La secuenciaci�n del ADN es un conjunto de m�todos y t�cnicas bioqu�micas cuya

finalidad es la determinaci�n del orden de los nucle�tidos (A, C, G y T) en un

oligonucle�tido de ADN. La secuencia de ADN constituye la informaci�n gen�tica
heredable que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos (de
procariotas, de eucariotas en el n�cleo celular, y en los pl�smidos, en la
mitocondria y en cloroplastos de las plantas).1? As� pues, determinar la secuencia
de ADN es �til en el estudio de la investigaci�n b�sica de los procesos biol�gicos
fundamentales, as� como en campos aplicados, como la investigaci�n forense. Adem�s,
se puede utilizar la secuenciaci�n del ADN para conocer las mutaciones som�ticas,
como las sustituciones de bases, generadas entre distintos organismos. El
desarrollo de la secuenciaci�n del ADN ha acelerado significativamente la
investigaci�n y los descubrimientos en biolog�a. Las t�cnicas actuales permiten
realizar esta secuenciaci�n a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia
para proyectos de secuenciaci�n a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros
proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la colaboraci�n investigadora a
escala mundial, han establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de
animales, plantas y microorganismos. A pesar de las distintas t�cnicas que permiten
secuenciar el ADN, no siempre se puede llegar a conocer el genoma completo de los
organismos. Esto, puede llevar a errores en la reconstrucci�n de los linajes y en
la estimaci�n del tipo de mutaciones y del n�mero de mitosis generadas.

Gr�fico de una secuencia de ADN obtenido por electroforesis capilar

(electroferograma).

�ndice
1 Inicios
2 Secuenciaci�n de Maxam-Gilbert
3 M�todos de terminaci�n de la cadena
3.1 Secuenciaci�n por terminador fluorescente
3.2 Secuenciaci�n alelo-espec�fica por bisulfito
4 Pirosecuenciaci�n
5 Automatizaci�n y preparaci�n de las muestras
6 Estrategias de secuenciaci�n a gran escala
7 Nuevos m�todos de secuenciaci�n
7.1 Secuenciaci�n de alto rendimiento o "next-generation"
7.2 Secuenciaci�n de una �nica mol�cula de ADN
7.3 Otras tecnolog�as de secuenciaci�n
8 Principales hitos en la secuenciaci�n del ADN
9 V�ase tambi�n
10 Referencias
11 Enlaces externos
Inicios
Durante treinta a�os la mayor parte de la secuenciaci�n de ADN se llev� a cabo con
el m�todo de terminaci�n de la cadena desarrollado por Frederick Sanger y
colaboradores, en 1975.2?3? Antes del desarrollo de m�todos r�pidos de
secuenciaci�n del ADN a principios de los 70 por Sanger en Inglaterra y Walter
Gilbert y Allan Maxam en Harvard,4?5? se utilizaban varios m�todos de laboratorio.
Por ejemplo, en 19736? Gilbert y Maxam publicaron una secuencia de 24 pares de
bases utilizando un m�todo conocido como "de punto corrido" (wandering spot).

La secuenciaci�n del ARN, que por razones t�cnicas es m�s sencilla de llevar a cabo
que la del ADN, se desarroll� con anterioridad a la del ADN. El mayor hito en la
secuenciaci�n del ARN, que data de la era previa al ADN recombinante, es la
secuencia del primer gen completo y del genoma completo del Bacteri�fago MS2,
identificado y publicado por Walter Fiers y colaboradores de la Universidad de
Gante.7?8?

Secuenciaci�n de Maxam-Gilbert
En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un m�todo para secuenciar
ADN basado en la modificaci�n qu�mica del ADN y posterior escisi�n en bases
espec�ficas9? Aunque Maxam y Gilbert publicaron su secuenciaci�n qu�mica dos a�os
antes del trascendental art�culo de Sanger y Coulson sobre su m�todo de
secuenciaci�n "m�s-menos",10?11? la secuenciaci�n de Maxam y Gilbert r�pidamente se
hizo m�s popular hasta que se pudo utilizar ADN directamente, mientras que el
m�todo inicial de Sanger requer�a que cada comienzo de lectura fuera clonado para
producir un ADN de cadena simple. No obstante, con el desarrollo y mejora del
m�todo de terminaci�n de la cadena (ver m�s adelante), la secuenciaci�n de Maxam y
Gilbert ha quedado en desuso debido a su complejidad t�cnica, el uso extensivo de
productos qu�micos peligrosos y dificultades para escalarla. Adem�s, a diferencia
del m�todo de terminaci�n de la cadena, los reactivos que se usan en el m�todo de
Maxam y Gilbert no se pueden adaptar para utilizarse en un kit biol�gico est�ndar.

En resumen, el m�todo requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la

purificaci�n del fragmento de ADN que se desea secuenciar. El tratamiento qu�mico
genera rupturas en una peque�a proporci�n de uno o dos de los cuatro nucle�tidos en
cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Los agentes qu�micos utilizados
en cada caso son: DMS (G), �cido f�rmico (A+G), hidrazina (C+T) e hidrazina m�s
sales (C).De ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final
marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada mol�cula.

Los fragmentos posteriormente se separan por tama�o mediante electroforesis en gel,

separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero
una al lado de la otra. El gel utilizado presenta condiciones desnaturalizantes, y
un contenido en poliacrilamida que var�a entre un 6 y un 20 %. Para visualizar los
fragmentos generados en cada reacci�n, se hace una autoradiograf�a del mismo, lo
que proporciona una imagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los
fragmentos marcados con el radiois�topo, a partir de las cuales se puede inferir la
secuencia.

Conocido en ocasiones como "secuenciaci�n qu�mica", este m�todo se origin� en el

estudio de las interacciones entre ADN y prote�nas (huella gen�tica), estructura de
los �cidos nucleicos y modificaciones epigen�ticas del ADN, y es en estos campos
donde a�n tiene aplicaciones importantes.

M�todos de terminaci�n de la cadena

Art�culo principal: M�todo de Sanger

Parte de un gel de secuenciaci�n con marcaje radiactivo.

Mientras que el m�todo de secuenciaci�n qu�mica de Maxam y Gilbert y el m�todo m�s-
menos de Sanger y Coulson eran �rdenes de magnitud m�s r�pidos que los m�todos
previos, el m�todo de terminaci�n de la cadena desarrollado por Sanger era incluso
m�s eficiente y r�pidamente se convirti� en el m�todo de elecci�n. La T�cnica de
Maxam-Gilbert requiere el uso de productos qu�micos altamente t�xicos y grandes
cantidades de ADN marcado radiactivamente, mientras que el m�todo de terminaci�n de
la cadena utiliza pocos reactivos t�xicos y cantidades menores de radiactividad. El
principio clave del m�todo de Sanger es el uso de didesoxinucle�tidos trifosfato
(ddNTPs) como terminadores de la cadena de ADN.

El m�todo cl�sico de terminaci�n de la cadena o m�todo de Sanger necesita una hebra

molde de ADN de cadena sencilla, un cebador de ADN, una ADN polimerasa con
nucle�tidos marcados radiactivamente o mediante fluorescencia y nucle�tidos
modificados que terminan la elongaci�n de la cadena de ADN. La muestra de ADN se
divide en cuatro reacciones de secuenciaci�n separadas que contienen los cuatro
desoxinucle�tidos est�ndar (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) y una ADN polimerasa. En
cada reacci�n se a�ade solo uno de los cuatro didesoxinucle�tidos (ddATP, ddGTP,
ddCTP, o ddTTP). Estos didesoxinucle�tidos terminan la elongaci�n de la cadena al
carecer un grupo 3'-OH que se necesita para la formaci�n del enlace fosfodi�ster
entre dos nucle�tidos durante la elongaci�n de la cadena de ADN. La incorporaci�n
de un didesoxinucle�tido en la cadena naciente de ADN termina su extensi�n, lo que
produce varios fragmentos de ADN de longitud variable. Los didesoxinucle�tidos se
a�aden a concentraciones lo suficientemente bajas como para que produzcan todas las
posibilidades de fragmentos y al mismo tiempo sean suficientes para realizar la
secuenciaci�n.

Los fragmentos de ADN sintetizados y marcados de nuevo son desnaturalizados por

calor y separados por tama�o (con una resoluci�n de un solo nucle�tido) mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida - urea. Cada una de las cuatro reacciones
de s�ntesis se corre en carriles individuales (Carril A, T, G y C) y se visualizan
las bandas de ADN mediante autoradiograf�a o luz ultravioleta, y la secuencia de
ADN se puede leer directamente a partir de la placa de rayos X o de la imagen del
gel. En la imagen de la derecha, la pel�cula de rayos-X se expuso directamente al
gel de modo que las bandas oscuras corresponden a los fragmentos de ADN de
diferentes longitudes. Una banda oscura en un carril indica un fragmento de ADN que
es el resultado de una terminaci�n de la cadena tras la incorporaci�n de un
didesoxinucle�tido (ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP). El nucle�tido terminal puede
ser identificado de acuerdo al didesoxinucle�tido que se a�adi� en la reacci�n que
dio lugar a esa banda. Las posiciones relativas entre las cuatro calles se utilizan
entonces para leer (de abajo a arriba) la secuencia de ADN como se indica.

Los fragmentos de ADN se pueden marcar utilizando radiactividad o fluorescencia en

el cebador (1), en la nueva cadena de ADN con dNTP marcado, o con un ddNTP marcado.
Existen algunas variaciones t�cnicas del m�todo de secuenciaci�n de terminaci�n de
la cadena. En un m�todo, los fragmentos de ADN son marcados con nucle�tidos
marcados con f�sforo radiactivo. Como alternativa se puede utilizar un cebador
marcado en el extremo 5' mediante un colorante fluorescente.

Se siguen necesitando cuatro reacciones, pero los fragmentos de ADN marcados con
colorantes se pueden leer utilizando un sistema �ptico, lo que facilita un an�lisis
m�s r�pido y econ�mico y su automatizaci�n. Esta variante se conoce como
"secuenciaci�n mediante colorantes acoplados al cebador" (dye-primer sequencing).
El �ltimo avance de L Hood y colaboradores12?13? desarrollando ddNTPs y cebadores
con marcaje fluorescente se�ala el marco para una secuenciaci�n de ADN automatizada
y de alto rendimiento.

Escala de secuencia mediante secuenciaci�n radiactiva comparada con m�ximos de

fluorescencia.
Los diferentes m�todos de terminaci�n de la cadena han simplificado en gran medida
la cantidad de trabajo y planificaci�n necesaria para la secuenciaci�n de ADN. Por
ejemplo, el kit "Sequenase" de la casa USB Biochemicals, basado en el m�todo de
terminaci�n de la cadena contiene la mayor�a de los reactivos necesarios para la
secuenciaci�n, pre-divididos en al�cuotas y listos para usar. Se pueden dar algunos
problemas de secuenciaci�n con el m�todo de Sanger, como uniones no espec�ficas del
cebador al ADN, que afectan a la correcta interpretaci�n de la secuencia de ADN.
Adem�s tambi�n puede afectar a la fidelidad de la secuencia obtenida estructuras
secundarias internas de la cadena de ADN molde o ARN que pueda actuar de cebador al
azar. Otros contaminantes que pueden afectar a la reacci�n son el ADN ex�geno o
inhibidores de la ADN polimerasa.