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Centro de Biotecnología, Vol. 4 Nro. 1.

2015 61

DETECCIÓN DEL VIRUS DE NEWCASTLE EN GALLINAS CRIOLLAS EN LA


PROVINCIA DE LOJA
DETECTION OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS IN NATIVE HENS IN LOJA PROVINCE
1. Carrera de Medicina Veterinaria. Universidad Nacional de Loja.
Ciudadela Guillermo Falconi “La Argelia”- PBX 072547252 – Casilla
Janeth E. Armijos Montaño1 Letras ¨S¨, Loja-Ecuador
Agusto Luzuriaga Neira2 2. Universidad de Porto. Porto-Portugal.
Fredy Cueva Castillo3 3. Agrocalidad. Ministerio de Agricultura, Ganaderia, Acuacultura y Pes-
Galo Escudero Sánchez4 ca. Loja. chazo1970@hotmail.com
Loidy Zamora Gutierrez2 4. Centro de Biotecnología. Universidad Nacional de Loja. Ciudadela
Guillermo Falconi ¨La Argelia¨- PBX 072547252 – Casilla Letras ¨S¨,
Gustavo Villacís Rivas1* Loja-Ecuador. loydizamorag@gmail.com
* Autor para correspondencia

Resumen
La enfermedad de Newcastle es causada por cepas virulentas de paramixovirus tipo1 (PMVA-I). El
objetivo de este estudio fue determinar la presencia del virus en las parroquias de Cazaderos, Garza
Real, Mangahurco, Paletillas y Bolaspamba en el cantón Zapotillo en la provincia de Loja. Se tomaron
350 muestras de suero sanguíneo y 140 muestras de hisopados cloacales, provenientes de aves apa-
rentemente sanas y que presentaron signos clínicos de la enfermedad. Las muestras de suero fueron
analizadas Kit de ELISA IDEXX, de las cuales un 49,7 % de las mismas resultaron positivas. A partir
de los hisopados se realizó el aislamiento viral en huevos embrionados de 9 a 11 días de desarrollo
libres de patógenos específicos (LPE). Se realizó hemoaglutinación en el fluido alantoideo para com-
probar la presencia del virus. A partir del líquido alantoideo se extrajo ARN y posteriormente se les
realizó una RT-PCR con cebadores específicos, donde se obtuvo productos de 362 pb. La presencia
viral se comprobó en 10,71% de las muestras. Para realizar la identificación de cepas patogénicas se
realizó una segunda RT-PCR en un solo paso con cebadores específicos, donde se obtuvo amplifica-
ciones de 254. Este es el primer estudio de la detección molecular del virus Newcastle en el Ecuador,
lo que contribuye al manejo de la enfermedad.
Palabras claves: Virus de Newcastle, ELISA, aislamiento viral, RT-PCR.

Abstract
The Newcastle Disease is causing by virulent strains of paramyxoviruses type 1(PMVA-I). The aim
of this study was to determine the presence of the virus in the Loja province. The places survey were
Cazaderos, Garza Real, Mangahurco, Paletillas and Bolaspamba. 350 serum and 140 cloacael swabs
samples were taken, from apparently healthy birds and showed disease clinical signs. Serum samples
were analyzed by IDEXX ELISA kit, which 49.7 % of them were positive. From the swabs it was per-
formed virus isolation in eggs specific pathogen free (SPF) of 9-11 days of development. The Hema-
gglutination probe was performed in the allantoic fluid for determined virus presence. From allantoic
fluid RNA was extracted and subsequently RT-PCR was made with specific primers, products of 362
bp were obtained. Viral presence was found in 10.71% of the samples. To make identification of patho-
genic strains a second RT-PCR was performed in a single step with specific primers, where amplifi-
cations of 254 bp were obtained. This is the first study of the molecular detection of Newcastle virus in
Ecuador, contributing to disease management.
Keywords: Newcastle virus disease, ELISA, viral isolation, RT-PCR.

Recibido: febrero 08 de 2015 Aprobado: mayo 27 de 2015


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PROVINCIA DE LOJA

Introducción ha descrito la aparente resistencia de estas


aves a la enfermedad, pero se reconoce que
La industria avícola en el Ecuador aporta
actúan como importantes portadores y fuen-
aproximadamente el 23% del valor de la pro-
tes de infección para la avicultura comercial
ducción agropecuaria nacional. Constituye un
(Senne, 2004).
componente básico en la seguridad alimen-
taria. En el catón Zapotillo de la provincia de El objetivo de este estudio fue determinar la
Loja existen pequeños productores que crían presencia del virus en las parroquias de Ca-
aves en sus propiedades bajo un sistema tra- zaderos, Garza Real, Mangahurco, Paletillas
dicional (traspatio). Donde el control sanitario y Bolaspamba en el cantón Zapotillo en la
es carente, así como la existencia de progra- provincia de Loja. Lo que posibilitará esta-
mas de bioseguridad. Estos constituyen fac- blecer un control epidemiológico a través de
tores de riesgo para el desarrollo de enferme- planes de prevención. Esto contribuirá a evi-
dades (Villacís et al., 2014). tar la diseminación de la enfermedad a otros
sectores, favoreciendo a la sanidad animal y
Una de las enfermedades más importantes
a la economía de los productores.
que afecta al sector avícola en el cantón Za-
potillo es la Enfermedad de Newcastle (EN)
causada por Newcastle disease virus (NDV)
Materiales y métodos
que es uno de los patógenos de mayor impor-
tancia social y económica en la industria aví- Se tomaron 140 muestras de hisopados cloa-
cola (Villacís et al., 2014). Este virus produce cales y 350 muestras de suero sanguíneo de
una elevada morbilidad y mortalidad, presen- gallinas criollas aparentemente sanas y con
ta un amplio rango de hospedero, afectando signos de la enfermedad en el cantón Zapoti-
a más de 240 especies aviares (OIE, 2012). llo. El catón está ubicado en la parte occiden-
tal de la provincia de Loja, a 240 km aproxi-
Newcastle disease virus pertenece a la fa-
madamente, a 835 metros de altura sobre el
milia Paramyxoviridae, del género Aluvavi-
nivel del mar en la zona alta y a 182 metros de
rus (ICTV, 2014). Existen tres tipos de cepas:
altura sobre el nivel del mar en la zona baja.
lentogénica o leve, mesogénica o modera-
Se recolectaron muestras de las parroquias:
da, y velogénica o muy virulenta. Las cepas
Cazaderos, Garza Real, Limones Paletillas,
lentogénicas cursan con signos respiratorios
Bolaspamba y Mangahurco.
leves y caída de la postura en las aves más
sensibles. Las cepas mesogénicas dan lu- Las muestras se tomaron en etapas suce-
gar a formas clínicas agudas, cursando con sivas, para lo cual se utilizó como guía el III
sintomatología respiratoria y las alteraciones Censo Nacional Agropecuario realizado en el
nerviosas no son frecuentes. Las cepas ve- 2000, en el que existen 2266 Unión de Pe-
logénicas dan lugar a formas clínicas sobre- queños Agricultores.
agudas, la morbilidad puede llegar a alcan-
zar valores del 100% y la mortalidad puede Detección de anticuerpos
superar el 50% en aves adultas y el 90% en La detección de anticuerpos en las muestras
aves jóvenes. El cuadro clínico es de corta de suero sanguíneo se realizó mediante ELISA
duración, aparece bruscamente y se propaga con el Kit Newcastle Disease Virus Antibody
con rapidez (OIE, 2012). (IDEXX). En la cual se reportó como muestras
Como medida de control de la enfermedad se seropositivas a todas las aves con títulos supe-
ha establecido la vacunación rutinaria contra riores a 396 según las indicaciones del fabri-
el virus de Newcastle en todas las aves co- cante. Se realizó la prueba x2 para determinar
merciales, sin embargo, las aves de traspatio si existen diferencias significativas entre positi-
no son sometidas a este procedimiento por vos y negativos utilizando el paquete estadísti-
razones socio-culturales y económicas. Se co Infostat (Di Rienzo et al., 2011).

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Aislamiento del virus a partir de hisopados y Alle, mientras que para cepas virulentas
cloacales del virus se utilizó ALLs y AVLe (Wang et al.,
Los hisopados cloacales se inocularon en 2001). Las reacciones de PCR se llevaron a
embriones de pollo de 9-11 días de desarrollo, cabo con los mismos cebadores siguiendo las
libre de patógenos específicos (LPE). Se uti- condiciones descritas por Wang et al., 2001.
lizaron a razón de 10 embriones por muestra Los productos de PCR fueron visualizados en
geles de agarosa 1,5%.
y se inocularon por la vía de la cavidad alan-
toidea con volumen de 0.25 mL por embrión.
Los embriones fueron incubados a 370C y
diariamente se chequeó su viabilidad. A las 72 Resultados
horas post-inoculación, se cosechó el líquido
Detección de anticuerpos
alantoideo y se realizaron dos pases ciegos
en embrión de pollo. Posteriormente a partir Un total de 174 muestras fueron seropositivas
del líquido alantoideo se realizó la prueba de mediante el método de ELISA, lo que representa
hemaglutinación (OIE, 2012). un porcentaje del 49,7%, mientras que 176
resultaron seronegativas lo que representa
Extracción de ARN Técnica Reacción en Cade- el 50,3% de las muestras colectadas. En la
na de la Polimerasa – Reverso Transcriptasa figura 1 se puede observar que la parroquia
con mayor presencia de anticuerpos fue
La extracción de ARN se realizó mediante el Ki Paletillas, así como la de menor presencia fue
Viral RNA/DNA mini Kit (Invitrogen). Se realizó la parroquia Bolaspamba.
la cuantificación del ARN viral en un equipo
Nano Drop (2000). La RT-PCR se llevada a En el Cuadro 1 se muestran los resultados
cabo con SuperScript® III One-Step RT-PCR de la prueba x2 donde se observa que
System with Platinum® Taq DNA Polymerase solamente existen diferencias significativas
(Invitrogen). Los cebadores utilizados para en la Parroquia Paletillas entre el número de
determinar la presencia de NDV fueron ALLs muestras positivas y negativas.

Figura 1. Presencia de anticuerpos contra el Virus de Newcastle en gallinas criollas en parroquias del cantón Zapotillo.

Aislamiento del virus a partir de hisopados Los resultados del aislamiento viral después
cloacales de 3 pases sucesivos realizados en embrión
de pollo revelaron que en 15 de las muestras

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Parroquias Positivos Negativos X2 p-value 0,05

Garza Real 37 35 0.067 0.7958

Limones 23 37 2.6578 0.103

Cazaderos 22 26 0.2544 0.614

Mangahurco 26 31 0.3297 0.5658

Bolaspamba 21 32 1.877 0.1707

Paletillas 45 15 13.1606 0.0002

Cuadro 1. Comparación de los casos positivos y negativos por en las parroquias del cantón Zapotillo mediante prueba x2.

evaluadas se evidencia multiplicación viral, sugiere una hipótesis de circulación viral


lo que fue determinado por mortalidad en estas aves con clínica compatible. Esto
embrionaria con lesiones similares a las puede atribuirse a factores como el sistema
producidas por NDV. Dichas muestras de manejo de producción tradicional, porque
resultaron positivas para la prueba de tienen pocas medidas sanitarias las cuales
hemaglutinación.
favorecen la diseminación del virus; la continua
exposición a aves silvestres; las deficiencias
Determinación Newcastle di-
de la presencia
de la nutrición; la ausencia de control de la
sease virus mediante técnica Reacción en Cade-
enfermedad a través de la vacunación y el
na de la Polimerasa – Reverso Transcriptasa
contacto de aves no infectadas con aves
Se confirmaron 15 muestras positivas mediante portadoras de patógenos.
la RT-PCR con cebadores específicos para
Newcastle disease virus lo que representa En la parroquia Paletillas se presentan
10,71%. Donde se obtuvo productos de diferencias significativas entre el número
amplificación 362 (bp) en las parroquias de seropositivos y seronegativos, siendo
de Cazaderos, Garza Real, Mangahurco, el porcentaje de positivos de 12,8%. Esta
Paletillas y Bolaspamba. La RT-PCR para parroquia es un lugar muy comercial, en
determinar cepas patogénicas arrojó que 5 donde campesinos de las distintas cercanías e
de las muestras son virulentas con cebadores incluso de Perú, acuden a este lugar a vender
específicos, en las parroquias Cazaderos,
sus animales, siendo estas aves de dudosa
Garza Real, Paletillas y Bolaspamba.
procedencia que pueden ser portadores de la
enfermedad (Villacís et al., 20014).

Discusión Otra de las parroquias en las que se encontró


alta sero-prevalencia fue Garza Real (10,5%).
Las aves que presentaron títulos mayores En cambio este lugar es preferido por aves
a 396 se consideran valores altos lo que
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la migratorias como garzas las cuales han virulentas del virus.


sido informadas como una de las especies
silvestres portadoras del virus. Las aves
domésticas pueden ser infectadas a través Referencias bibliográficas
del contacto con las heces fecales de las aves Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.
migratorias (Severino, 2007). G., Gonzalez, L., Tablada y M., Robledo, C.
W. 2011. Grupo InfoStat, FCA, Universidad
Mediante la técnica de RT-PCR se logró Nacional de Córdoba, Argentina. URL http://
determinar la presencia del virus de Newcastle a www. infostat. com. ar.
partir de muestras de campo, previo aislamiento International Committee on Taxonomy of
viral donde se evidencian amplificaciones de Viruses (ICTV). 2014. http://ictvonline.org/
la talla esperada según los descrito por Wang virustaxonomy.asp
et al., 2001. La ventaja de disponer de una Miller, P.J., Decanini, E.L. y Afonso, C.L. 2010.
herramienta de diagnóstico como RT-PCR Newcastle disease: evolution of genotypes
permite revelar de forma rápida y específica and the related diagnostic challenges. Infect
pequeñas concentraciones de ARN viral, Genet Evol. 10: 26-35.
independientemente de la viabilidad del mismo. Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE).
2012. Manual Terrestre de la OIE. Enfermedad
El hecho de poder conocer si la cepa circulante de Newcastle
es patogénica o no es de gran importancia, Severino J. 2007. Migracao de aves: Influenza
lo que está relacionado con lo descrito aviaria e a doenca de Newcastle no Brasil.
por diversos autores quienes proponen la En: Conferencia APINCO 2007 de Ciencia e
detección específica y simultánea de las Tecnologia Avicola. Porto Alegre, Brasil.
diferentes cepas virales (Tiwari et al., 2004; Senne, D. A., King, D. J. y Kapczynski, D. R. 2004.
Zhang et al., 2010; Miller et al., 2010). Este es Control of Newcastle disease by vaccination.
el primer estudio de la detección molecular Dev Biol (Basel).119:165-70.
del virus Newcastle en el Ecuador, lo que Tiwaria, A. K., Katariaa, R. S., Nanthakumara,
contribuye de manera positiva al manejo de T., Dashb, B. B. y Desa, G. 2004. Differential
la enfermedad. detection of Newcastle disease virus strains
by degenerate primers based RT-PCR.
Comparative Immunology, Microbiology &
Conclusiones Infectious Diseases. 27: 163–169.
Villacís, G., Escudero, G., Cueva, F. y Luzuriaga,
La parroquia con mayor sero-prevalencia en A. 2014. Aislamiento del virus de la enfermedad
el cantón Zapotillo es Paletillas. de Newcastle en zonas rurales del sur del
Ecuador. CEDAMAZ. 4: 86-90.
Se determinó la presencia del virus de Wang, Z., Vreede, F. T., Mitchell, J. O. y Viljoen,
Newcastle en las parroquias de Cazaderos, G. J. 2001. Rapid detection and differentiation
Garza Real, Mangahurco, Paletillas y of Newcastle disease virus isolates by a triple
Bolaspamba en el cantón Zapotillo en la one-step RT-PCR. Onderstepoort J Vet Res.
68:131-4.
provincia de Loja.

Se obtuvo el aislamiento de quince cepas del


virus de Newcastle, cinco de las cuales son
patogénicas.

Se optimizó la técnica RT-PCR con cebadores


específicos para la detección de cepas
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