Roteiro das atividades laboratoriais

Meio de Cultura YPD 20 ml

1% de Extrato de levedura 0,2 g Extrato de levedura
2% de Peptona 0,4 g Peptona
2% de Glicose 0,4 g Glicose
1. Pesar o material acima e reservar;
2. Em um Erlenmeyer de 50ml, adicionar metade do volume total de água
destilada;
3. Adicionar os materiais acima e agitar até dissolver;
4. Completar com água destilada até o volume total;
5. Agitar até a dissolução completa;
6. Autoclavar por 15 minutos;
7. Deixar esfriar em ambiente estéril;

Repique em Meio Caldo

1. Em fluxo laminar pipetar 50 µl de Candida preservada em -80ºC (80% Meio
YPD + 20% Glicerol 80%) no meio estéril.
2. Agitar suavemente para homogeneização do repique.

Cultivo
1. Em estufa com agitação horizontal, deixar agitando em temperatura de 36ºC por
48 horas, com agitação branda.

Extração para Maldi-TOF

I) Lavagem:
1. Pipetar 1ml do meio de cultivo e colocar em tubo para centrifuga
2. Centrifugar por 3 minutos a 10.000 rpm
3. Retirar o sobrenadante;
4. Adicionar 1ml de água destilada
5. Homogeneizar em vortex por aproximadamente 1 minuto
6. Repetir os passos 2, 3, 4 e 5 por 3x.
7. Descartar o sobrenadante

II) Extração
1. Adicionar 300 µl de água destilada e 900 µl de etanol
2. Homogeneizar em vórtex
3. Centrifugar por 2 minutos a 13000 rpm
4. Descartar sobrenadante
5. Secar o precipitado por no mínimo 10 minutos (amostra deve estar bem seca)
6. Adicionar 50 µl de ácido fórmico 70%
7. Homogeneizar manualmente
8. Incubar por 5 minutos
9. Adicionar 50 µl de acetonitrila
10. Homogeneizar manualmente
11. Centrifugar 2 minutos a 13000 rpm
12. Separa o precipitado do sobrenadante

III) Aplicação na placa MALDI-TOF

1. Em uma placa limpa aplicar 1 µl do sobrenadante em um pocinho
2. Repetir o passo 1, 3x.
3. Esperar secar
4. Aplicar 1 µl de matriz α-ciano (HCCA – Ácido α-Ciano-4-Hidroxi-Cinâmico)
5. Esperar secar

IV) Leitura no MALDI-TOF.

V) Desafio:
1. Cada estudante deverá identificar 3 isolados de microrganismos diferentes
através da técnica de Identificação de microrganismos por MALDI-TOF.