 26
TRANSFERENCIA
SESIÓN 4 ANÁLISIS DE WESTERN 30
PAUTA INFORME GLOBAL 32
BLOQUE ENZIMAS 35
SESIÓN 5 FRUCTOSA 1,6 BISFOSFATASA 41
SESIÓN 6 FOSFATASA ALCALINA 43
I. SOLUCIONES
2
UNIDADES DE CONCENTRACIÓN
N moles de soluto = M
Volumen solución (l)
Ej.: Una solución 1 M (1 molar) de NaCl contiene 1 mol (58,8g) de NaCl por
litro. Un mol de NaCl corresponde a un valor igual al número de Avogadro de
moléculas, que es 6,023 x 1023.
La concentración de iones en solución también se indica en unidades molares,
en este caso el ión es la molécula.
Concentración de Na+ = 1M
Concentración de cloruro = 1 M
Para las moléculas más complejas como MgCl2
3
MgCl2 ------------- Mg+2 + 2 Cl-
Concentración de Mg+2 = 1 M
Concentración de cloruro = 2 M
En general: PE = PM
N
Ácidos y bases: n = N de protones que puede ceder (el ácido) o captar
(la base) por molécula. Compuestos que sufren reacciones redox: n= N de
electrones captados (agente oxidante) o cedidos (agente reductor) por
molécula.
4
5. Porcentaje peso/ peso (%p/p): Peso en gramos de soluto por
100 gramos de solución. La concentración de la mayoría de los
ácidos comerciales viene dada en %p/p. Aquí la proporción de soluto
puede ser mayor que la proporción del solvente. Ej.: H 2SO4 96%.
Para poder transformar %p/p a concentración molar o normal es
necesario conocer la densidad (d) de la solución.
Ejemplo: Calcular la molaridad de HCl comercial del 28%, densidad 1,15 (kg/l).
Primero calculamos cuanto pesa 1 litro de la solución.
Hemos calculado que 1 litro del ácido comercial contiene 8,82 moles de HCl, es
decir, su concentración es 8,82 M.
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
5
Para preparar una solución de un soluto dado se puede usar el soluto puro
(generalmente sólido) o una solución concentrada de él en el mismo solvente
(solución stock). Este último caso constituye una dilución.
V1 x C1 = V2 x C2
V1 = volumen de la solución concentrada
C1 = concentración de la solución concentrada
V2 = volumen de la solución diluida
C2 =concentración de la solución diluida
Nuestro sentido común nos dice que la respuesta será 0,2 M, ya que la solución
se diluyó 10 veces. El cálculo según la relación dada sería:
C2 = V1 x C1 = 10 ml x 2M = 0,2 M
V2 100 ml
PROBLEMAS SOLUCIONES
6
4.- 50 ml de H3PO4 85% p/p, d= 1,71 g/ml se diluyeron a 200 ml con agua.
Calcule la normalidad de la solución.
6.- Ud. dispone de varias soluciones concentradas: NaCl 2M; KCl 0,5 mM;
MgCl2 100 mM y CaCl2 1,3 M. A partir de esto, describa la preparación de 2 l de
una solución que contenga NaCl 120 mM, KCl 35 M, MgCl2 0,03mM y Na2SO4
0,06 M.
pH Y TAMPONES
ACIDOS Y BASES
HA -- H+ + A- (1)
7
Considerando esta reacción en el sentido inverso, la especie a- puede captar
Ejemplos de bases según Bronstedt son los compuestos orgánicos básicos, que
Ácidos fuertes son: HCl, HNO3, HClO4, H2SO4 (ambos protones), H3PO4
(solamente el primer protón que se disocia). Bases fuertes son: NaOH, KOH,
etc. Ácidos y bases débiles: prácticamente todos los ácidos y bases orgánicos
Este ácido débil posee un solo protón ácido. En solución acuosa coexisten en
8
HOAC ---- OAc- + H+ (3)
Ka = OAc H+
HOAc
pKa = - log Ka
Se cumple:
0,1 M de HOAc.
Según la ecuación 3
H+ = OAc = x
HOAc = 0,1 –x
El valor numérico de Ka indica que HOAC estará poco disociado, luego podemos
aproximar:
HOAc = 0,1
Reemplazando en la expresión de Ka
Ka = x2 = 1,78 x 10-5
0,1
x = 1,33 x 10-3 M
9
HOAc = 0,1 M
Kb = BH+
B H+
Ka x Kb = Kw y
ECUACIÓN DE HENDERSON-HASSELBACH
Ka = A- H+
HA
HA
10
débil con un ácido fuerte o una base fuerte de un ácido débil con su sal,
mezclas tampón, etc.
Solución tampón (solución amortiguadora o buffer): Es una solución cuyo pH se
mantiene prácticamente constante cuando se le agregan pequeñas cantidades
de ácido o base. Las soluciones tampón son sistemas formados por un ácido
débil y su base conjugada o por una base débil con su ácido conjugado.
11
Selección de un tampón:
12
[HOAc] = 0,1 - [OAc-] Reemplazando: [OAc-] = 0,708
0,1 - [OAc ]
-
13
PROBLEMAS TAMPONES
14
8. ¿Cuál es la concentración de ácido acético y acetato en un tampón acetato
de concentración 0,1 M y pH 6,0? El Ka para el ácido acético es 1,78 x 10 -5
Resp.: a) 11 b) 11 c) 4,77
Resp.: 5,05
11.¿Cuál es el pH de una solución que contiene NH 4Cl 0,1 M y NH3 0,2 M? pKb
NH3 = 4,6.
Resp.: pH 9,7
13. Calcular el pH de una solución formada cuando a 200 ml de ácido acético 0,5
M se le añaden 100 ml de NaOH 0,1 M. pKa ácido acético = 4,75
Resp.: 3,8
14. Los tampones Tris/HCl se pueden obtener agregando HCl a una solución de
Tris.
Tris = Tris (hidroximetil) aminometano Fórmula estructural: (CH 3OH)3
CNH2 PM: 121,1 Ácido conjugado: Tris H +, pKa = 8,1. Calcule la cantidad en
gramos de Tris y el volumen de HCl 1 M que se requiere para preparar 1 l
de un buffer Tris/HCl 0,2 M, pH 7,5. Resp.: 24,2 g; 160 ml
15
15. Una solución amortiguadora contiene ácido acético 0,1 M y acetato de sodio
0,1 M. Calcular el pH después de la adición de 10 ml de HCl 0,1 N a 90 ml
del amortiguador.
Resp.: 4,65
17. La piridina es una base orgánica que reacciona con los H + para formar
Pyr-H+ Para Pyr-H+: pKa = 5,36. Se desea preparar un tampón de
piridina/HCl de pH 5,5 titulando 50 ml de piridina 0,1 M con HCl 0,1 M.
¿Cuánto HCl se gastará? ¿Cuál será la concentración del tampón?
16
Anexo micropipetas
e
FIGURA 1:
Las micropipetas P-20 y P-200 utilizan Tips amarillos y la P-1000 usa Tips
azules. Cada micropipeta ajustable tiene un rango de trabajo
recomendado, así por ejemplo el rango recomendado para la P-20 es de 2
- 20 (l), para la P-200 es de 20 –200 l y para la P-1000 es de 200 –
1000l. Fuera de estos rangos el error aumenta.
Para pipetear un volumen dado, se debe usar la pipeta más cercana al
volumen deseado. Ej: Para medir 10 microlitros (l), se debe seleccionar la
pipeta P-20 y a continuación girar la perilla de ajuste (b) hasta que aparezcan
los números:
1
Este valor representa 10,0 l, 0
el número subrayado 0
representa los decimales
(e
17
Para el caso de la P-1000 sólo figuran las tres primeras cifras. Ej: 1000 l o
1ml figuran como 100 y la última cifra se estima en la escala graduada.
18
BLOQUE I PROTEÍNAS
INTRODUCCIÓN
para una enzima, la glucoquinasa. Se deseaba estudiar dicha enzima pero por
obtener material suficiente para purificar de allí la enzima. Para obviar este
construcción quedó bajo el comando del promotor tac localizado río arriba del
codón de inicio del gen de fusión. El promotor tac presenta bajos niveles de
cromatografía de afinidad.
despreciable.
19
PRINCIPIOS DE CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
UN LIGANDO ESPECÍFICO ES UNIDO
COVALENTEMENTE A LA RESINA PARA
RESINA PERMITIR LA POSTERIOR SEPARACIÓN DE
LA PROTEÍNA DE INTERÉS. EN ESTE CASO EL
LIGANDO ES EL GLUTATIÓN
MEZCLA DE
PROTEÍNAS EN LA
MUESTRA
UNIÓN DE PROTEÍNA
ESPECÍFICA Y LAVADO DE
PROTEÍNAS UNIDAS
INESPECÍFICAMENTE
ELUCIÓN PROTEÍNA
ESPECÍFICA
promotor
20
SESIÓN 1
Procedimiento
4.- Apartar una alícuota de 20 l para tener el control de proteínas totales del
durante el proceso.
21
8.- Resuspender el pellet en 50l de PBS y adicionar PMSF hasta 0,1 mM final.
Procedimiento
ELUIDO.
cantidad a cargar al gel para cada una de estas muestras. De las fracciones de
22
SESIÓN 2
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
INTRODUCCIÓN:
las muestras que se desean analizar, las cuales pueden ser desde extractos
23
MÉTODO DE BRADFORD
FUNDAMENTO:
465 nm mientras que cuando está unido a proteínas éste se encuentra a 595
MATERIALES:
ácido fosfórico 85% p/v y luego completar a 1000 ml con agua destilada. Dejar
toda vez que presente residuo o que el blanco de reactivo medido contra agua
24
PROCEDIMIENTO:
- Agite bien los tubos, incube durante 10 min. a temperatura ambiente y mida
diluciones previas realizadas a las muestras (en caso necesario) para el cálculo
final de su concentración.
25
SESIÓN 3
PROCEDIMIENTO:
1.- Se monta el sistema de placas de vidrio bien limpias con etanol (secas) con
los espaciadores laterales e inferior de teflón, afirmados con las pinzas. Una
vez que se ha verificado que los espaciadores ajusten sin dejar espacios entre
ellos se prepara la mezcla del gel separador, excepto que no se le agrega el
catalizador TEMED.
3.- Una vez que esto ha ocurrido agregar los 20 l de TEMED al resto de la
mezcla del gel separador, mezcla bien y verter hasta aprox. 2/3 de la altura de
las placas.
4.- Adicionar con suavidad por los extremos superiores isopropanol hasta que
se forme un frente recto en el borde superior del gel. Dejar polimerizar el gel
por aprox. 40 min. Controlar con la mezcla sobrante en el tubo. No mover el gel
hasta que la mezcla en el tubo haya polimerizado.
5.- Una vez que el gel separador polimerizó enjuagar con una pisceta con agua
destilada para remover los restos de acrilamida sin polimerizar. Secar la
superficie con papel filtro y agregar en seguida la mezcla del gel espaciador
introduciendo rápidamente la peineta de 75 mm verificando que no queden
burbujas en los surcos ya que esto alteraría posteriormente la migración de las
muestras. Dejar polimerizar unos 20-30 min.
26
7.- Comenzar el llenado de la cámara teniendo cuidado de que no queden
burbujas atrapadas en el extremo inferior del gel.
27
8.- Llenar la cámara con tampón de manera que los surcos queden llenos.
9.- Conectar los cables a la fuente de poder de manera que las muestras
migren hacia abajo del gel. (Ánodo o polo positivo en el borne inferior)
11.- Desarmar las placas, removiendo primero los espaciadores laterales y luego
hacer palanca con una espátula delgada para separar la placa superior del gel.
12.- Cortar aquella parte del gel que será fijada y teñida, sin incluir el gel
espaciador el cual es removido después de marcar la orientación de las
muestras con un corte en una de las esquinas inferiores del gel separador.
13.- La porción del gel que será teñida se fija primero en una solución de
isopropanol 25%/ ácido acético 10% durante 1 h. La fijación tiene el propósito
de que las proteínas no difundan desde el gel y además de que se remueva el
exceso de SDS previo a la tinción.
14.- El gel se tiñe luego en una solución de azul de Coomasie (ver sección
soluciones) durante 1 hora.
28
las proteínas purificadas en forma experimental. Dicho estándar se entregará
preparado. Todas las muestras se hierven en Baño María (100º C) por 2-4 min.
Luego se centrifugan (Eppendorf) y se cargan al gel en un orden establecido
(VER FIGURA 3)
PREPARACIÓN DE GELES
TRIS BASE 30 g
Glicina 144 g
29
SDS 10 g
MUESTRA CÁTODO
DIRECCIÓN DE
MIGRACIÓN
ÁNODO
FIGURA 3:
30
ANÁLISIS DE WESTERN
Procedimiento:
1.- Luego de marcar el gel (borde inferior), medirlo (cm 2) y de remover el gel
espaciador, se sumerge el gel a transferir en tampón Tris-glicina-metanol (25
mM TRIS-HCl pH 9,4; 192 mM glicina, 20% metanol) durante 30 min a temp.
ambiente.
2.- Se cortan 6 papeles Whatmann 3MM y una membrana de nitrocelulosa de
las dimensiones del gel.
3.- Se sumerge la membrana en H2O destilada por 5 min.
4.- Humectar 2 hojas de papel filtro en tampón ánodo 1 (TRIS-HCl 0,3 M pH
10,4/ metanol 20%) y ponerlas una a una en el centro de la placa de grafito
(ánodo). Remover las burbujas.
5.- Humectar una hoja de papel filtro en tampón ánodo 2.
6.- Colocar la membrana pre-tratada y luego el gel equilibrado.
7.- Colocar una hoja de papel filtro sumergida en tampón cátodo (TRIS-HCl 25
mM pH 9,4/ac. aminocaproico 40 mM y metanol, 20%), sobre el gel y luego los
2 filtros restantes.
8.- Conectar la cámara y aplicar corriente constante ej. 2,5 mA/cm 2 x 45 min
o 0,8 mA/cm2 durante 1 a 2h.
9.- Una vez finalizada la transferencia, secar la membrana y teñir el gel
transferido con azul de Coomasie R (Para chequear la eficacia de la
transferencia).
10.- El secado se puede hacer a 37C x 1h o a temp. amb por más tiempo.
1.- Fijar el gel con agitación en 25% isopropanol/7% ácido acético durante al
menos 1 h.
2.-Teñir también con agitación durante 1 h en la solución de azul Coomasie-R
3.- Para desteñir poner en fuente Pyrex y enjuagar rápidamente con agua
destilada el exceso de colorante y luego llenar el recipiente con agua destilada
y calentar al microondas (máxima potencia) durante 5 min en principio. Se
repite el procedimiento hasta que el fondo esté claro.
31
SESIÓN 4
INMUNODETECCIÓN
Procedimiento:
2.- Luego se incuba con el primer anticuerpo diluido 1:5.000 en el mismo Blotto
y se incuba por al menos 1h.
3.- Realizar 3 lavados cortos con PBS e incubar luego por 1h más con el
segundo anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (anti IgG de conejo
preparada en cabra y conjugado con fosfatasa alcalina dilución 1/2000). La
dilución del segundo anticuerpo se hace en el mismo tampón que el primero.
Bibliografía específica
1.- Concha, M.I. & León, G. (2000) Cloning, functional expresión and partial
characterization of the glucose kinase from Renibacterium salmoninarum.
FEMS Microbiology Letters Vol: 186, 97-101.
32
PAUTA PARA INFORME GLOBAL
33
A
pglk glk
200pb
EcoRI
1 2 3 4 5 6 7
kb
23,1-
9,4-
4,4-
2,3-
2,0-
9,4 –
4,4 –
2,3.-
2,0.-
34
Anexo II: Ejemplificación de la presentación de una Tabla
a b
cepa de E. coli Actividad específica de glucoquinasa
(nmol NADPH min -1 mg-1 proteína)
HB101 66,0
ZSC103 3,8
a
Las cepas de E. coli utilizadas aparece en letras mayúsculas y entre paréntesis, se
indica el plasmidio que contienen. Los genotipos de las cepas de E. coli utilizadas se
indican en Materiales y Métodos.
b
Los valores de actividad específica indicados en la tabla corresponden al promedio
de ensayos realizados por triplicado.
35
36
BLOQUE II ENZIMAS
LA FRUCTOSA 1,6-BISFOSFATASA
INTRODUCCIÓN:
Las enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas específicas,
es decir, hacen aumentar su velocidad. En la Figura 1 se muestra la variación
de la cantidad de producto con el tiempo para una reacción catalizada por una
enzima (cinética de aparición de producto). Como el volumen es constante, la
concentración de producto varía en forma similar.
24 -
20 -
PRODUCTO
(moles) 16 -
12 -
8 -
4 -
0
0 5 10 15 20
TIEMPO (MIN)
FIGURA 1
37
i) Ensayos de tiempo fijo: se detiene la reacción después de un tiempo
determinado y se mide la concentración de producto formado. Ejemplo: el
ensayo de fructosa-1,6-bisfosfatasa que se realizará en el presente práctico.
38
I. Homogeneización y tratamiento a pH 4,5
II. Tratamiento a 55° C, eliminación de las proteínas desnaturadas
III. Fraccionamiento con sulfato de amonio. Se usa el precipitado obtenido
entre 47% y 65% de saturación.
IV. Cromatografía en Sefarosa-azul y elución con AMP 0,2 mM.
39
homogeneidad.
40
V
1/V
-1 / Ka
1 / V máx
[Mg+2 ] 1/ [Mg+2 ]
FIGURA 2 FIGURA 3
41
FBPasa
Es importante hacer notar, que no se ha elegido como ejemplo ilustrativo la
determinación experimental de la Km para el sustrato, Fru-1,6-P 2, pues la alta
afinidad de la enzima (Km < 5 M) hace imposible su determinación usando el
método Fiske y Subbarow (rango de Pi determinable = 0,1-1 mM).
PARTE EXPERIMENTAL
Materiales:
Fructosa bisfosfato 10 mM
MgSO4 50 mM
K2SO4 0,4 M
42
AMP 200 M
SESIÓN 5
Procedimiento:
Enjuague todos los tubos de ensayo con agua destilada antes de su uso, ya
que el fosfato procedente de restos de detergente falsea los resultados.
Elimine los restos de agua lo más posible.
TUBO T0 1 2 3 4 5 6 7
AMP (M) 0 0 0 10 20 30 40 50
Tampón Tris, ml 0,1
FBP 10 mM, ml 0,1
K2SO4 0,4 M, ml 0,2
MgSO4 50 mM, 0,1
ml
AMP 200 M 0
H2O destilada, 0,4
ml
FBPasa, ml 0,1
Con el objetivo de minimizar los efectos del error propio del pipeteo y de
ahorrar tiempo, no pipetee todos los volúmenes indicados en la tabla sino que
prepare un medio común. El medio común debe contener todos los componentes
que se repiten para los 8 tubos (cuidado: no agregue la enzima). Prepare un
pequeño exceso de este medio (volumen para 10 tubos).
43
gradilla.
44
Agregue el molibdato ácido y después la enzima al tubo T 0. Prepare los tubos
para el blanco y el estándar del ensayo de Fiske y Subarow usando
respectivamente 1 ml de agua y 1 ml de la solución estándar y agregue el
molibdato ácido a estos tubos.
Agregue sucesivamente 3,3 ml de agua y 0,2 ml de reactivo de Eiconogen a
todos los tubos. Espere 10 min. Mida A660 nm, calibrando con el blanco.
45
SESIÓN 6
FOSFATASA ALCALINA
Reacción catalizada:
O― PO3 -2
O-
+ H2O + PO4 -3 + 2 H+
NO2 NO2
46
práctico la actividad enzimática (U/ml) de soluciones de fosfatasa alcalina. Los
objetivos del presente práctico son:
PARTE EXPERIMENTAL
Instrumentos y materiales:
Procedimiento:
47
Tiempo inicial de retardo : 0 seg.
48
Retorne al programa de cinética (EXIT)
En el Genesys 5:
Para obtener la tabla de datos, así como para retornar al gráfico se utiliza
“modo de pantalla”.
En el Genesys 2:
Se usa “proceso post” y “función de pantalla” para obtener la “forma
tabular”.
Retorne al programa de cinética posteriormente e imprima (imprima
solamente para el primero de los ensayos de actividad).
En forma similar mida los valores de A/min para las otras 3 soluciones de la
enzima. No es necesario inspeccionar la tabla de datos cada vez.
Informe
49
que por definición es igual al número de unidades de actividad enzimática (U)
presentes en el test.
Considerando el volumen de solución enzimática agregada, calcule su
actividad enzimática (U/ml).
Considerando la concentración de la solución enzimática (mg/ml) calcule la
actividad específica.
50
BLOQUE III ÁCIDOS NUCLEICOS
SESION 7
INTRODUCCIÓN:
Sitio de múltiple
clonamiento
51
FIGURA 2: Detalle del sitio de múltiple clonamiento del pUC19
52
Esto se complementa con la expresión de un segundo gen marcador
en la misma molécula plasmidial, que le otorga un fenotipo
característico a la colonia transformada.
53
Figura 3: Mapa físico de pBluescript SK- y su region de clonamiento múltiple
METODOLOGIA:
54
AISLAMIENTO DEL ADN PLASMIDIAL
PROCEDIMIENTO:
55
11.- SECAR EL SEDIMENTO EN SPEED-VAC POR 5 MINUTOS O A
TEMPERATURA AMBIENTE HASTA QUE ESTE SECO (APROX. 15 MIN).
REACTIVOS
LISOZIMA
50 mg/ml DE LISOZIMA EN AGUA DESTILADA
FILTRAR A TRAVÉS DE FILTRO ESTÉRIL DE 0,45 m Y ALMACENAR EN
ALÍCUOTAS DE 20 l A 70 C.
EL STOCK DE LISOZIMA NO SE PUEDE VOLVER A CONGELAR
TAMPÓN TE pH 8,0
TRIS-HCL 10 mM pH 8,0
EDTA 1 mM pH 8,0
1. Objetivo de la Actividad:
Material:
de otra especie)
56
PBS (phosphate buffered saline): Disolver 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2HPO4;
0,24 g KH2PO4 en 800ml H2O destilado, ajustar a pH 7.4 con HCl, aforar a 1
l y autoclavar.
NaCl 2M
Procedimiento:
segundos.
sobrenadante.
veces.
Referencia:
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning – a
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
57
SESIÓN 8
5’-GAATTC-3
3’-CTTAAG-5’
58
Los extremos de DNA de una molécula digerida por una enzima, pueden
formar apareamiento de bases complementarias (extremos cohesivos) con
otras moléculas de DNA que proporcionan los mismos extremos. Esta
importante observación fue descrita por primera vez por Mertz y Davis (1972)
cuando estudiaban la enzima EcoRI (G/AATTC).
Las digestiones por endonucleasas de restricción están fuertemente
influenciadas por las condiciones de la reacción, ej. pH, concentración de sal,
Mg+2 y temperatura. Desviaciones de las condiciones óptimas de la reacción
podrían cambiar la especificidad del corte o inhibir la actividad enzimática.
5’-GpApApTpTpC-3’ 5’-GOH 3’
3’-CpTpTpApApG- 5’ 3’-CpTpTpApAp-5’
5’-CpTpGpCpApG-3’ 5’-CpTpGpCpAOH 3’
3’-GpApCpGpTpC-5’ 3’-Gp 5’
5’-GpGpCpC-3’ 5’-GpGOH 3’
3’ CpCpGpG-5’ 3’-CpCp 5’
59
MATERIALES:
PROCEDIMIENTO:
1.- Ud. deberá buscar en un catálogo las características de las enzimas que
MEZCLA DE REACCIÓN
menos 1 hora.
60
4.- Luego se centrifuga la muestra y se le agrega solución de carga para
aumentar la densidad de la muestra y evitar que se salga de los pocillos del gel,
frente iónico.
Tanto los ácidos nucleicos como los nucleótidos libres poseen un máximo
medida que la razón es igual o mayor a 1,8, se considera que el nivel de pureza
es aceptable.
siguientes relaciones:
61
Si se conoce la secuencia o la composición y tamaño del ácido nucleico en
Procedimiento:
pequeños migrarán más rápido que los más grandes, y la distancia de migración
62
de la concentración de agarosa del gel. El tamaño de los fragmentos puede por
de tamaño conocido.
con la peineta puesta. Se deja solidificar por 20-30 min y luego se remueven
63
remueve la peineta, se cargan las muestras y el estándar y se corre el gel a 100
Una vez que el colorante ha migrado cerca de 2/3 de la longitud del gel,
(transiluminador).
separar son 500 pb y que 10.000 pb, se utiliza comúnmente como estándar
Construir una tabla con las distancias migradas desde el origen (cm) de cada
64
Nota: El estándar de peso molecular utilizado será el DNA del bacteriófago
digerido con HindIII que genera los siguientes fragmentos: 23,1; 9,4; 6,6; 4,4;
2,3; 2,0; 0,56 y 0,12 kilo pares de bases (kb). El fragmento más pequeño
frecuentemente no es detectado
65
TRANSFERENCIA DE SOUTHERN
INTRODUCCIÓN:
inespecíficos.
montaje solamente.
1.- Sumergir el gel en 500 ml de HCl 0,25 M por 10 min. con agitación suave
(10,4 ml de 37% HCl o 12N). Esta etapa solo se requiere cuando se han
2.- Enjuagar 5 veces con agua destilada desionizada, utilizando aprox. 200 ml
cada vez.
66
4.- Cubrir el gel con solución de neutralización (2 x 15 min.).
TRATAMIENTO DE LA MEMBRANA
1.- Cortar un trozo de papel de nitrocelulosa y dos trozos de papel filtro 3MM
ºC.
rápidamente en hielo.
67
Observación: Las condiciones de hibridación y la estrictez de los lavados
SOLUCIONES
BUFFER DE DENATURACION
1,5 M NaCl (87.66 g)
0,5 M NaOH (20 g)
Completar a 1 l con H2O destilada
BUFFER DE NEUTRALIZACIÓN
1,5 M NaCl (87,66 g)
0,5 M Tris base (60,55 g)
Ajustar a pH 7.5 utilizando HCl conc. y completar a volumen de 1 l Almacenar a
temperatura ambiente.
50X TAE
242 g Tris base
51,1 ml glacial ácido acético
100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0)
Completar a 1 l con agua desionizada y almacenar a temperatura ambiente.
68
Esquema de la Transferencia de Southern
(Southern blot)
SESIÓN 9
INTRODUCCIÓN:
69
SESIÓN 9
70
Posteriormente, el ADN sintetizado se analiza en geles de agarosa
teñido con bromuro de etidio.
71
Mg+2 dependerá de la concentración de dNTP por cuanto estos tienen la
capacidad de unir el ión.
Una de las razones más frecuentes de falla de la reacción de PCR es la
incompleta desnaturación del ADN templado. Normalmente se utiliza 95 oC por
30 segundos o 97 oC por 15 segundos, sin embargo esto dependerá de la
composición nucleotídica del ADN y será necesario aumentarla en casos de
amplificar secuencias ricas en guanina-citosina (GC). La desnaturación
incompleta conduce al re-apareamiento del ADN reduciendo la concentración
del templado en la reacción. Por otra parte, tiempos de desnaturación muy
prolongados afectan la actividad de la enzima. La vida media de la Taq ADN
polimerasa es superior a 40 minutos 95 oC.
Finalmente, es indispensable incluir en los ensayos el control de la
reacción. Para esto, se realizan reacciones en paralelo en que no se incluye el
ADN templado o se puede hacer utilizando un templado que carece de la
secuencia blanco.
MATERIALES:
3. Termociclador
REACTIVOS UTILIZADOS
ADN templado
Tampón de la enzima 10 x
Vaselina estéril
72
TODA LA MANIPULACIÓN DE REACTIVOS SE HACE CON GUANTES
CUIDANDO DE NO CONTAMINARLOS
PROCEDIMIENTO:
c) Preparar un “mix” por mesón que contenga todos los reactivos menos el
ADN templado y la vaselina. Los volúmenes de los reactivos a utilizar
para cada reacción le serán entregados por los profesores. Uds.
deberán calcular las cantidades requeridas para n+1 tubos (siendo n =
al número de alumnos del mesón).
El programa siempre parte con una etapa inicial de calentamiento del ADN
templado a 94 ºC durante 2 a 5 minutos para desnaturarlo y eliminar
posibles DNasas y proteasas que inactivan al ADN y a la polimerasa,
respectivamente.
73
Para analizar el producto de amplificación por electroforesis en geles de
agarosa se tomará una alícuota de la reacción (ej: 15 l, cuidando de no
remover la vaselina). Para ello se presiona el émbolo de la micropipeta hasta la
primera posición, se sumerge el tip hasta el fondo del tubo y se succiona
lentamente el volumen soltando la presión del émbolo gradualmente. Finalmente
se limpia el tip por fuera para eliminar la vaselina que quedó por fuera. Se
agrega el tampón de muestra 6x TAE (3 l) y se aplica al gel. El gel se prepara
al 1% agarosa en tampón TAE tal como se detalla en la página 60.
NOTA: Puesto que esta técnica es extremadamente sensible, el mayor
inconveniente que esto acarrea es la alta posibilidad de una contaminación del
material con el que se trabaja. Ello se reflejaría eventualmente en que los
controles negativos den positivos. Es por ello que es vital trabajar con el
máximo cuidado evitando cualquier posibilidad de contaminación con ADN. Por
este motivo, previo a la reacción de amplificación, se irradia todo el material
plástico estéril (pipetas, puntas, tubos, guantes) con lámpara germicida UV
durante 20-30 min.
5’•••―――――――――――――――••• 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ •••―――――――――――――――••• 5’
72 C
5’•••―――――――――――――――••• 3’
5’
74
EL INFORME GRUPAL SE CONFECCIONARÁ UTILIZANDO LA MISMA
PAUTA INDICADA AL FINAL DEL BLOQUE I.
BIBLIOGRAFIA
CUESTIONARIO
Extracción de DNA
75
7. ¿Cuántas bandas espera observar en el gel para el ADN plasmidial digerido
y sin digerir? (Asuma que la enzima de restricción cortará en un sitio único)
Explique.
Enzimas de restricción
TAREA:
76
Problemas PCR
14. Calcule la Tm de los partidores universales T3 y T7 presentes en el ADN
plasmidial que Ud. utilizará en el práctico.
MCG/AMZ
77