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Práctica 2.-Estudio de la mitosis en células de raíz de cebolla: Tinción con fucsina ácida y/o orceína
Practica 6.- Búsqueda de información en libros o revistas científicas o de divulgación de los siguientes temas
• Clonación en animales
• Estereomicroscopios
• De fluorescencia
M. Compuesto: • De campo oscuro
• Microscopia por luz reflejada
• De luz ultravioleta
• De contraste de fases
• De polarización
MICROSCOPIO COMPUESTO
A diferencia del simple, en este tipo de microscopios se combinan dos lentes o sistemas de lentes
convergentes de amplificación de imagen, colocados en los extremos del tubo el denominado
objetivo, situado más cerca del objeto a observar; y el ocular más cercano al ojo del observador.
Antes de pasar a hablar de los diferentes tipos de microscopios compuestos consideramos
importante hacer referencia a los cabezales monoculares, binoculares y triloculares, en orden de
menor a mayor especialización en este tipo de técnica. El cabezal monocular consta de un solo
ocular, llevando consigo el inconveniente de producir la fatiga visual en observaciones prolongadas.
Este problema se solventó con la aparición del cabezal binocular, el cual permite la visión con los dos
ojos, siendo importante alcanzar una adecuada fusión de la imagen. El cabezal trilocular además de
poseer las ventajas del anterior posibilita fotografiar el objeto de estudio.
Pié: Pieza maciza y pesada para asegurar la estabilidad del aparato y para soportar las demás piezas que
componen al microscopio; en ocasiones está provisto por una charnela, que permite la inclinación de
la parte superior del microscopio.
Platina: Pieza metálica redonda o cuadrada, donde se colocan las preparaciones; tiene en el centro una
abertura circular por la que pasarán los rayos luminosos procedentes del sistema de iluminación.
Puede estar adosada a un carro con dos tornillos de cremallera que permitan movimientos de
traslación y si los tornillos están graduados, para medir desplazamientos La preparación se sujeta en
las platinas fijas, con dos palanquitas móviles. En las patinas con carro, se fija por un reborde
Tubo óptico: En él está instalado el sistema óptico. Está constituido por dos cuerpos. Uno el externo en el
que se encuentra la cremallera y otro interno adosado al anterior donde se encuentra el objetivo. El
tubo se mueve verticalmente para poder enfocar el objetivo, con movimiento rápido mediante el
macrométrico y movimiento lento mediante el micrométrico.
Objetivos: Están formados por varias lentes para corregir aberraciones, deben tratarse con mucho cuidado,
un golpe puede variar la posición de las lentes y averiarlas, se atornillan al revólver del portaobjetos
Objetivos en seco: Entre la lente y el objetivo sólo hay aire. Poseen gran profundidad de foco, lo
que permite observar diferentes planos paralelos del objeto
Objetivos de inmersión: Debe interponerse entre la lente frontal y la preparación un líquido
cuyo índice de refracción sea superior al aire (aceite de cedro) lo que permite una mayor
luminosidad, son objetivos de gran aumento y gran poder de definición (Bacteriología)
Oculares: Los forman dos lentes separadas por un diafragma y van montados en la extremidad superior del
tubo
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO.
El microscopio electrónico ha revolucionado el conocimiento de la biología o la medicina. Tiene la ventaja de
alcanzar una extraordinaria amplificación. Puede dar un poder de resolución hasta mil veces mayor que el
óptico debido a que emplea un haz de electrones en lugar de un haz de fotones.
Existen dos tipos principales de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de barrido y el de
transmisión
DE BARRIDO
En el microscopio electrónico de barrido (MLB) o microscopia de exploración electrónica (SEM), los
electrones inciden desde arriba sobre la preparación por ello la muestra puede ser de cualquier grosor o
tamaño.
Emplea dos técnicas preparatorias:
Secado por congelación.
Secado por punto crítico. Después se cubre la muestra con una capa de metal (oro o
platino).
DE TRANSMISIÓN
En este tipo de microscopia electrónica, el haz de electrones atraviesa al material que se desea observar.
El modo de operar de este tipo de microscopio es similar al del microscopio óptico, ya que está basado en
el hecho de que la manera de actuar de un campo electromagnético sobre un haz de electrones es análoga
a la acción de la lente de cristal sobre el haz de fotones. La imagen, sin embargo, se forma sobre una
pantalla fluorescente como lo haría en una pantalla de televisor.
El haz de electrones pasa a través de la muestra estudiada y posteriormente, a través de unas lentes
electromagnéticas que dan lugar a una imagen amplificada. Esta imagen pasa a su vez por una lente
proyectora hasta una pantalla de material fluorescente, que brilla al recibir el impacto de los electrones.
Debajo de la pantalla se sitúa la cámara para fotografiar la imagen
No obstante, al igual que en el microscopio óptico, el microscopio electrónico de transmisión tiene la
limitación de ser útil sólo para un grosor determinado del objeto. Las películas de muestra, además de ser
delgadas, no deben poseer materiales que puedan dispersar o absorber electrones, deben ser lo
suficientemente fuertes como para poderlas manipular, y lo bastante estables, como para no volatilizarse,
a causa del bombardeo en el vacío.
El interior del microscopio debe hallarse en vacío, ya que el aire impide la movilidad de tos electrones. Esto
se efectúa mediante las bombas de vacío. Estas condiciones imposibilitan la observación de
microorganismos vivos, y de sus procesos fisiológicos. Las técnicas que más se utilizan para este tipo de
microscopio electrónico son: tinción negativa, microtomía y congelación.
PREPARACIÓN DEL OBJETO DE ESTUDIO PARA MICROSCOPIA ÓPTICA
La preparación del objeto de estudio puede resultar un proceso simple o. por el contrario, ser bastante
complejo, dependiendo de la naturaleza y características de aquello que queremos observar.
La preparación de una muestra para estudiarla al microscopio óptico es diferente según la naturaleza del
material que ha de ser observado: orgánico o inorgánico. Si es orgánico, según queramos observar
propiedades que sólo se manifiestan en estado vivo, o si queremos observar morfología y estructuras,
que no se modifican cuando sobreviene la muerte celular.
- Preparaciones húmedas
Para observar organismos acuáticos microscópicos (algas, larvas, etc.). Se pone una gota del líquido que
los contiene sobre el portaobjetos y se pone el cubreobjetos con cuidado para que no aparezcan burbujas de
aire
- Gota pendiente:
Se utilizan portaobjetos excavados sobre los que se pone el cubreobjetos, que lleva adherido la gota del
líquido que ha de ser observado. Así podemos observar el movimiento de los microorganismos en el medio
líquido, sin que estén sometidos a la presión entre portaobjetos y cubreobjetos.
Esta técnica presenta varios problemas que hay que tener en cuenta:
1. La gota constituye una lente trémula que desvía los rayos de luz e interfiere con la iluminación, esto
resulta muy molesto cuando se emplea microscopio de contraste de fases.
2. Los portaobjetos excavados actúan como una lente divergente que puede modificar la realidad de lo
que se está observando.
b) Coloración vital.
Permite poner de relieve detalles estructurales sin matar al organismo. En general no tiñen, sino que
se acumulan en determinadas zonas de la célula. Como todo colorante es una sustancia tóxica; por lo que
hay que emplear bajas concentraciones. Como colorantes vitales se utilizan el azul de metileno, el
rojo congo, el verde Janus.
La coloración en vivo se puede hacer de dos maneras:
1. Por difusión: en el espacio entre portaobjetos y cubreobjetos de una preparación en fresco, se
pone una gota de colorante que penetra en la muestra por capilaridad.
2. Mezclando una gota de colorante con el material que ha de ser examinado en el portaobjetos y
colocando luego el cubreobjetos.
I. Fijación:
Mecanismo que consiste en matar a la célula lo más rápidamente posible, para permitir que se
mantengan las propiedades fisiológicas y morfológicas del organismo vivo. Los fijadores solidifican el
coloide protoplasmático mediante coagulación o precipitación, convirtiéndolo en un gel insoluble. La
fijación evita que el tejido se pudra y se desintegre, produciendo puentes entre proteínas y diferentes
materiales de los tejidos. 24 horas después se procederá a la inclusión.
Hay diferentes tipos de fijadores:
- Físicos: calor (húmedo o seco), frío (congelación rápida).
- Químicos: según la base fijadora: alcohol metílico, dicromato de potasio, formol 10% tamponado,
etc. La muestra que va a ser fijada no debe tener más de tres milímetros de espesor, porque, de
lo contrario, el fijador, que penetra por difusión no actuaría por igual en todas las células de la muestra.
Además, el líquido fijador debe exceder en 50:1 al de la muestra. Hay que tener en cuenta que los líquidos
fijadores son volátiles y que el recipiente donde se vaya a dar la fijación debe ser cerrado. Existe un
tiempo adecuado de fijación, que no debe excederse; una vez concluido, se lava la muestra para quitar el
exceso de fijador.
Además de mantener las propiedades del objeto de estudio, los fijadores, dependiendo de los casos,
pueden servir para endurecerlo o ablandarlo, o aumentar su afinidad tintorial.
II. Inclusión
Para poder cortar la pieza ésta debe tener una cierta consistencia. Para endurecerla, la incluimos en un
material que llegue a todas las estructuras celulares. Esta debe ser una sustancia con plasticidad como la
parafina., el colodión o la gelatina. La inclusión nos permite conservar la muestra durante largo tiempo. Lo
más corriente es utilizar la parafina:
a) Deshidratación: proceso necesario para que, a pesar de la insolubilidad de la parafina, ésta pueda
impregnar la pieza. Consiste en hacer pasar la muestra por una gradación creciente de alcoholes.
b) Aclaración: se baña la pieza tres veces durante unos 30-40 minutos en un disolvente de la parafina,
como el xilol, el benzol o el toluol.
c) Impregnación en parafina: Para evaporar el disolvente de la parafina y que ésta pueda penetrar en
la pieza, se la incluye en parafina fundida dos veces durante 5 horas cada vez. Para que la parafina esté
fundida debemos tenerla 24 horas a 56-60°C
d) Inclusión definitiva: La pieza se mete en parafina fundida depositada en moldes, normalmente
en 'casquetes" de parafina, para que al enfriarse podamos obtener bloques de parafina que incluyen la
pieza.
II Corte
La obtención de cortes para estudios microscópicos se realiza mediante unos aparatos llamados. Hay de
diferentes tipos que se eligen dependiendo de la textura del material que se ha de estudiar. Para
cortes de células vegetales de un órgano duro se utiliza el micrótomo de mano o de Ranvier. Para el resto
de órganos vegetales y para órganos animales se utiliza el micrótomo de rotación o de Monot, o el de
deslizamiento
Se pueden obtener diferentes grosores de corte. Finos de 5-10 μm de grosor. Los cortes de 0.5-5 μm de
grosor se realizan a partir de material incluido en plástico y no en parafina
Los cortes obtenidos se planchan en la superficie de un baño María a 45°C con un 55 de gelatina, y se
presentan con el portaobjetos
También se pueden realizar cortes a partir de material no incluido en parafina mediante congelación. Es
muy rápida, sólo permite cortes de 60-80 μm de grosor
Los cortes una vez obtenidos se tiñen para evitar que se sequen
IV Tinción
Para teñir los cortes no deben tener parafina porque no penetraría el colorante. La parafina se elimina
sumergiendo los cortes 15 minutos en xilol. Se elimina el xilol haciéndolos pasar por alcohol absoluto,
alcohol de 90°, alcohol de 70° y agua destilada. Una vez eliminada la parafina, se procede a la tinción.
Hay muchos tipos de tinciones:
a) según su origen
-Naturales: proceden de animales o vegetales: eosina, carmín de cochinilla, etc.
-Artificiales: proceden del carbón mineral. Son los que más se utilizan.
b) Según su naturaleza:
-Ácidos: tiñen lo básico. Ejemplo: eosina
-Básicos: tiñen lo ácido. Ejemplo: azul de metileno.
-Neutros: tanto la parte aniónica como la catiónica son colorantes. Existen dos tipos de técnicas de
coloración:
-Vitales o en vivo: el colorante no provoca la muerte celular. Ejemplos: azul de metileno, rojo neutro.
-Supravitales: los colorantes se aplican cuando el material ya ha muerto a causa de la fijación.
Hay tinciones que son bastante rutinarias y frecuentes, como la hematoxilina eosina en animal. El
green-safranina en vegetal o el Gram para bacterias.
Una vez teñidos los cortes, se deshidratan para quitarles el agua y que ésta no produzca cambios en la
refringencia. Para ello se pasan los cortes por alcohol de gradación creciente, hasta acabar en alcohol
puro. Después se aclaran con dos baños de xilol.
V. Montaje:
o -Gota pendiente: ya explicado anteriormente. Se untan los bordes del cubreobjetos con
vaselina para conseguir adherencia y que no se seque la muestra, si se va a observar durante
más de una hora.
o Extensión o frotis: Se extiende la gota sobre el portaobjetos con ayuda de otro portaobjetos,
muy rápidamente para que no se dé coagulación. El líquido extendido se fija, colorea y monta de
manera normal. Se suele utilizar en el estudio de sangre y de bacterias.
Tradicionalmente se ha venido utilizando el bálsamo de Canadá, que actualmente ha sido sustituido por
resinas sintéticas, como el Eulcitt.
Gracias al medio de montaje, la preparación se conservará durante mucho tiempo. Una vez añadida la
gota de medio de montaje. Se cubre con el cubreobjetos y se espera a su secado.
VI Etiquetaje:
Las preparaciones deben etiquetarse, si es que se quieren conservar o se van a utilizar posteriormente. En
la etiqueta se pone el nombre del material, la técnica utilizada y la fecha de realización.
1. Vaso de precipitado.
2. Vidrio de reloj.
3. Espátula.
4. Abrazadera.
5. Gradilla para tubos de ensayo.
6. Probeta.
7. Bureta.
8. Pie o soporte de hierro.
9. Mechero Bunsen.
10. Tubo de ensayo.
11. Trípode.
12. Mortero.
13. Matraz de fondo curvo.
14. Embudo de filtro.
15. Matraz cónico o Erlenmeyer.
16. Varilla de agitación.
17. Rejilla.
18. Matraz de fondo piano.
19. Termómetro.
20. Embudo de separación.
21. Pipeta.
22. Capsula de porcelana.
23. Escobilla.
24. Cuentagotas.
2
Determinación y observación de principios inmediatos en alimentos
Azúcares reductores (tinción con reactivo de Fehling),
Almidón (tinción con Lugol)
Lípidos (tinción con Sudán II
Proteínas (reacción de Biuret)
Objetivos:
∙ Identificación de principios inmediatos mediante ensayos simples de laboratorio
Solución A Solución B
② Tomamos 2 cc de cada una de las sustancias a investigar (glucosa, sacarosa y almidón) y las depositamos en
tres tubos de ensayo, que marcamos y colocamos en la parte inferior de la gradilla. Las utilizaremos para
comprobar su carácter reductor frente al licor de Fehling
③ Tomamos 2 cc de cada una de las sustancias a investigar (glucosa, sacarosa y almidón) y las depositamos en
tres tubos de ensayo, que marcamos y colocamos en la parte superior de la gradilla
④ A continuación se agrega 2 cc de líquido Fehling a cada una de las disoluciones de glucosa, sacarosa y almidón,
de la parte inferior de la gradilla. Las disoluciones adoptarán entonces un color azul intenso.
⑤ Se calientan suavemente los tubos de ensayo en la llama del mechero (procura que no entre en ebullición
pues el líquido saldría proyectado y podría quemar al que lo maneja y acompañantes).
a. Si el azúcar es reductor al cabo de unos instantes aparecerá un precipitado de óxido de cobre (I) de color
rojo ladrillo.
b. Los azúcares no reductores como la sacarosa y los polisacáridos (como el almidón) no dan positiva la
reacción de Fehling.
Fundamento
• En ausencia de sustancias reductoras, el hidróxido de cobre (I) de color azul se transforma en óxido de
cobre (II) de color negro
• En presencia de un agente reductor como es el caso de un monosacárido o disacárido que tiene un
grupo carbonilo. El hidróxido de cobre (II) pasa a hidróxido de cobre (I).El hidróxido de cobre (I), pierde
una molécula de agua y origina el óxido de cobre (I) de color rojo ladrillo
⑥: A los dos tubos de ensayo que contienen sustancias que no han reducido el reactivo de Fehling, añadir 1 cc de
HCl al 10% para efectuar la hidrólisis de los enlaces glucosídicos
⑧ Añadir hidróxido de sodio al 20% hasta que el medio se vuelva básico (se comprueba mediante el papel
indicador)
② Coloca 2 ml de aceite en un tubo de ensayo y añade 2 ml de agua. Apreciarás que ambos líquidos no se
mezclan, se producen dos fases: una superior de aceite y otra inferior de agua
③Añade unas gotas de Sudan III, agita y espera unos minutos. Observarás que la fase superior, el aceite,
aparece teñida de rojo mientras que la inferior permanece incolora
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1.3: Reconocimiento de Proteínas Reacción de Biuret
Tubos de ensayo
NaOH al 10%
Cu SO4
El resultado se debe a una reacción típica de los enlaces peptídicos, en la cual los átomos de Cu se unen a
los grupos amino, lo que provoca la coloración rosa‐violácea
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∙ Adquirir experiencia en la utilización de técnicas de procesamiento de tejidos para su estudio con microscopía óptica
Procedimiento
Para observar la mitosis en células vegetales se utilizan tejidos meristemáticos, en los que las células se
multiplican constantemente, por lo que será fácil "sorprender" algunas células en distintas fases
mitóticas.
Observación de la mitosis en el ápice de la raíz cebolla o de otros vegetales con bulbo.
Como material biológico, en la práctica se describe el procedimiento a partir de raicillas de cebolla, pero
también se podrían utilizar las raíces obtenidas a partir de otros bulbos (ajos, puerros, jacintos, tulipanes,
etcétera).
Para conseguir raíces en crecimiento, se coloca el bulbo de cebolla (al que previamente se habrán eliminado
las raíces secas) sobre un vaso de precipitados (si es necesario se sujeta mediante unos palillos). Se llena
el vaso con agua hasta que toque superficialmente la zona donde van a crecer las raicillas. Al cabo de 2 o 3
días empezarán a crecer las raíces.
① Elige una raíz joven (de unos 2 cm.), lávala con agua y corta la punta a 5 mm del extremo.
② Coloca la punta de la raíz en un vidrio de reloj. Para ablandar los tejidos e iniciar la tinción, se cubre la raíz
con orceína acética y clorhídrico 1 N en la proporción de 9:1, es decir, 9 gotas de orceína por cada gota de HCl.
(Orceína A)
③ La hidrólisis debe hacerse en caliente, a unos 60 °C. Para ello, calienta el vidrio de reloj a la llama del
mechero, justo hasta que empiecen a desprenderse tenues vapores, teniendo mucho cuidado de que no
hierva (al retirar el vidrio no debe quemar la mano).
Retíralo para que se enfríe durante 8 minutos y repite esta operación 3 veces, añadiendo más orceína si hiciera
falta, de modo que el líquido cubra en todo momento la punta de la raíz.¾5. Saca la raicilla con la aguja
enmangada y colócala sobre el portaobjetos.
④Con la cuchilla corta el ápice a unos 2 mm. El resto se descarta ya que las células meristemáticas se
encuentran en el extremo, bajo la cofia.
⑤ Añade una gota de ácido acético al 45% (orceína B) para terminar de ablandar los tejidos.
• Conocer el manejo del microscopio óptico para la observación de bacterias (importancia del objetivo de
inmersión)
• Conocer y manejar las unidades de medida de las células y establecer comparaciones entre tamaños de
procariotas y de eucariotas
MATERIALES
• Microscopio
• Aceite de inmersión
• Cubeta de tinciones
• Frasco lavador
• Safranina al 0,5%
• Cristal violeta al 1%
• Solución diluida de yodo (lugol)
• Alcohol‐acetona 1:1 o alcohol 95
TÉCNICA
①Preparar los frotis bacterianos.
⑥Decolorar con alcohol‐acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparación deje de perder
color (30 seg.)
⑩ Secar la preparación.
FUNDAMENTO
Esta tinción fue desarrollada empíricamente por Christian Gram en 1884.
A pesar del tiempo transcurrido, la tinción apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se
realiza para cualquier identificación bacteriana.
Jose Seijo Ramil PRÁCTICAS 8
La técnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: Gram positivas (G+) y Gram
negativas (G‐).
La tinción de Gram requiere cuatro soluciones:
1: Primer colorante: E s un colorante básico que en contacto con las células cargadas
negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El más utilizado es el cristal violeta.
2: Solución mordiente: Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Los mordientes
empleados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases, como por ejemplo el Lugol.
4: Colorante de contraste: Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, como por
ejemplo la safranina o la fucsina.
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Los dos grupos bacterianos que distingue esta técnica difieren en el color con el que finalmente
adquieren. Las bacterias Gram + se teñirán de azul por el cristal violeta y no perderán esta coloración
durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram‐ perderán la coloración inicial del cristal violeta en los
siguientes pasos y se teñirán de rosa debido a la safranina.
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La diferencia está determinada por la composición de su envoltura celular. Las Gram + poseen una malla de
peptidoglicano en su parte más externa, mientras que las Gram‐, recubriendo una fina capa de
peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la célula.
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Una de las precauciones al realizar esta tinción es la de trabajar con cultivos en fase exponencial. De lo
contrario se pueden obtener resultados falsos. P.ej. las bacterias Gram + en fase estacionaria pueden
aparecer como Gram‐.
② Bate bien y filtra el líquido obtenido (sirve un colador metálico de los que tiene en casa)
⑤ Añade 50 ml de alcohol muy cuidadosamente, haciéndolo resbalar por las paredes del vaso para que no se
mezcle con el filtrado y forme una capa sobre él separada por densidad
⑥Deja reposar durante unos minutos. Se verá que va subiendo y se va mezclando con el alcohol una maraña
de hilos blancos que corresponde al ADN de los guisantes.
⑦Con un objetivo de máximo aumento observa un fragmento de esos hilos. El DNA debe verse como unos
hilos delgados y separados
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La solución de lavavajillas y la sal más la acción de la batidora es capaz de romper la pared celular y las
membranas plasmática y nuclear. El líquido limpialentillas contribuye a eliminar las proteínas que puedan
contaminar al ADN. El alcohol separa el ADN que es soluble en agua.
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En Internet
http://www.biostudio.com/case_freeman_protein_synthesis.html
http://www.dnaftb.org/dnaftb/22/concept/index.html
• Con ayuda de una tabla con el código genético, establecer los pasos que conducirán a la síntesis de un
determinado péptido. ¿Qué efecto tendría la inserción, la sustitución y una deleción de un nucleótido en la
cadena del ADN que se transcribe?
• Con ayuda de una tabla con el código genético, escribir todas las secuencias posibles de ADN que codifiquen
para a síntesis de un determinado polipéptido. ¿Por qué pueden existir varias secuencias?
• ¿El número de ARN transferentes es igual, mayor o menor que 20? Justificar la respuesta.
• Enumera los compuestos y estructuras que intervienen en la síntesis proteica, indicando el papel de cada
uno en el proceso. ¿Qué se forma al final?
Objetivos:
• Facilitar la comprensión de la configuración espacial de éstas moléculas
http://www.bioxeo.com http://www.ehu.es/biomoleculas/AN/an4.htm
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• ¿Por qué o almidón, a celulosa y el glucógeno son polisacáridos diferentes se todos están formados por
moléculas de D-glucopiranosa?
• ¿Qué diferencias existen a nivel de la estructura molecular entre un lípido saponificable y otro que no lo es?
¿Qué diferencias tridimensionales existen entre los ácidos grasos saturados e insaturados con el mismo
número de átomos de carbono?
• ¿Qué diferencias hay entre as alfa-hélices y las láminas plegadas de la estructura secundaria de las
proteínas? ¿A qué se deben las distintas estructuras de las proteínas?
• ¿Hacia dónde quedan dirigidos los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas en la estructura
secundaria del ADN? ¿Qué moléculas forman el esqueleto del ADN y cuáles las cadenas laterales?
• ¿Qué ventajas supone para la uniformidad y estabilidad de las dos cadenas del ADN que siempre se unan
una base púrica con otra pirimidínica? ¿Causaría algún problema a unión entre dos bases púricas o entre dos
pirimidínicas?