Pérdida de incompatibilidad citoplásmica en Aedes aegypti infectado por Wolbachia en

condiciones de campo

Resumen

Las bacterias Wolbachia ahora se están introduciendo en las poblaciones de mosquitos Aedes
aegypti para el control del dengue. Cuando las infecciones por Wolbachia son muy frecuentes,
influyen en el entorno local. La transmisión del dengue por el bloqueo directo de virus, así como los
efectos perjudiciales sobre las poblaciones de mosquitos vectores. Sin embargo, la efectividad de
esta estrategia podría verse influida por temperaturas que disminuyen la densidad de Wolbachia, lo
que reduce la capacidad de Wolbachia para invadir y persistir en la población y bloquear virus.
Criamos larvas de Ae. Aegypti infectadas con wMel en el campo durante la estación húmeda en
Cairns, North Queensland. Los recipientes colocados a la sombra produjeron mosquitos con una
alta densidad de Wolbachia y poco impacto en la incompatibilidad citoplásmica. Sin embargo, en el
50% de la sombra donde las temperaturas alcanzaron los 39 ° C durante el día, los machos
infectados con wMel, perdieron parcialmente su capacidad para inducir incompatibilidad
citoplásmica y las hembras redujeron en gran medida la eclosión de los huevos cuando se
cruzaron con los machos infectados. En un segundo experimento en condiciones algo más
calientes (> 40 ° C en 50% de sombra), las hembras infectadas con WMel criadas en campo
tuvieron una eclosión de huevo reducida a 25% cuando se cruzaron a machos infectados con
WMel criados en el campo. La densidad de Wolbachia se redujo en un 50% de sombra para ambos
sexos en ambos experimentos, con algunos mosquitos eliminados de sus infecciones por
Wolbachia por completo. Para investigar el rango de temperatura crítico para la pérdida de
infecciones por Wolbachia, sostuvimos a Ae. Huevos de aegypti en termocicladores durante una
semana a un rango de temperaturas cíclicas. La densidad de wMel en adultos disminuyó cuando
los huevos se mantuvieron a 26–36˚C o más, con pérdida completa a 30–40˚C, mientras que la
densidad de wAlbB se mantuvo alta hasta que las temperaturas fueron letales. Estos hallazgos
sugieren que los efectos de alta temperatura en Wolbachia son potencialmente importantes cuando
los contenedores de reproducción están expuestos a la luz solar parcial pero no a la sombra. El
estrés por calor podría reducir la capacidad de las infecciones de Wolbachia para invadir las
poblaciones de mosquitos en algunos lugares y comprometer la capacidad de Wolbachia para
bloquear la transmisión del virus en el campo. Los efectos de la temperatura también pueden tener
un impacto ecológico en las poblaciones de mosquitos, dado que una proporción de la población
se vuelve auto-incompatible.

Resumen del autor

Los mosquitos Aedes aegypti infectados con simbiontes Wolbachia se están desplegando en los
trópicos como una forma de reducir la transmisión de enfermedades. Algunas cepas de Wolbachia
son vulnerables a altas temperaturas, pero estos efectos no se han evaluado fuera del entorno de
un laboratorio. Criamos Ae. Aegypti infectado con la cepa wMel de Wolbachia en el campo durante
la temporada de lluvias en Cairns, Australia, donde se produjeron las primeras liberaciones de Ae.
aegypti infectadas con Wolbachia. Los mosquitos infectados con el virus se volvieron parcialmente
autoincompatibles, con una reducción en la eclosión de los huevos, cuando las larvas se criaron en
sombra parcial, donde las temperaturas máximas diarias superaban los 39 ° C. En estas
condiciones, la cantidad de Wolbachia en mosquitos adultos se redujo a menos del 1% de los
mosquitos criados en laboratorio en promedio, mientras que algunos mosquitos fueron eliminados
de Wolbachia por completo. En contraste, wMel se mantuvo estable cuando los mosquitos se
criaron en condiciones más frías a plena sombra. Los ensayos de campo con la cepa wMel ahora
están en marcha en más de 10 países, pero las altas temperaturas en algunos lugares pueden
restringir la capacidad de Wolbachia para invadir las poblaciones naturales de mosquitos y
bloquear la transmisión de la enfermedad.

Introducción

Los mosquitos Aedes aegypti son los principales vectores del dengue y están muy extendidos en
los trópicos, donde viven cerca de los humanos. Históricamente, los insecticidas químicos se han
utilizado para controlar las poblaciones de Aedes aegypti durante los brotes de enfermedades,
pero es poco probable que este enfoque sea sostenible, ya que la resistencia a los insecticidas
está muy extendida en muchas partes del mundo. Existe un interés creciente en los programas de
"retaguardia y liberación" donde los mosquitos modificados con rasgos deseables se liberan en
poblaciones naturales como un enfoque alternativo para el control de enfermedades. A la
vanguardia de estos programas está el despliegue de mosquitos infectados con la bacteria
Wolbachia. La Wolbachia ocurre naturalmente en muchos insectos, pero se ha introducido
experimentalmente en Aedes aegypti, donde pueden interferir con la transmisión del dengue y
otros patógenos. Los Wolbachia se transmiten por vía materna y típicamente afectan la
reproducción del huésped o brindan otras ventajas para facilitar su propagación en las poblaciones.
Estos fenotipos se han utilizado en programas de control de enfermedades en los que se han
desplegado mosquitos infectados con Wolbachia para reemplazar poblaciones naturales o suprimir
poblaciones mediante la liberación de solo machos. Ambos enfoques se basan en la
incompatibilidad citoplásmica inducida por Wolbachia, donde las hembras no infectadas que se
aparean con machos infectados no producen descendencia viable, pero la viabilidad se restablece
si la hembra también está infectada por Wolbachia.

Más de diez asociaciones de cepas de Wolbachia se han generado en Aedes aegypti y exhiben
una amplia gama de fenotipos. Algunas cepas de Wolbachia son relativamente benignas y tienen
poco impacto en la capacidad física del huésped o el bloqueo de virus, como la cepa wRi. Otros
imponen grandes costos de acondicionamiento físico, pero también reducen fuertemente la
transmisión de virus, incluyendo wMelPop y wAu, mientras que otros como wAlbB se ubican en
algún punto intermedio. También hay superinfecciones en las que dos o más cepas de Wolbachia
infectan el mismo huésped, lo que puede tener efectos combinados o inesperados. Aedes aegypti
infectado con la cepa wMel de Wolbachia ha sido o está siendo liberado en más de diez países y
se ha establecido con éxito en áreas suburbanas en Cairns y Townsville en Queensland, Australia
y en Brasil. La cepa wAlbB también se ha desplegado con éxito en Malasia para el reemplazo de la
población y en varios países para la supresión de la población, donde la liberación de solo varones
infectados ha reducido el tamaño de la población en más del 80% debido a la incompatibilidad
citoplásmica.

A pesar de estos éxitos, hay limitaciones de las infecciones por Wolbachia que pueden afectar su
utilidad como agentes de control de enfermedades. La mayoría de las infecciones por Wolbachia
en Aedes aegypti reducen la condición física de los mosquitos y estos costos tienden a
exacerbarse en ambientes estresantes, como cuando las larvas se mueren de hambre o en huevos
inactivos. Los costos de acondicionamiento físico pueden tener enormes efectos en el éxito de la
invasión. Por ejemplo, la infección por wMelPop no persistió en las zonas de liberación en Australia
y Vietnam a pesar de alcanzar frecuencias superiores al 90%, probablemente debido a los costos
masivos de esta cepa. Las infecciones por Wolbachia que ocurren naturalmente en los mosquitos
pueden interferir con los patrones de incompatibilidad citoplásmica y limitar el potencial de
reemplazo y supresión de la población. Las interacciones dependientes de la densidad y los
ambientes espacialmente heterogéneos también pueden disminuir la tasa de invasión, al igual que
la susceptibilidad a los pesticidas en los mosquitos liberados.
Para que los programas de reemplazo de la población tengan éxito, las infecciones por Wolbachia
deben persistir en las altas frecuencias del entorno y bloquear la transmisión del virus en
condiciones de campo durante muchos años después de la implementación. Existe el riesgo de
que las infecciones, los virus o los mosquitos de Wolbachia evolucionen después del
establecimiento de Wolbachia en las poblaciones, lo que conduce a una protección contra virus
menos efectiva en los mosquitos infectados con Wolbachia a largo plazo. Sin embargo, la infección
por wMel se ha mantenido estable hasta el momento en términos de bloqueo del virus y sus
efectos sobre la condición física. Después de siete años en el campo, wMel ha retenido un título
alto y continúa induciendo una incompatibilidad citoplásmica completa en el laboratorio, lo que
indica que la atenuación es poco probable durante al menos varios años después del despliegue.

Si bien la infección por wMel en el norte de Queensland, las poblaciones de Aedes aegypti no
parecen haber cambiado fenotípicamente desde su liberación, las condiciones ambientales en el
campo, como la temperatura, pueden tener efectos transitorios en las infecciones por Wolbachia, lo
que influye en su capacidad para suprimir la transmisión del virus o establecerse en las
poblaciones. Este problema es particularmente importante ya que el cambio climático está llevando
a condiciones promedio más cálidas y temperaturas más altas extremas, incluso en los trópicos.
Las infecciones por Wolbachia en Aedes aegypti son vulnerables a altas temperaturas; el estrés
por calor durante el desarrollo larvario reduce la densidad de Wolbachia en adultos y disminuye la
fidelidad de la incompatibilidad citoplásmica y la transmisión materna. La fidelidad de la
incompatibilidad citoplásmica y la transmisión materna son dos parámetros clave para la
propagación de Wolbachia, mientras que la densidad de Wolbachia se asocia positivamente con la
fuerza del bloqueo del virus tanto en Drosophila como en los mosquitos.

Las cepas de Wolbachia en Aedes aegypti difieren en su respuesta al estrés por calor; las cepas
wMel y wMel-Pop son relativamente susceptibles, mientras que wAlbA, wAlbB y wAu son más
robustas, reteniendo altas densidades cuando las larvas se crían a temperaturas cíclicas de 26–
37˚C. Estos estudios de laboratorio demuestran la posibilidad de que el estrés por calor afecte el
éxito de las intervenciones de Wolbachia, pero las condiciones que experimentan los mosquitos en
situaciones de campo son más complejas que en una incubadora. Para comprender los efectos de
las altas temperaturas en condiciones más naturales, criamos larvas de Aedes aegypti infectadas
con wMel en el campo con diferentes niveles de exposición a la luz solar. Luego realizamos cruces
para probar los efectos sobre la incompatibilidad citoplásmica y la densidad de Wolbachia medida.
Finalmente, realizamos experimentos con huevos de Aedes aegypti en el laboratorio para
determinar el rango de temperaturas que afectan negativamente las infecciones de Wolbachia.

Métodos

Declaración de Ética

La alimentación de sangre en sujetos humanos fue aprobada por el Comité de Ética en

Investigación Humana, Universidad James Cook (aprobación H4907). Todos los sujetos adultos
proporcionaron un consentimiento oral informado (no hubo niños involucrados).

Variedades de mosquitos y mantenimiento de colonias.

Los mosquitos Aedes aegypti infectados con la cepa wMel de Wolbachia se recolectaron en 2013
en lugares cercanos a Cairns, Australia, donde wMel se había establecido con éxito. Aedes aegypti
infectado con wMelPop se recolectó en Cairns, Australia, en 2012, luego de las liberaciones de
campo y la cría local. Aedes aegypti infectado con wAlbB se derivaron de colonias de laboratorio y
se describen en Xi et al. y Axford et al. Los Aedes aegypti no infectados se recolectaron en 2016
en lugares donde no se habían liberado mosquitos infectados con Wolbachia. Los mosquitos se
mantuvieron en un insectario en la Universidad de Melbourne de acuerdo con los métodos
descritos por Ross et al. Las hembras con cada cepa de Wolbachia se cruzaron con machos de la
población no infectada durante al menos tres generaciones antes del inicio de los experimentos
para asegurar que los antecedentes genéticos entre las poblaciones fueran similares.

Crianza de larvas en condiciones de temperatura de campo.

Llevamos a cabo dos experimentos durante la estación húmeda en Cairns, Australia, en 2018 para
probar la estabilidad de la infección de wMel Wolbachia en condiciones de temperatura de campo.
Los experimentos se llevaron a cabo en la Universidad James Cook bajo un toldo protector con
diferentes niveles de sombra, como se describe en Ritchie et al. La reducción relativa en la
intensidad de la luz en comparación con la luz solar directa se determinó utilizando un medidor de
luz EasyView EA30; Se eligieron dos niveles de sombra para los experimentos que redujeron la
intensidad de la luz en un 50% y un 99%, respectivamente. Luego establecimos contenedores
llenos de agua de varios tamaños para simular una gama de hábitats de larvas de campo. Los
huevos infectados con wMel se incubaron en una sola bandeja en un 99% de sombra, luego se
colocaron aproximadamente 100 larvas del primer estadio en cada contenedor. Las larvas
recibieron tabletas de alimento para peces tropicales TetraMin a voluntad durante todo su
desarrollo. Las temperaturas del agua se registraron cada 30 minutos durante el desarrollo larvario
con registradores de datos colocados en bolsas con cierre hermético y sumergidos en el centro de
cada contenedor. Las pupas se recolectaron una semana después de la eclosión y se devolvieron
al laboratorio para la emergencia de adultos.

En el primer experimento, los huevos de Aedes aegypti infectados con la cepa wMel de Wolbachia
se incubaron el 10 de enero de 2018 y las pupas se recolectaron el 17 de enero. Utilizamos
recipientes de tres tipos con una amplia gama de volúmenes de agua que se esperaba que
experimentaran una variedad de condiciones de temperatura. Cubos negros (13 cm de radio, 25
cm de altura) se llenaron con 8 L de agua del grifo, macetas (5 cm de radio, 10 cm de altura) con
500 mL y tazas (2 cm de radio, 6 cm de altura) con 60 mL. Los recipientes se cubrieron con una
malla o medias para evitar que los mosquitos silvestres se ovipositen y los mosquitos
experimentales se escapen. Esta configuración se repitió tanto para los niveles de sombra del 99%
como del 50%. Las larvas infectadas con wMel también se criaron en un solo cubo lleno de 8 L de
agua y se colocaron a la luz solar directa.

En el segundo experimento, repetimos este procedimiento, pero utilizamos dos tipos de

recipientes: cubos negros llenos con 8 L de agua y recipientes pequeños redondos de plástico
transparente (10 cm de radio, 7 cm de altura) llenos con 400 mL de agua, con cada contenedor
replicado tres veces al 99% y al 50% de niveles de sombra. Los huevos se incubaron el 26 de
enero de 2018 y las pupas se devolvieron al laboratorio el 1 de febrero. Las poblaciones de Aedes
aegypti infectadas y no infectadas con WMel también se criaron en el laboratorio simultáneamente
a 26 ° C ± 1 ° C, según Ross et al. para cruces experimentales.

Incompatibilidad citoplasmática después de la crianza en el campo.

Probamos la capacidad de los machos infectados con wMel para inducir incompatibilidad
citoplásmica y las hembras infectadas con wMel para restablecer la compatibilidad después de
criarse en condiciones de temperatura de campo.

Los adultos que emergieron de cada tipo de contenedor y nivel de sombra se agregaron a jaulas
de 15 cm3 donde los sexos se mantuvieron por separado. Los cruces se realizaron dos o tres días
después de que los adultos emergieron aspirando a aproximadamente 50 hembras en jaulas con
un número igual de machos. Las hembras fueron alimentadas con sangre tres días después y
luego se aislaron en vasos de plástico que contenían 15 ml de agua de cría de larvas y una tira de
papel de lija para la ovoposición. Los huevos se recolectaron cuatro días después de la
alimentación con sangre, se secaron parcialmente y se incubaron cuatro días después de la
recolección. Luego se contaron los huevos con un microscopio de disección y se determinaron las
tasas de eclosión contando la proporción de huevos que tenían una tapa claramente separada.

En el primer experimento, realizamos cruces con adultos criados en cubos a 99% o 50% de
sombra. Los machos infectados con WMel criados en el campo se cruzaron con hembras no
infectadas para determinar su capacidad para inducir incompatibilidad citoplásmica. También
cruzamos hembras infectadas con wMel criadas en campo a machos no infectados o hembras
infectadas con wMel y criadas en laboratorio para determinar la capacidad de las hembras para
restablecer la compatibilidad. Los machos infectados y las hembras no infectadas criadas en
condiciones de laboratorio se cruzaron entre sí para confirmar que wMel induce una
incompatibilidad citoplásmica completa a 26 ° C. Veinte hembras fueron aisladas para la
ovoposición en cada uno de estos cruces, pero los individuos que murieron o no pusieron huevos
fueron excluidos del análisis.

En el segundo experimento, realizamos un conjunto similar de cruces, pero solo para adultos que
emergen de cubos sostenidos en un 50% de sombra. En cruces donde se infectaron ambos sexos,
utilizamos machos y hembras del mismo recipiente en lugar de usar machos criados a 26 ° C. Esto
se hizo para ver si las poblaciones se volvían autoincompatibles cuando ambos sexos se criaban a
temperaturas más cálidas. Se aislaron treinta hembras para la oviposición en cada cruz. Los cruces
entre machos y hembras criados en las mismas condiciones también se realizaron con adultos que
se criaron en cubos con un 99% de sombra y pequeños contenedores con un 50% y un 99% de
sombra. Se determinaron las proporciones de eclosión de los huevos y las densidades de
Wolbachia de hembras en cada uno de estos cruces para ver si existía una relación entre la
densidad de Wolbachia y la tasa de eclosión.

Tolerancia térmica del huevo y densidad de Wolbachia.

Realizamos dos experimentos con termocicladores para probar la tolerancia térmica de los huevos
de Aedes aegypti infectados con Wolbachia y la densidad de Wolbachia en un rango de
condiciones de temperatura. Seguimos los métodos descritos en Kong et al. Con algunas
modificaciones. Los huevos de las colonias no infectadas, wMel, wAlbB y wMelPop se recolectaron
en tiras de papel de lija que luego se secaron parcialmente, se envolvieron en una toalla de papel y
se guardaron en bolsas selladas con cierre hermético. Cuatro días después de la recolección, los
huevos se cepillaron sobre papel de filtro con un pincel pequeño y luego se vertieron en tubos de
PCR de 0,2 ml con un embudo. Se agregaron lotes de 15 a 39 huevos (media 25.7) a cada tubo.
Los tubos se cerraron y luego se golpearon en el banco para asegurar que los huevos se
hundieran hasta el fondo del tubo, donde el control de temperatura en el termociclador es el más
preciso. Luego se colocaron los tubos en bloques de calor de los termocicladores Biometra
TProfessional TRIO 48 con tubos de cada población dispuestos al azar en cada bloque.

En ambos experimentos utilizamos tres termocicladores, cada uno con tres bloques calentados que
pueden funcionar de forma independiente para un total de 9 regímenes de temperatura. En el
primer experimento, elegimos un amplio rango de ciclos de temperatura para cubrir todo el rango
de temperaturas que Aedes aegypti puede experimentar en el campo. Cada régimen tenía una
fluctuación de 10 ° C entre la temperatura mínima y máxima; el más bajo es 8–18˚C y el más alto
es 32–42˚C, con una diferencia de 3˚C entre cada régimen (Fig. S3A). En el segundo experimento,
elegimos un rango de temperatura más estrecho basado en el momento en que la eclosión del
huevo y la densidad de Wolbachia comenzaron a disminuir en el experimento anterior.

El régimen más bajo se estableció en 24-34 ° C y el más alto fue 32-42 ° C, con una diferencia de 1
° C entre cada régimen (S3B Fig). En el primer experimento había seis tubos de huevos replicados
para cada ciclo de temperatura y tipo de infección por Wolbachia y el segundo experimento tenía
12 repeticiones. Después de agregar todos los tubos a los termocicladores, cerramos las tapas y
comenzamos los programas simultáneamente. Los huevos en tubos también se mantuvieron a 26 °
C en una sala de temperatura controlada en ambos experimentos.

Después de una semana, se retiraron los tubos de los termocicladores y se incubaron los huevos
manteniendo los tubos de PCR de lado por encima de los vasos de muestras de 70 ml y luego se
pipeteó agua en los tubos para que los huevos cayeran en la taza. Cada taza se llenó con 40 ml de
agua y se le proporcionó una pequeña cantidad de TetraMin y unos pocos granos de levadura. Dos
días después de la eclosión, determinamos las proporciones de la eclosión de los huevos
dividiendo el número de larvas por el número de huevos. Contamos las larvas de nuevo cada 2
días, ya que algunos huevos tardaron en eclosionar, lo que permitió que aparecieran una semana
antes de que cesáramos de contar. Todas las larvas que se incubaron se agregaron a recipientes
de plástico llenos con 500 ml de agua de RO y se criaron hasta la edad adulta. Se combinaron
múltiples réplicas de larvas en bandejas para la crianza, pero la densidad larvaria se controló a 100
larvas por bandeja o menos para tener en cuenta los efectos de la competencia larvaria y el tiempo
de desarrollo en la densidad de Wolbachia. Todos los adultos se almacenaron en etanol para las
mediciones de densidad de Wolbachia.

Detección y densidad de wolbachia.

En cada experimento, se almacenaron subconjuntos aleatorios de adultos en etanol dentro de las

24 horas posteriores a la emergencia para el examen de Wolbachia. Para ambos experimentos de
campo, extrajimos ADN de 16 machos y 16 hembras de cada tipo de contenedor y nivel de sombra.
Para experimentos con huevos mantenidos en termocicladores, extrajimos ADN de hasta 10
(primer experimento) o 12 (segundo experimento) machos y 10 o 12 hembras de cada tipo de
infección y tratamiento de Wolbachia. Algunos tratamientos tuvieron tamaños de muestra más
bajos debido a las bajas proporciones de eclosión de huevos. El ADN se extrajo de adultos enteros
con 150 μl de resina Chelex 100 al 5% y 3 μl de proteinasa K. Luego realizamos qPCR para
detectar y estimar la densidad de Wolbachia en cada adulto completo usando los métodos
descritos anteriormente. Los individuos se consideraron no infectados si el marcador específico de
Aedes aegypti se amplificó con éxito (valor de Cp <35) pero el marcador específico de Wolbachia
no (valor de Cp de 35 o ningún valor de Cp) en dos ejecuciones independientes. Para los
individuos que fueron positivos para Wolbachia, (el valor de Cp <35 para ambos marcadores), las
diferencias en Cp entre los dos marcadores se transformaron en 2n para proporcionar una
estimación de la densidad de Wolbachia, promediada de al menos dos ejecuciones
independientes. Para el segundo experimento de campo, también estimamos la densidad de
hembras de Wolbachia después de que pusieron huevos para ver si había una relación entre la
densidad de Wolbachia y la tasa de eclosión de huevos cuando se cruzaron con machos
infectados criados en las mismas condiciones.

Análisis estadístico
Todos los datos se analizaron utilizando las estadísticas de SPSS versión 24.0 para Windows. Los
datos de proporción de eclosión y densidad de Wolbachia a menudo no se distribuyeron
normalmente, por lo que se compararon los tratamientos para estas variables con las pruebas U de
Kruskal-Wallis y Mann-Whitney. También utilizamos la correlación de orden de rango de Spearman
para probar la relación entre la escotilla de huevos y la densidad de Wolbachia femenina.

Resultados

Primer experimento de campo

Monitoreamos las temperaturas del agua experimentadas por las larvas en cada tipo de
contenedor a diferentes niveles de sombra. Las temperaturas máximas difirieron entre los tipos de
contenedores en un 99% de sombra, y las tazas tuvieron temperaturas diarias máximas promedio
que fueron 2.5 ° C más altas que las cubetas, aunque las temperaturas promedio fueron similares
porque los contenedores más pequeños alcanzaron temperaturas más frías en la noche (S1 Fig).
Los ciclos de temperatura fueron similares entre los contenedores en un 50% de sombra, lo cual
fue inesperado debido a las grandes diferencias en el volumen de agua. El nivel de sombra afectó
la temperatura sustancialmente, con los cubos a la luz solar directa que experimentaron
temperaturas máximas promedio de 38.3 ° C, mientras que los contenedores en 50% de sombra
(mínimo promedio: 23.7 ° C, máximo promedio: 35.3 ° C) fueron mucho más cálidos que los
contenedores en 99 % de sombra (23.2–29.6 ° C) (Fig. 1A).

Probamos la capacidad de los machos infectados con wMel criados bajo condiciones de
temperatura de campo para inducir incompatibilidad citoplasmática con hembras no infectadas. En
un cruce de control, los machos infectados con wMel criados en el laboratorio a 26 ° C causaron
una incompatibilidad citoplásmica completa (sin huevos incubados) con hembras no infectadas
(Fig. 1). Los machos infectados con wMel criados en cubos a 99% de sombra indujeron una
incompatibilidad citoplásmica casi completa, aunque 2/18 hembras produjeron una sola progenie
viable cada una (Fig. 1B). Los machos infectados con wMel criados en cubos con una sombra del
50% indujeron una incompatibilidad citoplásmica más débil, con 9/16 hembras que producen
alguna progenie viable (Fig. 1C).

También probamos la capacidad de las hembras infectadas con wMel para conservar su
compatibilidad con los machos infectados con wMel criados en el laboratorio. Cuando las hembras
se criaron en cubos a una sombra del 99%, no hubo diferencias en la tasa de eclosión entre los
cruzamientos con machos no infectados y los cruzados con machos infectados con wMel (Mann-
Whitney U: Z = 0.348, P = 0.726, Fig. 1B). En contraste, las hembras infectadas con wMel criados
en cubos al 50% de sombra tuvieron una reducción del 47.6% en la tasa de eclosión de los huevos
cuando se cruzaron con los machos infectados con wMel (Z = 3.612, P <0.001). Esto indica una
incompatibilidad parcial con los machos infectados con Wolbachia, lo que sugiere una pérdida
sustancial de la infección por Wolbachia.

Estimamos la densidad de Wolbachia de un subconjunto de adultos de cada tipo de contenedor y

nivel de sombra (Fig. 2). La densidad de Wolbachia no se vio afectada de manera consistente por
el tipo de contenedor para ambas hembras (Kruskal-Wallis χ2 = 2.598, df = 2, P = 0.273) y machos
(χ2 = 4.419, df = 2, P = 0.110), probablemente porque los tipos de contenedores experimentan
fluctuaciones de temperatura similares a 50% de sombra. Por el contrario, la densidad de
Wolbachia se vio afectada sustancialmente por el nivel de sombra para ambas hembras (χ2 =
71.261, df = 1, P <0.001) y machos (χ2 = 68.563, df = 1, p <0.001). Las hembras criadas con un
50% de sombra tenían una densidad media de Wolbachia que era solo el 0,32% del control de
laboratorio, mientras que los machos tenían una densidad del 8,09% del control. Es probable que
esta reducción refleje las temperaturas diarias máximas sustancialmente más altas experimentadas
en los contenedores a 50% de sombra. En contraste, la densidad de Wolbachia en adultos criados
a una sombra del 99% no fue significativamente diferente a los adultos criados en laboratorio
(hembras: χ2 = 0.650, df = 1, P = 0.420, machos: χ2 = 0.085, df = 1, P = 0.771).

Todos los adultos seleccionados de contenedores en 99% de sombra, 50% de sombra y el

laboratorio dieron positivo para Wolbachia. Sin embargo, no pudimos detectar ninguna infección
por Wolbachia en una muestra de 11 adultos tomada de un cubo colocado a la luz solar directa.
Esto indica una pérdida completa de infección que probablemente se deba a las temperaturas
extremas que se experimentan en ese contenedor (hasta 43 ° C, Fig. 1A). Aunque no puntuamos la
supervivencia hasta la edad adulta en recipientes directamente, el cubo colocado en la luz solar
directa experimentó una alta mortalidad, ya que solo 11 adultos emergieron de las
aproximadamente 100 larvas agregadas inicialmente.

Segundo experimento de campo

Llevamos a cabo un segundo experimento más tarde en el mes en el que también probamos la
incompatibilidad citoplásmica y medimos la densidad de Wolbachia en adultos. Las temperaturas
se vieron afectadas sustancialmente por la ubicación de los recipientes donde las temperaturas
máximas promedio eran casi 7 ° C más cálidas en un 50% de sombra en comparación con el 99%
de sombra (Fig. 3A). Las temperaturas máximas también diferían entre los tipos de contenedores;
al 50% de la sombra, los contenedores pequeños alcanzaron los 39.26 ° C en promedio, mientras
que los cubos alcanzaron los 36.54 ° C, pero las temperaturas promedio no difirieron mucho entre
los contenedores en el mismo nivel de sombra debido a las temperaturas mínimas más altas en los
recipientes.

Establecimos cruces con adultos que emergen de cubos sostenidos en un 50% de sombra para
probar cualquier efecto sobre la incompatibilidad citoplasmática. Los machos infectados con micro
indujeron una incompatibilidad citoplásmica fuerte pero incompleta con hembras no infectadas;
7/18 hembras produjeron alguna progenie viable, en comparación con 0/20 en el control (Fig. 3B).
Los adultos infectados criados en cubos con una sombra del 50% que se cruzaron entre sí
experimentaron una reducción del 79,9% en la tasa de eclosión de los huevos cuando se cruzaron
entre sí con respecto a los cruzamientos con machos no infectados (U de Mann-Whitney: Z =
5,615, P <0,001), lo que sugiere una capacidad muy reducida de las hembras para restablecer la
compatibilidad en estas condiciones de crianza.

Estimamos la densidad de Wolbachia de adultos que emergieron de cada tratamiento en el

segundo experimento. Descubrimos que muchas personas habían perdido su infección por
Wolbachia (sin infección detectable) cuando se criaron en recipientes mantenidos en un 50% de
sombra (Fig. 4), particularmente en recipientes pequeños donde las larvas experimentaban
temperaturas diarias máximas más altas (Fig. 3A). De los adultos criados al 50% de la sombra que
todavía estaban infectados con Wolbachia, su densidad se había reducido a 0.19% y 0.23% del
control de 26 ° C en mujeres y hombres, respectivamente. En este experimento, la densidad de
Wolbachia también se redujo a una sombra del 99% con respecto al control de 26 ° C (hembras: χ2
= 14.828, df = 1, P <0.001, machos: χ2 = 16.519, df = 1, P <0.001), siendo las densidades
aproximadamente el 50% del nivel del control.

Los adultos infectados con wMel que emergieron de los dos tipos de contenedores y los niveles de
sombra fueron devueltos al laboratorio y se les permitió aparearse con individuos del mismo
contenedor. Luego, anotamos las proporciones de eclosión de huevos de hembras individuales y
medimos su densidad de Wolbachia después de la ovoposición para determinar la relación entre la
densidad de Wolbachia y la proporción de eclosión de huevos. Las hembras con altas densidades
de Wolbachia exhibieron altas proporciones de eclosión, mientras que las hembras con densidades
más bajas tendieron a tener proporciones de escotilla muy bajas o no produjeron descendientes
viables, con la correlación entre densidad y eclosión de huevos (correlación de orden de
Spearman: ρ = 0,899, P <0,001, n = 65, Fig. 5). Esto indica que las hembras con densidades bajas
habían perdido parcial o completamente su capacidad para restablecer la compatibilidad, pero los
machos criados en las mismas condiciones habían conservado en gran medida su capacidad para
inducir una incompatibilidad citoplasmática. La relación fuerte entre la densidad de Wolbachia y la
incubadora de huevos, indica que una alta densidad en las hembras es importante para restablecer
la compatibilidad con los machos infectados.

Tolerancia térmica del huevo y densidad de Wolbachia.

Probamos la tolerancia de los huevos infectados y no infectados con Wolbachia a un amplio rango
de condiciones de temperatura. Cuando los huevos se mantuvieron a 26 ° C durante una semana,
los huevos infectados con Wolbachia no difirieron de los huevos no infectados en términos de
proporción de eclosión (Mann-Whitney U: todo P> 0,05). A temperaturas más altas, los costos de
aptitud física de las infecciones por Wolbachia eran evidentes; los huevos infectados con wMelpop
tuvieron proporciones de eclosión más bajas que los huevos no infectados en ciclos de
temperatura de 26–36˚C y 29–39˚C (ambos Z = 2.802, P = 0.005, Fig. 6A). Los huevos infectados
con wAlbB también tuvieron proporciones de eclosión reducidas en relación con los huevos no
infectados a 29–39 ° C (Z = 2.162, P = 0.031), pero los huevos infectados con wMel no se
diferenciaron de los huevos no infectados en ningún ciclo de temperatura (todo P> 0.05).

Criamos larvas para incubar a partir de huevos mantenidos en cada ciclo de temperatura y
medimos la densidad de Wolbachia en adultos. La densidad de Wolbachia no difirió entre hombres
y mujeres en todas las condiciones de temperatura (wMel: Kruskal-Wallis χ2 = 0.271, df = 1, P =
0.603, wAlbB: χ2 = 2.398, df = 1, P = 0.122) excepto wMelPop, donde la densidad fue mayor en las
mujeres que en los hombres (χ2 = 14.507, df = 1, P <0.001). Cuando los huevos se mantuvieron a
26 ° C, los adultos infectados con wMelPop tenían la mayor densidad de Wolbachia, mientras que
wAlbB tenía una densidad intermedia y wMel tenía la densidad más baja (Fig. 6B y 6C), de
acuerdo con estudios anteriores. Este patrón fue consistente en los ciclos de temperaturas más
frías (temperaturas diarias máximas de 18–33 ° C) donde las densidades de Wolbachia para wAlbB
(χ2 = 6.505, df = 5, P = 0.260), wMelPop (χ2 = 9.108, df = 5, P = 0.105) y los machos wMel (χ2 =
2.950, df = 5, P = 0.708) se mantuvieron estables (Fig. 6B y 6C). En contraste, la densidad de
wMel en hembras disminuyó al aumentar las temperaturas máximas en este rango (χ2 = 27.190, df
= 5, P <0.001). Cuando los huevos se mantuvieron a 29–39 ° C, la densidad de Wolbachia en
adultos disminuyó considerablemente tanto para las infecciones por wMel como por wMelPop (Fig.
6B y 6C). Las densidades medianas de wMel se redujeron a solo 0,41% y 0,14% de las
densidades a 26 ° C en hembras y machos, respectivamente. En wMelPop, la pérdida relativa fue
aún más pronunciada, ya que las hembras criadas a partir de huevos mantenidos a 29–39 ° C
tenían una densidad de hembras de solo 26%, mientras que Wolbachia no se detectó en los
machos. la densidad de wAlbB también disminuyó cuando los huevos se mantuvieron a 29–39 ° C
en ambas hembras (Mann-Whitney U: Z = 2.797, P = 0.005) y machos (Z = 2.735, P = 0.006) pero
el efecto fue mucho más débil que el otras cepas, con densidades medias de 34,88% (en hembras)
y 42,04% (en machos) de huevos mantenidos a 26 ° C.
En un segundo experimento, utilizamos un rango de temperatura más estrecho para investigar la
tolerancia térmica del huevo y la pérdida de infecciones por Wolbachia en una escala más fina y
con mayor replicación. Las proporciones de la incubadora de huevos disminuyeron para todos los
tipos de infección por Wolbachia a medida que aumentaban las temperaturas máximas, y el efecto
fue más grave para la infección por wMelPop (Fig. 7A). Las proporciones de eclosión de huevos de
las cepas wMel y wAlbB no difirieron significativamente de los huevos no infectados a temperaturas
máximas de 37 ° C e inferiores (Mann-Whitney U: todas P> 0,05). Sin embargo, a temperaturas
máximas de 38–41 ° C, las cepas wMel y wAlbB tuvieron proporciones de eclosión más bajas que
los huevos no infectados mantenidos a la misma temperatura (todos P P 0.026). Esto indica que
las infecciones por Wolbachia en Aedes aegypti disminuyen la tolerancia de los huevos a altas
temperaturas, particularmente en el caso de wMelPop.

De acuerdo con el experimento anterior, la densidad de Wolbachia disminuyó a medida que los
huevos fueron expuestos a temperaturas máximas crecientes, comenzando a 35 ° C para wMelPop
y 36 ° C para wMel (Fig. 7B y 7C). Las infecciones con wMel y wMelPop se perdieron en algunos
individuos cuando los huevos se expusieron a 29–39˚C y estuvieron ausentes en todos los adultos
a 30–40˚C (Fig. 7B y 7C). En contraste, todos los adultos wAlbB se infectaron en todos los ciclos
de temperatura, aunque la densidad se redujo en ambas hembras (U de Mann-Whitney: Z = 3.204,
P = 0.001) y machos (Z = 3.897, P <0.001) a 30-40˚ C en relación a 26˚C.

Discusión

Probamos la estabilidad de la infección de wMel Wolbachia en Aedes aegypti en condiciones de

temperatura de campo y realizamos experimentos de laboratorio para determinar el rango de
temperaturas que afectan a diferentes cepas de Wolbachia. Nuestros experimentos demuestran
tres resultados principales del estrés por calor en los mosquitos infectados con Wolbachia. En
primer lugar, hay costos directos de las infecciones por Wolbachia en la tolerancia térmica de
Aedes aegypti, al menos durante la etapa del huevo. En segundo lugar, el estrés por calor en
condiciones de sombra parcial en el campo reduce la fidelidad de la incompatibilidad citoplásmica
en los machos infectados con wMel, mientras que las hembras infectadas se vuelven parcialmente
incompatibles con los machos infectados. En tercer lugar, el estrés por calor reduce la densidad de
Wolbachia y puede afectar la capacidad de Wolbachia para bloquear la transmisión del virus en
una subsección de la población de mosquitos criados en condiciones específicas de campo. Por lo
tanto, el estrés por calor podría afectar adversamente el éxito de los programas de control de
enfermedades dependiendo de la ubicación y la naturaleza de los sitios de reproducción en el
campo.

Hay relativamente pocos ejemplos de simbiontes que afectan la tolerancia térmica de sus
anfitriones. En Drosophila melanogaster, la cepa wMelCS de Wolbachia aumenta la supervivencia
de los adultos bajo estrés por calor, mientras que la infección por wMelPop disminuye la
supervivencia, aunque parece que wMel no tiene ningún efecto sobre la tolerancia a altas
temperaturas. Aquí mostramos que la infección por Wolbachia reduce la tolerancia de los huevos
de Aedes aegypti a altas temperaturas, y la gravedad del efecto depende de la cepa de Wolbachia.
Además, hemos determinado el rango de temperatura donde comienzan a ocurrir los efectos
perjudiciales sobre las infecciones por Wolbachia y dónde se pierden las infecciones, al menos
durante la etapa del huevo. Para las infecciones con wMelPop y wMel, la densidad de Wolbachia
disminuyó a partir de temperaturas de 25 a 35 ºC (media de 30 ºC) y de 26 a 36 ºC (media de 31
ºC) respectivamente, mientras que para wAlBB ocurrió en un rango de temperatura mucho mayor.
(30–40˚C, 35˚C significa). La mayor tolerancia de wAlbB al estrés por calor es consistente con
estudios previos en larvas de Aedes aegypti, pero la resolución incrementada en este experimento
proporciona una mejor estimación de las temperaturas máximas diarias que podrían afectar las
intervenciones de Wolbachia. En situaciones de campo, los rangos de temperatura en los que las
infecciones por Wolbachia se ven afectadas de manera adversa dependerán de la duración y el
momento del estrés por calor.

En nuestros experimentos de campo, encontramos efectos sustanciales del estrés por calor en la
incompatibilidad citoplásmica que podría limitar el potencial de wMel para invadir poblaciones
naturales durante los programas de control de enfermedades y persistir después de las
liberaciones. Cuando se criaron en sombra parcial, los machos infectados con WMel perdieron
parcialmente su capacidad para inducir incompatibilidad citoplásmica, mientras que las hembras
perdieron parcial o totalmente su capacidad para restablecer la compatibilidad cuando se cruzaron
con los machos infectados criados en el laboratorio. Las hembras infectadas criadas en sombra
parcial redujeron considerablemente la fertilidad en cruces con machos infectados del mismo
contenedor. La densidad de Wolbachia femenina se asoció positivamente con la eclosión del
huevo, de acuerdo con un estudio en Drosophila. Por lo tanto, parece que se necesitan altas
densidades para que las hembras restauren la compatibilidad con los machos infectados, pero la
densidad requerida para que los machos induzcan la incompatibilidad citoplásmica parece ser
menor. Las condiciones de estrés por calor en el campo podrían disminuir o incluso revertir la
ventaja reproductiva proporcionada por Wolbachia, lo que hace que la invasión sea un desafío,
especialmente cuando Wolbachia es de baja frecuencia, cuando su condición física en relación con
las personas no infectadas es relativamente más baja y donde es susceptible al estocástico.
Efectos relacionados con la densidad. Donde wMel ya se ha establecido en una población, la
reducción de la eclosión de los huevos en mosquitos infectados con wMel que se aparean entre sí
podría brindar la oportunidad de un aumento en la frecuencia de mosquitos no infectados, aunque
una vez que invadió áreas del norte de Queensland parece haber sido estable. Los costos de
acondicionamiento físico y la autoincompatibilidad entre los mosquitos infectados también podrían
tener efectos ecológicos inesperados; una disminución en la población de Aedes aegypti podría
llevar a cambios en la composición de las especies que podrían ser beneficiosos para los
esfuerzos de control de la enfermedad.

Aunque intentamos criar mosquitos en condiciones de temperatura realistas, nuestros

experimentos de campo solo serán relevantes para un subconjunto de criaderos naturales.
Proporcionamos abundante comida para acelerar y sincronizar el desarrollo larvario para facilitar
los cruces experimentales entre las cepas. Los tiempos de desarrollo de las larvas en la naturaleza
son variables y pueden superar los dos meses en condiciones competitivas. El aumento de la tasa
de desarrollo larvario en este experimento probablemente subestimó el efecto del estrés por calor;
los tiempos de desarrollo más largos aumentan la posibilidad de que las larvas experimenten una
ola de calor y el aumento de la duración del estrés por calor puede reducir aún más la densidad de
Wolbachia, aunque la densidad también puede recuperarse con el tiempo en ausencia de estrés
por calor. Las larvas infectadas con un nivel bajo de alimento tienen una densidad de Wolbachia
muy reducida cuando se crían a 26–32 ° C en comparación con 26 ° C, lo que indica que incluso
las temperaturas moderadas pueden reducir la densidad de Wolbachia cuando se combinan con el
estrés nutricional (consulte la Figura S4 de Ross y Hoffmann). Los efectos del estrés por calor en la
densidad de Wolbachia pueden trasladarse a la siguiente generación, lo que puede llevar a una
reducción del bloqueo del virus o la incompatibilidad citoplásmica en una generación después de
una ola de calor. En nuestros experimentos de laboratorio, los huevos se mantuvieron durante una
semana antes de la eclosión, pero en el campo la etapa del huevo puede ser más corta o más
larga. Durante la estación seca, los huevos pueden permanecer en reposo durante meses antes de
incubar, lo que aumenta su exposición potencial a altas temperaturas. Las infecciones por
Wolbachia reducen la viabilidad de los huevos de Aedes aegypti en reposo y, a temperaturas
elevadas, estos costos de acondicionamiento físico probablemente se exacerbarán.

Una limitación adicional de nuestro experimento de campo es que los contenedores utilizados para
la cría de larvas no se colonizaron de forma natural. Aedes aegypti parece preferir poner huevos en
áreas sombreadas, pero también utiliza contenedores a la luz del sol. Las infecciones por
Wolbachia también pueden afectar la preferencia térmica; la Drosophila melanogaster adulta
infectada con Wolbachia prefiere temperaturas más bajas que las moscas no infectadas. Sin
embargo, los datos de los contenedores centinela indican que los mosquitos infectados pondrán
huevos en recipientes colocados a la luz solar directa. Los cubos centinela y los pequeños
contenedores ubicados dentro de la zona de liberación de wMel en Cairns fueron todos
colonizados por Aedes aegypti, a pesar de que algunos de ellos experimentaron temperaturas
similares a los contenedores experimentales mantenidos a una sombra del 50% (Fig. S2). Aedes
aegypti tiende a poner huevos durante las partes más frescas del día y, por lo tanto, puede ser
incapaz de discriminar contra los hábitats que alcanzan altas temperaturas máximas más tarde. A
diferencia de los mosquitos adultos, las etapas inmaduras no pueden escapar fácilmente del estrés
por calor ya que no pueden moverse más allá del contenedor. Dado que la densidad de Wolbachia
y la eclosión de los huevos en los mosquitos infectados con wMel parecen depender en gran
medida del nivel de sombra, los estudios de temperatura y productividad de los hábitats larvarios
podrían realizarse en áreas de liberación si existe preocupación sobre los impactos del estrés por
calor en un área de liberación.

A pesar de los efectos sustanciales sobre la densidad y fertilidad de Wolbachia en nuestros

experimentos, los mosquitos Aedes aegypti infectados con wMel se han establecido con éxito en
Cairns y Townsville, Australia y Brasil, y la infección persiste en una alta frecuencia en la mayoría
de los lugares. En las áreas donde las liberaciones tuvieron éxito, los costos del estrés por calor
observados aquí claramente no fueron lo suficientemente prevalentes o lo suficientemente graves
como para evitar el establecimiento de wMel. Una vez que una infección por Wolbachia ha
alcanzado una alta frecuencia en una población, puede mantenerse alta a menos que los costos de
acondicionamiento físico sean extremos, como es el caso de wMelPop. Sin embargo, el estrés por
calor probablemente disminuirá la tasa de invasión y propagación de Wolbachia, aumentando el
número de mosquitos requeridos para las liberaciones y, potencialmente, creando una situación
inestable alrededor de los puntos críticos de invasión que se deben superar para que Wolbachia
pueda invadir. El estrés por calor podría explicar parcialmente por qué las frecuencias de infección
han persistido en niveles intermedios en algunos suburbios y también puede contribuir a la
fidelidad a la transmisión materna incompleta de wMel observada en Cairns, dado que algunos
individuos fueron eliminados de sus infecciones por Wolbachia en nuestros experimentos. w La
liberación de mosquitos infectados fuera de Australia en lugares donde las temperaturas diarias
máximas son más cálidas puede ser más difícil. La reducción de la densidad de Wolbachia también
puede reducir la protección contra virus proporcionada por Wolbachia, incluso si las frecuencias de
infección permanecen altas en una población, aunque no demostramos este efecto directamente.
La cepa de wMel ha mantenido su susceptibilidad al estrés por calor durante siete años después
del despliegue en el campo en Australia, lo que indica que es posible que se necesiten cepas
alternativas en áreas donde wMel tiene dificultades para establecerse o donde el bloqueo viral es
insuficiente.

Figuras

Fig 1. Ciclos de temperatura y las proporciones de la eclosión del huevo resultantes de cruces en
el primer experimento de campo. (A) Ciclos de temperatura experimentados en cubetas (8 L) desde
el 10 hasta el 17 de enero de 2018. (BC) Proporciones de cruces de huevos con adultos infectados
con wMel cuando las larvas se criaron con un 99% de sombra (B) o un 50% de sombra (C) En
cubos. Todas las barras de error son medianas con rangos intercuartiles. ** P <0.01, *** P <0.001
por la prueba U de Mann-Whitney.

Fig. 2. Densidad de Wolbachia de (A) Hembras y (B) machos criados en diferentes tipos de
contenedores en dos niveles de sombra en el primer experimento de campo. Todas las barras de
error son medianas con rangos intercuartiles. *** P <0.001 por la prueba de Kruskal-Wallis.

Fig 3. Ciclos de temperatura y las proporciones resultantes de la eclosión de los huevos de las
cruces en el segundo experimento de campo. (A) Ciclos de temperatura experimentados en
cubetas (8 L) y contenedores pequeños (400 ml) desde el 26 de enero hasta el 1 de febrero de
2018. (B) Proporciones de cruces de huevos con adultos infectados con wMel cuando las larvas se
criaron en cubos bajo 50% de sombra. Todas las barras de error son medianas con rangos
intercuartiles. * P <0.05, *** P <0.001 por prueba U de Mann-Whitney.

Fig 4. Densidad de Wolbachia de (A) Hembras y (B) machos criados en diferentes tipos de
contenedores en dos niveles de sombra en el segundo experimento de campo. También se
muestra la cantidad de mosquitos de cada tratamiento que fueron positivos para Wolbachia. Todas
las barras de error son medianas con rangos intercuartiles. *** P <0.001 por la prueba de Kruskal-
Wallis.

Fig. 5. La relación entre la densidad de Wolbachia hembra y la proporción de eclosión de los

huevos en cruces con hembras y machos infectados con WM criados en las mismas condiciones
en el campo. Los adultos criados en cubos (8 l) o recipientes pequeños (400 ml) mantenidos a 50%
o 99% de sombra se cruzaron con individuos del mismo recipiente de crianza antes de que las
hembras se aislaron para medir la tasa de eclosión de huevos y la densidad de Wolbachia.

Fig. 6. Proporciones de eclosión de huevos (A) y densidad de Wolbachia en hembras (B) y machos
(C) adultos después de que los huevos fueron expuestos a una amplia gama de ciclos de
temperatura durante una semana. Cada punto en (A) representa la proporción de huevos
eclosionados en un tubo replicado, con líneas continuas que indican la mediana de las
proporciones de la eclosión de huevos. Cada punto en (B) y (C) representa la densidad de
Wolbachia de un solo adulto. Los asteriscos por encima de los ciclos de temperatura indican el
número de individuos que fueron negativos para Wolbachia del número total probado, con el color
correspondiente al tipo de infección de Wolbachia.

Fig. 7. Proporciones de eclosión de huevos (A) y densidad de Wolbachia en hembras (B) y machos
(C) adultos después de que los huevos fueron expuestos a ciclos de temperatura estresante
durante una semana. Cada punto en (A) representa la proporción de huevos eclosionados en un
tubo replicado, con líneas continuas que indican la mediana de las proporciones de la eclosión de
huevos. Cada punto en (B) y (C) representa la densidad de Wolbachia de un solo adulto. Los
asteriscos por encima de los ciclos de temperatura indican el número de individuos que fueron
negativos para Wolbachia del número total probado, con el color correspondiente al tipo de
infección de Wolbachia.