ACTIVIDAD HIPOGLICEMIANTE O ANTIDIABÉTICA

DETERMINACIÓN DE NIVELES PLASMÁTICOS DE GLUCOSA E INSULINA. MÉTODO ENZIMÁTICO.

Introducción.

Un protocolo completo para estudiar el efecto hipoglicemiante del extracto de una planta debe
incluir las siguientes pruebas:

a) Determinación de los niveles plasmáticos de glucosa, en animales normoglicémicos.

b) Determinación de los niveles plasmáticos de glucosa, en animales experimentalmente
diabéticos.
c) Determinación de los niveles plasmáticos de insulina, en ratones normoglicémicos e
hiperglicémicos.
d) Prueba de tolerancia oral a la glucosa.

Todas estas pruebas, con excepción de la prueba d) pueden hacerse en ratones o en conejos o en
ambas especies. El peso de los ratones debe estar entre los 18 a 20 gramos, en tanto que los conejos
deben tener un peso de 2,5 a 3 kilos aproximadamente.

Protocolo Experimental

Determinación de los niveles plasmáticos de glucosa, en animales normoglicémicos.

Animales y Materiales

 Ratones suizos albinos y machos (Grupos de 10 por cada dosis)

 Conejos machos (Grupos de 5 por cada dosis)
 Jeringuillas (1ml)
 Capilares de microhematocrito heparinizados
 Microcentrífuga para hematocrito
 Colorímetro
 Reactivos para la determinación de glucosa
 Extracto de la planta
 Cánula para administración oral (para ratones)
 Sonda para administración oral y mordida (para conejos)

Descripción de la técnica

Los animales deben ser llevados al laboratorio con tres días de anticipación, mantenerlos con
temperatura controlada y con libre acceso al agua y alimentos.
Doce horas antes del experimento son retirados, permitiendo al animal agua ad libitum.
(ad libitum: es una expresión del latín que significa literalmente 'a placer, a voluntad' y quiere
decir “como guste”)
Antes de proceder a la administración del extracto y del agua destilada, tomar una muestra de
sangre con microcapilares por medio de la técnica de la punción del seno orbital (si se usan ratones)
o de la vena marginal de la oreja (si se usan conejos). Determinar los niveles de glicemia (tiempo
cero).
Técnica de la punción del seno venoso orbitario
• El animal es anestesiado mediante el PNT xx comprobando que existe un plano profundo de la
misma antes de comenzar el procedimiento. (Falta de reflejos al pinchar la almohadilla plantar,
relajación y respiración regular)
• El animal se dispone en decúbito prono con la cabeza hacia el operador.
• Utilizar el índice y pulgar para retraer la piel de la cara y protuir el globo ocular.
• Insertar un capilar de microhematocrito heparinizado por la parte superior del globo ocular en
dirección medial hasta romper el seno orbitario
• Repetir el llenado de más capilares hasta que sea dificultoso llenarlos para continuar con el otro
seno orbitario.
• Eutanasiar al animal cuando se complete la extracción de sangre

Técnica de la punción de la vena marginal de la oreja:

https://dokumen.tips/documents/venopuncion-y-cateterizacion-de-vena-marginal-de-la-oreja-en-
conejos.html

Seguidamente se administra la primera de cuatro dosis del extracto (tomando como punto de
referencia la dosis del screening hipocrático primario), por medio de la cánula para administración
oral a diez ratones o por medio de sonda y mordida a cinco conejos. Un grupo adicional de ratones
o de conejos reciben agua destilada por la misma vía.
Se toman muestras adicionales de sangre 1, 2, 4 y 24 horas después de la administración de los
tratamientos.
Las muestras de sangre se analizan para determinar los niveles de glucosa por cualquier método
enzimático.
Repetir el procedimiento para las dosis restantes.

PAPER
En un estudio realizado en el 2014 de los EFECTOS DE LA Senna reticulata EN LA GLICEMIA DE
RATONES NORMOGLICÉMICOS E HIPERGLICÉMICOS REALIZADO POR Isaza Gustavo y colaboradores
para la determinación de los niveles de glucosa en la sangre SE Se usaron ratones de ambos sexos
provenientes del bioterio de la Universidad de Caldas de la cepa CIAT con un peso promedio de 37
gramos y 3 meses de edad; recibieron alimento especial para roedores y agua ad libitum, con una
luminosidad de 12 horas día y una temperatura promedio de 18 °C. Se tomaron 30 animales de
ambos sexos y se distribuyeron aleatoriamente en tres grupos de 10 animales cada uno. Al grupo 1
se le administró agua destilada. El grupo 2 recibió glibenclamida a una dosis de 5 mg/kg y el grupo
3 el extracto a una dosis de 500 mg/kg. Todas las sustancias se administraron por vía oral,
previamente disueltas en agua destilada. Para la determinación de glucosa en la sangre Las muestras
de sangre se obtuvieron de la cola y la glucosa se determinó mediante el sistema de tirillas reactivas
para análisis de glucosa en sangre capilar, con un glucómetro

Determinación de los niveles de glucosa en animales experimentalmente diabéticos.

Animales y Materiales

 Ratones suizos albinos y machos (Grupos de 10 por cada dosis)

 Conejos machos (Grupos de 5 por cada dosis)
 Cánula para administración oral (para ratones)
 Sonda para administración oral y mordida (para conejos)
 Extracto de la planta
 Aloxano o estreptozotocina
 Reactivos para la determinación de glucosa
 Capilares de microhematocrito heparinizados
 Microcentrífuga para hematocrito
 Agua destilada
 Jeringuillas
 Colorímetro

Descripción de la técnica

Los animales deben ser llevados al laboratorio con tres días de anticipación, mantenerlos con
temperatura controlada y con libre acceso al agua y alimentos.
48 horas antes del experimento tratar los animales con una dosis de aloxano de 100mg/Kg por vía
intraperitoneal. Pasado este tiempo, tomar muestras de sangre del seno orbital (ratones) o de la
vena marginal (conejos). Determinar la glicemia a los animales. Una glicemia de 300mg/dL o más en
los ratones se considera como una diabetes química positiva. Luego se procede a la administración
de la primera dosis del extracto y del agua destilada.
Se toman muestras adicionales de sangre 1, 2, 4 y 24 horas después de la administración de los
tratamientos.
Las muestras de sangre se analizan para determinar los niveles de glucosa por cualquier método
enzimático.
Repetir el procedimiento para las dosis restantes.
PAPER
En un estudio realizado por Meckes María y colaboradores en el 2015, ha cerca de los Iridoides
adicionales de la planta medicinal Astianthus viminalis y su actividad hipoglucemiante y
antihiperglucemiante, para la determinación de dichas actividades se empleó ratas Wistar machos,
con diabetes inducida experimentalmente, con un peso variable entre 270-300 g.
Diabetes experimental Se indujo mediante la administración de aloxano en dosis 150 mg/kg i.p. en
tres dosis cada 48 horas para una dosis total de 450 mg/ kg; 7 días después de la ultima
administración los animales se mantuvieron en ayunas por 12 horas y se determinaron los niveles
de la glucosa en sangre. Los animales con glicemias superiores 150 mg/dL, fueron considerados
diabéticos aptos para el experimento. Los animales se mantuvieron en condiciones controladas de
temperatura, luz (12 horas luz), alimento y agua.. En cuanto a la administración del extracto se lo
realizó en Cuatro grupos de seis ratas cada uno, recibieron diferentes concentraciones del extracto
(0.1, 0.5, 1.0 y 2.0 g / kg de peso del animal). El producto vegetal, solubilizado parcialmente en agua,
se administró por vía intragástrica en un volumen de 2-3 mL. La cuantificación de los niveles de
glucosa se determinó a 2 y 4 horas después de administrado el producto

VIA DE ADMINISTRACIÓN INTRAGASTRICA

Y para la Determinación de los niveles de glucosa plasmática. Los animales se anestesiaron con
pentobarbital sódico administrado vía intraperitoneal en una dosis de 0.2 mg / kg de peso del
animal. Las muestras de sangre se tomaron de la vena porta, separando el plasma por centrifugación
(3600 rpm). Los niveles de la glucosa plasmática se determinaron por reacción enzimática de
hexoquinasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en un analizador bicromático VP Abbott y están
dados en mg / dL.
Determinación de los niveles plasmáticos de insulina, en ratones normoglicémicos e
hiperglicémicos.

Durante las pruebas a) y b), a la vez que se toman muestras para determinar glucosa, tomar
muestras para determinar los niveles de insulina por medio del método de radioinmunoensayo
(RIA).

Prueba de tolerancia oral a la glucosa

Animales y Materiales

 Ratones suizos albinos y machos (Grupos de 10 por cada dosis)

 Cánula para administración oral (para ratones)
 Extracto de prueba
 Solución de glucosa (200mg/mL)
 Reactivos para determinación de glucosa
 Microcapilares heparinizados
 Microcentrífuga para hematocrito
 Jeringuillas (1 mL)
 Colorímetro

Descripción de la técnica

Los animales deben ser llevados al laboratorio con tres días de anticipación y mantenerlos con
temperatura controlada y con libre acceso al agua y alimentos. Doce horas antes del experimento
los alimentos deben ser retirados, permitiendo al animal agua ad libitum. (ad libitum: es una
expresión del latín que significa literalmente 'a placer, a voluntad' y quiere decir “como guste”)

Los tratamientos se administran por la vía oral (extracto y agua destilada) a los grupos
correspondientes. Una hora después se les administra glucosa por la vía intraperitoneal en dosis de
2000mg/Kg. Las muestras de sangre se colectan antes de administrar los tratamientos y 0.25, 0.5, 1
y 2 horas después de la administración de la glucosa. Se determinan los niveles de glucosa y se repite
el procedimiento con las dosis restantes del extracto.
Cantidad de extracto requerida
Para ratones: para un total de cuatro dosis (1000, 500, 250 y 50mg/mL), 1g de extracto por cada
prueba.
Para conejos: para el mismo número de dosis, 25g de extracto por cada prueba.
Las diferentes estadísticas entre los diferentes grupos se determinan usando la prueba de t de
student.
DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE GLUCOSA POR MEDIO DE TIRAS REACTIVAS
Introducción
La siguiente técnica permite determinar la actividad hipoglicemiante de extractos, fracciones o
compuestos frente a un estado de hiperglicemia.
Protocolo experimental
Materiales
a) Extracto al 15% o 4ml/Kg o cantidad equivalente redisuelta en el volumen señalado.
b) 10 conejos de 2,5 a 3 Kg de peso corporal, con libre acceso al agua y alimento. Antes del ensayo
los animales deben ser sometidos a ayuno de 18 horas. Los ensayos están diseñados para una
duración de tres semanas:
 1ra semana agua 4ml/Kg
 2da semana clorpropramida u otro hipoglicemiante oral a dosis relacionada a la máxima
dosis utilizada en humanos, suspensión en concentración para ser administrada en
volumen de 4mL/Kg.
 3ra semana, el preparado del extracto en volumen 4mL/Kg.
Descripción de la técnica.
El test consiste en la determinación de la curva de tolerancia a la glucosa. Se aplica una solución de
glucosa al 50% subcutáneamente a razón de 2 gramos de glucosa /Kg de peso, en dosis idénticas
administradas a tiempo cero y 60 minutos después. Los ensayos duran 5 horas. Las muestras de
sangre se obtienen, la primera en ayunas y a intervalos de 60 minutos después de la primera carga
de glucosa. La glucosa se determina por el método de la glucosa oxidasa peroxidasa con tiras
reactivas Haemo-glucotest 20-800 usando un equipo Reflolux H-M, puede también determinarse la
glucosa en suero por el mismo método usando para la valoración técnicas espectrofotométricas. Se
calcula el área bajo la curva de tolerancia y el valor medio de la glucosa que puede ser sometido a
pruebas estadísticas.
El método permite evaluar el efecto hipoglicemiante de plantas tomando como referencia el
metabolismo de carbohidratos.
Con las dosis de glucosa utilizadas, los animales alcanzan niveles de glucosa basales alrededor de 5
horas, lo cual permite evaluar el efecto hipoglicemiante durante este periodo de tiempo que puede
ser un intervalo adecuado para determinar la frecuencia de ingestión de los extractos. Estos ensayos
junto con los realizados en animales diabéticos pueden ayudar a entender los mecanismos de acción
responsables del efecto hipoglicemiante.

DETERMINACIÓN DE NIVELES DE GLUCOSA EN CONEJO: TRATAMIENTO AGUDO Y CONTINUADO

Protocolo Experimental
 Animal: Conejo N. Z.
 Vía de administración: intragástrica o intravenosa.
 Toma de muestras de sangre: vena marginal de la oreja.
 Determinación enzimática de glucosa en suero.
 En cada ensayo se estudiarán tres dosis por producto.

Estudio sobre animales normoglicémicos

Determinación de la glicemia tras un ayuno de 20-24 horas (Go). Inmediata administración de los
extractos. Determinación de la glicemia a 1, 3, 6 y 8 horas después de la administración.
Paralelamente se realiza un control en el que los animales en lugar de extracto reciben agua
destilada.
Cálculo de los porcentajes de variación de la glicemia en el tiempo, según la siguiente fórmula:
𝐺𝑖 − 𝐺𝑜
%𝑉𝑎𝑟𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝑥 100
𝐺𝑜
En caso de detectar actividad hipoglicemiante en animales normoglicémicos con alguno de los
productos, éstos pasarán a ensayarse directamente en animales diabéticos. En caso contrario,
aquellos extractos no activos en animales normales se estudiarán en conejos a los que se ha
administrado una sobrecarga oral de glucosa, con el fin de determinar una posible actividad en
estados hiperglicémicos no patológicos y continuar su estado en animales diabéticos.
Estudio sobre animales diabéticos

Inducción de la diabetes: Administración de aloxano (150mg/kg).

Tratamiento agudo: Este test es idéntico al descrito para animales normoglicémicos, salvo que en
esta ocasión se estudian los extractos en animales diabéticos.

Tratamiento continuado: Se determina la glicemia en ayunas de cada uno de los animales y a

continuación se administran los extractos, permitiendo el acceso a la comida durante seis horas. Se
someten de nuevo los animales a un ayuno de 18 horas para la posterior administración de los
extractos. Este modus operandi se sigue durante ocho días, determinando los niveles de glucosa en
sangre día a día durante una semana, a partir de la cual se suspende el tratamiento, se controla la
glicemia de los animales diabéticos cada cierto tiempo, hasta que estas alcanzan valores iniciales.

Cantidad de extracto requerida

Animal de experimentación: Conejo

Animales normoglicémicos: Efecto sobre diversos parámetros sanguíneos (glucosa, triglicéridos,

ácidos grasos libres, colesterol, insulina) 5g extracto

Animales diabéticos por aloxano

-Tratamiento agudo 5g extracto

-Tratamiento continuado 30g extracto

ACTIVIDAD A NIVEL DEL CONSUMO PERIFÉRICO DE GLUCOSA

Técnica descrita por Wallance-Owen, 1972. Se sacrifican los animales (ratas), previo ayuno de 36
horas, por fractura cervical y se desangran, se les practica una incisión a nivel abdominal para la
extracción del diafragma, procurando no dañarlo y se deposita en una solución Krebs bicarbonatada
para su limpieza.

Posteriormente se divide en cuatro hemidiagramas de tamaño similar y se introducen en matraces

Warbur, los cuales contienen 3ml de solución Krebs bicarbonatada a la que se le añade glucosa
(16mM) y se oxigena 15 minutos con carbógeno. La incubación se realiza a 37,2°C durante un
período de 90 minutos, con agitación continua de 60 ciclos/minuto y oxigenación con carbógeno.

El consumo periférico de glucosa se determina por la concentración de glucosa residual en el medio

de incubación y se refiere a 10mg de músculo seco.

Los resultados se expresan por los incrementos porcentuales del consumo de la hexosa en relación
al blanco, para cada una de las dosis.
SOLUCIÓN KREBS: Desarrollada por Hans Krebs y Kurt Henseleit , es una solución
que contiene sodio (Na), potasio (K), cloruro (Cl), calcio (Ca), Sulfato de magnesio (MgSO 4 ),
bicarbonato (HCO 3 ), fosfato (PO 4 ), glucosa , albúmina y trometamina (THAM). Se ha utilizado
experimentalmente, por ejemplo, para estudiar las arterias ex vivo y durante pruebas musculares
aísladas de los músculos esqueléticos de los mamíferos.

ACTIVIDAD A NIVEL DE LA ABSORCIÓN INTESTINAL DE GLUCOSA

Técnica descrita por Sols y Ponz 1947, y modificada. Se utilizan ratas de un peso aproximado de 180
a 200g, las cuales se someten a un ayuno de 36 horas previo a la anestesia, llevada a cabo con una
dosis de pentotal sódico de 20 mg/Kg, vía intraperitoneal. Se les practica una laparotomía media y
tras el ligado del conducto biliar en su desembocadura, se introducen en el duodeno o íleon dos
cánulas provistas de llaves de apertura y cierre, que permiten controlar el flujo de líquido.

Tras la limpieza del intestino mediante suero salino fisiológico y eliminando éste, se cierra la cánula
ileal y se introduce un volumen de 7,5ml de una solución isotónica glucosada, cerrando
posteriormente la cánula duodenal; transcurridos 30 minutos se recoge el líquido completándolo
hasta un volumen de 100ml con solución isotónica salina, pasándola siempre a través del tramo
intestinal para arrastre del contenido.

La medida de absorción de glucosa se realiza por diferencia de su concentración en líquido, antes y

después de ser introducido en el tracto intestinal y se expresa en porcentaje.

ACTIVIDAD A NIVEL PANCREÁTICO: LIBERACIÓN DE INSULINA

Técnica descrita por Lacy et al, 1967. Se anestesian las ratas con 20mg/Kg de pentotal sódico, se les
practica una laparotomía media, se pinza el duodeno a la salida del colédoco y se canúla lo más
cerca posible del hígado.

Se distiende el páncreas por introducción a través de la cánula de un volumen de 20ml de solución

Hanks fría, se extrae éste depositándolo en una placa Petri con 0,5ml de solución Hanks. Se elimina
la grasa pancreática, se pica con ayuda de unas tijeras hasta consistencia de papilla. Se mide el tejido
pancreático con tubo graduado, dejando 1 ml de líquido sobrenadante.

Posteriormente se digiere el tejido introduciéndolo en tubo de cierre hermético, al que se adiciona

el agente disgregante, colagenasa (Sigma tipo V), en cantidades de 1,065 U/cc de tejido pancreático.
Se agita vigorosamente durante 6-8 minutos en un baño de agua a 37°C hasta total disgregación.

Se fracciona en cuatro alícuotas complementando con solución Hanks hasta un volumen de 10ml
cada una. Se centrifuga a 413xg durante 30 segundos y se eliminan los sobrenadantes, se reúnen en
dos tubos donde se suspenden de nuevo con una solución Hanks hasta un volumen de 10ml
volviendo a centrifugar a 413xg durante 60 segundos.
Se elimina el sobrenadante y se toman los islotes con ayuda de un estereomicroscopio y pipeta
Pasteur. Una vez aislados los islotes se preincuban en solución Krebs-Henseleit bicarbonatada
durante30 minutos a 38°Cy se agita a 72 ciclos/minuto.

Tras la preincubación se toman de nuevo en lotes y se introducen en un vial que contiene 2ml de
solución de Krebs-Henseleit bicarbonatada; la incubación se realiza durante 25 minutos en idénticas
condiciones a las anteriormente descritas, dejando esta vez, tras finalizar, 5 minutos de reposo.
Finalmente se toman 5ml de la solución final para la determinación de la insulina.

La insulina se determina según el método descrito por Hales, basado en la producción de un

aumento de radioactividad por formación de un complejo precipitado, insulina-anticuerpo sérico-
anti-𝝲-globulina. Las medidas se expresan en nanogramos por mililitro de plasma.

HANKS: Por lo general, se usan como un sistema tampón en medios de cultivo celular y ayudan a
mantener el pH fisiológico óptimo (aproximadamente 7.0–7.4) para el crecimiento celular. Debido
a su naturaleza poco reactiva y pequeña concentración en solución, las sales de Hanks se utilizan
principalmente en medios que están expuestos a condiciones atmosféricas en lugar de a la
incubación con CO2. La realización de este último supera drásticamente la capacidad tampón de las
sales de Hanks y puede provocar la muerte celular.

ACTIVIDAD ANTIDIABÉTICA EN TRATAMIENTOS CONTINUADOS

Inducción de la Diabetes

Para la consecución de la diabetes experimental por estreptozotocina se administra a los animales

el agente diabetogénico en dosis de 60mg/Kg de peso, disuelto en tampón citrato sódico 0,05M
ajustado a un pH 4,5 con HCl 1N. El volumen de disolución administrado es de 0,5ml vía
intraperitoneal. Tras su administración aparece una fase hipoglucémica consecuencia de la
liberación de insulina, secundaria a a destrucción inicial de las células 𝝱, en esta fase se adiciona el
agua de bebida de los animales de experimentación, glucosa en una concentración del 7%.

24 horas después de la administración del agente, aparecen los signos clínicos de la diabetes,
glucosuria, poliuria, polidipsia. Cuando se alcanzan niveles de glucosa en sangre superiores a
250mg/100ml se considera insaturada la diabetes experimental.

A lo largo del período del tratamiento los animales tienen libre acceso a la comida y bebida.

Tratamiento con los distintos extractos o principios activos.

Se realiza un tratamiento continuado durante 30 días, con los distintos extractos, se sacrifican los
amnimales a los 10, 20 y 30 días de iniciado el mismo.
Los parámetros a evaluar son:

-A nivel plasmático: glucemia, insulina, triglicéridos y colesterol

-A nivel pancreático.

a) Insulina tota pancreática (𝝱)

Se extrae el páncreas tras practicar una laparotomía media, se pesa y se deposita en una placa Petri
con 1ml de solución Hanks. Posteriormente se pica y se adicionan 4ml de solución ácida, mezcla de
etanol: HCl: agua (75:1,5:3,5) La homogenización de la masa pancreática se realiza mediante potter
automático.

La solución así obtenida se vierte en un víal, se completa hasta 10ml de solución ácida y tras el cierre
hermético del vial, se mantiene a 4°C durante 16 horas bajo agitación continua a 72 ciclos/minuto.
Se realiza la determinación de insulina por RIA en el sobrenadante obtenido tras la centrifugación
del contenido de los viales a 6000 xg durante 30 minutos

b) Determinación del DNA

Método de Labarca C, et al. 1980, basado en la producción de un aumento de fluorescencia por

acoplamiento de colorantes ligables (coloranteHoechst 33258) al DNA. El método es muy preciso y
permite determinar la concentración de este nucle+otido en presencia de proteínas y DNA.

c) Determinación de proteínas

Método de Bradford 1976 basado en la formación de un complejo coloreado entre azul Coomssie y
las proteínas, el complejo presenta un máximo de absorción a 595 nmy un alto coeficiente de
extinción lo que permite una gran sensibilidad en la determinación de la concentración proteica.

d) Estudios histológicos

Se fijan las muestras de páncreas (zona de la cola pancreática) de rata en glutaraldehído al 2,5% en
tampón cacodilato (pH = 7.4, 0.1M), se postfijan en tetróxido de osmio al 1,5%, se deshidratan con
series crecientes de acetona y se incluyen una resina Epon 812. Se realizan cortes semifinos de 1
micra de grosor y se tiñen con azul de toluidina y con fuchsina paraldehída. Con esta última tinción
los gránulos secretorios de las células beta de los islotes de Langerhans aparecen fuertemente
teñidos, permitiendo de otros tipos celulares.