Guia de Analisis Tissular III

Facultad de Ciencias de la Salud
Escuela de Tecnología Médica.

Especialidad De Morfofisiopatología y Citodiagnóstico
MANUAL DE LABORATORIO DE ANALISIS TISULAR III
TM. Marjorie Castro Herrera

TM. Cecilia Leiva
TM. Claudio Bustamante
TM. Ambart Covarrubias Cisterna
CONCEPCIÓN- SANTIAGO
CHILE
2016
Carrera de Tecnología Médica, mención Morfofisopatología y Citodiagnóstico
Asignatura Análisis Tisular III
Índice
1. Preparación de portaobjetos y corte de material

2. Preparación de portaobjetos y corte de material
3. Almacenamiento de inmunoreactivos y alícuotado de AC
4. Patrones de marcación y artefactos de técnicas
5. Curva de titulación y demostración de IHQ
6. Técnicas de Recuperación Antigénica
7. IHQ Tumores indiferenciados
8. Aplicación de IHQ para Cáncer Gástrico
9. Aplicación de IHQ para Cáncer de mama
10. Aplicación de IHQ para cáncer pulmonar y de próstata
11. Aplicación de IHQ en Riñón.
12. Aplicación de IHQ en tumores neuroendocrinos
13. Aplicación de IHQ en linfomas
14. Aplicación IFI
15.Automatización
16. Anexos
- Soluciones de uso habitual
- Algoritmos para realizar diagnóstico diferencial de neoplasias
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PRACTICO I
Preparación de portaobjetos y corte de material
1.- Silanizado de Portaobjetos. Cada estudiante deberá silanizar 1 caja de porta objetos.
Protocolo:
1. Lavado en Alcohol Clorhídrico al 2% (4 minutos)

2. Lavado en H2Od (estilar bien antes del siguiente paso)
3. Acetona I (2 minutos)
4. Acetona II (2 minutos)
5. Silano al 2% en Acetona Pura (2 minutos)
8. Estilar y secar con aire caliente (para evitar manchas).
9. Dejar reposar en estufa a 60ºC (1 hora)
Nota: cuando los portaobjetos comienzan a mancharse con gotitas de color blanco, es porque
alguna de las acetonas se hidrato, por este motivo, se recomienda renovar los reactivos.
2.- Corte de casos para estudio inmunohistoquimico. Cada corte de para IHQ, debe por
obligación ir acompañado de su respectiva lámina de Hematoxilina- Eosina.
H- E
Caso
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PRACTICO II
Preparación de portaobjetos y corte de material
1.- Silanizado de Portaobjetos. Cada estudiante deberá
Protocolo:
1. Lavado en Alcohol Clorhídrico al 2% (4 minutos)

2. Lavado en H2Od (estilar bien antes del siguiente paso)
5. Silano al 2% en Acetona Pura (2 minutos)
8. Estilar y secar con aire caliente (para evitar manchas).
9. Dejar reposar en estufa a 60ºC (1 hora)
Nota: cuando los portaobjetos comienzan a mancharse con gotitas de color blanco, es porque
alguna de las acetonas se hidrato, por este motivo, se recomienda renovar los reactivos.
2.- Corte de casos para estudio inmunohistoquimico.
1.- Los cortes deben realizarse de 3 a 5 micras, dependiendo el tejido que sea. Además todas las
muestras deben ser cortadas con guantes.
- Siempre se debe trabajar con una muestra control
3. Discusión de paper: “Cancer and Leukemia Group B Pathology Committe Guidelines for Tissue
Microarray Construction representing Multicenter Prospective Clinical Trial Tissues”
o Conocer la utilización de los Tissue Microarray.

o Analizar gráficos y resultados.
o Conclusiones de la utilidad de los Tissue Microarray.
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PRACTICO III
Almacenamiento de inmunoreactivos y alícuotado de AC
1.- Alicuotar los anticuerpos en tubos eppendorf, en volúmenes de 5 a 10 µl. Recuerde rotular
los tubos eppendorf adecuadamente y cubrir con papel parafilm para prevenir la evaporación.
Almacenar a -20ºC.
Anticuerpo + Glicerol = Anticuerpo: Glicerol (1:1)
Punto fusión < -20°C
Los anticuerpos también pueden ser almacenados en pequeñas alícuotas del reactivo sin
glicerol.
2. Almacenamiento de reactivos.
o Cada reactivo debe ser almacenado según las condiciones propuestas por el
proveedor en el data sheet de cada inmunoreactivo, con el rotulado correspondiente y
fecha en que se abre o prepara el reactivo.
o Estos de preferencia se deben almacenar a 4°C a excepción de los anticuerpos que son
alicuotados.
Nombre: Nombre:
Técnica: Clon:
Fecha: Cantidad de alicuota
Preparado por: Fecha alicuotado:
Clasificación: Alicuotado por:
Caducación: Caducación:
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PRACTICO IV
Patrones de marcación y artefactos de técnicas
1.- Observe del set de láminas entregados por el docente, e identifique el patrón de marcación
de la IHQ, refiérase a su localización celular y características microscópicas del
inmunoprecipitado.
2.- Observe el set de láminas entregados por el docente y determine el tipo de artefacto de técnica
que estas presentan.
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PRÁCTICO V
Técnicas de Recuperación Antigénica
1.- Pruebe experimentalmente las metodologías de recuperación antigénica. Registre sus
resultados mediante imágenes, además confeccione graficas con todas las variables
medidas. Para hacer esta prueba, usara el mismo tejido por lo que debe tener XX cortes
de un control positivo. Las placas deben estar rotuladas con el número de caso o número
de biopsia, el factor de dilución, el buffer usado y la metodología de recuperación .
Nota: el factor de dilución a utilizar, depende del anticuerpo, se sugiere revisar el datasheet para
corroborar la dilución propuesta.
Recuperación Antigénica de muestras fijadas en formaldehido:
a) Vaporizador: Se carga el vaporizador a nivel completo con agua destilada, poner en el

nivel superior 4 coplin con diferentes soluciones de recuperación, (tampón citrato, citrato
triton, EDTA y Tris EDTA). Estas soluciones deben ser PRE-CALENTADAS (deben alcanzar una
temperatura de 93º a 95ºC, este proceso demora alrededor de 15 minutos), una vez medida
la temperatura de las soluciones, se incorporan los cortes a cada borrel, cuidando siempre
dejar las muestras en equilibrio (el mismo número de portaobjetos en cada coplin).
Los tejidos estarán en recuperación por 30 a 35 minutos, estos serán contados a partir del
momento en que las soluciones de recuperación vuelven alcanzar los 93º a 95ºC. Una vez
terminado el procedimiento de recuperación, ud debe continuar con la metodología IHQ.
b) Olla Digital: Prepare la olla digital para la recuperación antigénica, primero verifique que
este puesta la goma en la boca de la olla. La olla debe estar dentro del cuerpo del calefactor
con los mangos alineados a los del cuerpo del calefactor, y dentro de esta debe estar el
escudo térmico (rejilla circular). Cargue la olla con 500 ml de agua destilada. Los tejidos
deben quedar dentro de cubetas plásticas con el tampón de recuperación elegido (sin tapa),
asegúrese de poner los portaobjetos en equilibrio, si es necesario utilice portaobjetos
blancos. Para tapar, debe hacer coincidir el sector que dice Open en la tapa con el punto
blanco que tiene el mango de la izquierda, gire la tapa en el sentido de las manecillas del
reloj hasta la posición Closed.
Encienda el equipo presionando el botón en la posición On, luego presione el botón que se
lee Display Set, donde ud podrá observar los diferentes programas que han sido
incorporados en la olla, presione hasta que la luz led se encienda en el SP1. Presionar botón
Star/Stop para iniciar el programa, al cabo del termino de este (10 a 15 minutos aprox.)
sonara una alarma, debe presionar nuevamente el botón Star/Stop, en ese momento se
encenderá la luz led del SP2, en este momento debe registrar tiempo, temperatura y
presión. A los 20 minutos, volverá a sonar la alarma, la temperatura habrá descendido hasta
la programada en SP2, la presión debe estar en 0 (confirme y registre).
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C) Recuperación Enzimática: El mecanismo de acción es la inducción de la rotura de enlaces

cruzados, facilitando el acceso del anticuerpo. Una de sus desventajas es que provoca
perdida de la calidad morfológica, lo que se ve aumentado cuando no se encuentra el punto
óptimo de digestión. Proteasas: Tripsina, proteinasa K, pepsina, pronasa, etc.
Inconvenientes: Punto óptimo de digestión, en tejidos con diferentes constituyentes
celulares, resisten de forma distinta a la enzima.
d) KOS: Este equipo funciona por un efecto de microondas y agitación de la solución

recuperadora.
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PRÁCTICO VI
Curva de titulación y demostración de IHQ
1.- Realice una curva de titulación de un anticuerpo, de acuerdo a lo que el fabricante indica como
dilución ideal. Para tal trabajo se usaran los anticuerpos disponibles.
Probara experimentalmente las diluciones, de manera que se compruebe cual es la más adecuada
para conseguir una relación marcación/fondo adecuada. Grafique y explique sus resultados.
El docente les entregara un caso, el cual será resuelto en parejas, deben realizar los cortes (caso y
control positivo en el mismo portaobjetos, secando) y dejar sus soluciones preparadas con
anticipación. Deberán realizar recuperación antigénica si el anticuerpo lo requiere).
Reactivos requeridos:
 Anticuerpos Primarios
 Solución diluente de anticuerpos primarios.
 Bloqueador de peroxidasa endógena
 Bloqueador de proteínas
 Sistema de detección
 Cromógeno
 Agua bidestilada
 Buffer de Recuperación
 Buffer de lavados
 Cloro puro
PROTOCOLO DE TRABAJO.
1.- Desparafinar muestras y llevar al agua corriente (5 minutos en cada xilol; 3 minutos en cada
alcohol, dejar 3 minutos en el agua corriente).
2.- Recuperación antigénica de muestras fijadas con formaldehido tamponado al 10% por calor (
vaporera) por 30 minutos
3.- Bloqueo de peroxidasa endógena con peróxido de hidrogeno al 3%
4.- Luego se dejarán por 5 minutos en Buffer Fosfato pH 7,2-7,6.
5.- Bloqueo de proteínas inespecíficas por 10 minutos
6.- Incubación con anticuerpo primario previamente diluido según lo recomendado por el fabricante
por el siguiente tiempo:
- 1 hora a temperatura ambiente
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- 30 minutos en estufa a 37° C
- Toda la noche a 4°C
7.- Lavar con Buffer Fosfato.
8.- Incubación con anticuerpo secundario biotinilado 10 min en cámara húmeda
9.- Lavado con buffer fosfato
10.- Incubación con complejo ABC por 10 min en cámara húmeda.
11.- Lavar con buffer Fosfato
12.- Incube las muestras con el cromógeno por 5 a minutos, controle al Microscopio.
13.- Lavar con abundante agua destilada y realice la tinción de contraste con Hematoxilina u otro
colorante según corresponda.
14.- Deshidrate, aclare y monte en resina sintética.
15.- 14.- Observe al microscopio, describa e interprete los resultados
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PRÁCTICO VII
IHQ Tumores indiferenciados
Anticuerpos utilizados: Pan Citoqueratina, Vimentina, S100.
1.- Establezca un algoritmo y defina el protocolo para los anticuerpos que utilizara, para
categorizar un tumor indiferenciado, basados en la información proporcionada en los datasheet
de los anticuerpos. El docente les entregara un caso, el cual será resuelto en parejas.
2.- Análisis y explicación por parte de los estudiantes de los datasheet de anticuerpos
utilizados en tumores indiferenciados. Sus aplicaciones y clones más específicos y sensibles.
(Principalmente de los anticuerpos utilizados en el laboratorio de USS)
3.- Discusión de paper: Role of Immunohistochemistry in the Diagnosis of Malignant Small Round
Cell Tumors. (paper referencial)
o Análisis de Imágenes, gráficos y resultados presentes en el paper.

o Reconocer patrones inmunohistoquímicos de las imágenes.
o Discusión de resultados por parte de los alumnos.
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PRÁCTICO VII
IHQ Aplicación en Cáncer Gástrico
Anticuerpos utilizados: Pan Citoqueratina, Citoqueratina 7, Citoqueratina 20
1.- Establezca los anticuerpos que utilizaría para clasificar los tumores gástricos. Defina y realice
el protocolo para los anticuerpos que utilizara, basados en la información proporcionada en los
datasheet de los anticuerpos. El docente les entregara un caso, el cual será resuelto en
parejas.
utilizados en tumores gastrointestinales. Sus aplicaciones y clones más específicos y
sensibles.
3.- Discusión de paper : The Value of CDX-2 and cytokeratins 7 and 20 expression in differentiating
colorectal adenocarcinomas from extraintestinal gastrointestinal adenocarcinomas: cytokeratin 7-
/20+ phenotype is more specific than CDX2 antibody” (paper referencial)
o Análisis de Imágenes, gráficos y resultados presentes en el paper.

o Reconocer patrones inmunohistoquímicos de las imágenes y morfología
histopatológica tumoral.
o Discusión de resultados por parte de los alumnos.
12
PRÁCTICO VIII
IHQ Aplicación en Cáncer de Mama
Anticuerpos utilizados: Pan Citoqueratina, ki 67, Receptor Estrogeno, Receptor Progesterona,

Cerb 2
1.- Establezca los anticuerpos que utilizaría para clasificar los mamarios. Defina y realice el
protocolo para los anticuerpos que utilizara. El docente les entregara un caso, el cual será
resuelto en parejas.
utilizados en tumores mamarios. Sus aplicaciones y clones más específicos y sensibles.
3.- Discusión de paper : “Breast Cancer Classification According to Immunohistochemical Markers:

Clinocopathologic features and short-term Survival Analysis in a Population-Based Sudy from the
South of Switzerland”” (paper referencial)
Análisis de Imágenes, gráficos y resultados presentes en el paper.

Reconocer patrones inmunohistoquímicos de las imágenes y morfología
Discusión de resultados por parte de los alumnos.
13
PRÁCTICO IX
IHQ aplicación en cáncer de pulmón y próstata
Anticuerpos utilizados: Pan Citoqueratina, TTF-1, 34 Be 12
1.- Establezca los anticuerpos que utilizaría en cáncer de próstata y pulmón. Defina y realice el
protocolo para los anticuerpos que utilizara, basados en la información proporcionada en los
datasheet de los anticuerpos. El docente les entregara un caso, el cual será resuelto en
parejas.
utilizados en tumores de pulmón y próstata. Sus aplicaciones y clones más específicos y
sensibles.
3.- Discusión de paper : “Immunohistochemistry in the Differencial Diagnostics of Primary Lung

Cancer” (paper referencial)
14
PRÁCTICO VII
IHQ Aplicación en Riñón
Anticuerpos utilizados: Vim, CK7, CD10
1.- Establezca los anticuerpos que utilizaría para patología renal. Defina y realice el protocolo para
los anticuerpos que utilizara basados en la información proporcionada en los datasheet de los
anticuerpos. El docente les entregara un caso, el cual será resuelto en parejas.
utilizados en tumores renales. Sus aplicaciones y clones más específicos y sensibles.
3.- Discusión de paper : “Immunohistochemical Analysis of Chromophobe Renal Cell Carcinoma,

Renal Oncocytoma, and Clear Cell Carcinoma” (paper referencial)
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PRÁCTICO VII
IHQ Aplicación en tumores Neuroendocrinos
Anticuerpos utilizados: Sinaptofisina, Cromogranina A, Enolasa
1.- Establezca los anticuerpos que utilizaría para patología renal. Defina y realice el protocolo para
los anticuerpos que utilizara basados en la información proporcionada en los datasheet de los
utilizados en tumores neuroendocrinos. Sus aplicaciones y clones más específicos y
sensibles. (Principalmente de los anticuerpos utilizados en el laboratorio de USS)
3.- Discusión de paper: “Mived Adenoneuroendocrine Carcinomas (MANECs) of the

Gastrointestinal Tract: An Update” (paper referencial)
Reconocer patrones inmunohistoquímicos de las imágenes.
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PRÁCTICO IX
IHQ Aplicación en linfomas
Anticuerpos utilizados: CD45 – CD20 – CD 3
1.- Establezca los anticuerpos que utilizaría en linfomas. Defina y realice el protocolo para los
anticuerpos que utilizara basados en la información proporcionada en los datasheet de los
utilizados en Linfomas. Sus aplicaciones y clones más específicos y sensibles.
(Principalmente de los anticuerpos utilizados en el laboratorio de USS)
3.- Discusión de paper: “Nodular Lymphocyte Predominant Hodgkin Lymphoma” (paper

referencial)
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PRÁCTICO X
INMUNOFLUORESCENCIA
1.- Practico demostrativo de IFI
2.- Discusión de paper: Kidney Biopsy is a Sensitive Tool for Restrospective Diagnosis of PLA2R-
related Membranous Nephropathy”” (paper referencial)
Protocolo Inmunofluorescencia cortes de tejidos en criostato
Soluciones:
o PFA 4% en PBS
o Bloqueo: Tris 0.61g + 0.59g NaCl + 80 ml de agua, ajustar a Ph 7,7, luego agregar 8g
de BSA y llevar a 100 ml totales con Agua.
Nota: Todo el procedimiento debes realizarlo en cámara húmeda hermética, a excepción del punto
12.
1.-Secar cortes histológicos durante 30 minutos a 37 grados Celsius
2.-Rodear cortes histológicos con tinta de lápiz hidrofóbico
3.-Fijar con PFA 4% en PBS durante 30 minutos a 4 grados celcius, los demás pasos los realizo a
temperatura ambiente, salvo que desees incubar O.N. el primario, ahí lo incubas a 4 grados Celsius.
4.-Lavar 3 veces con PBS
5.-Bloquear 30-60 minutos con BSA 5%
6- lavar X 2 con PBS
7.-Lavar 1 vez con BSA 5%
8.-Incubar con anticuerpo primario 1 hora (o O.N.) en BSA 5% (utilizo concentraciones 1:100 para
Colágeno III, Periostina y Fibronectina)
9.-Lavar x2 PBS
8.-Lavar 2 veces con BSA 5%
10.- Incubar con anticuerpo secundario durante 1 hora. Para los alexa utilizo una concentración de
1:1000. Más Hoescht 1:1000 (desde stock 1mg/ml)
18
11.-Lavar 2 veces con BSA 5%
12.-Lavar 2veces con PBS
13.-Sumergir 1 vez en agua destilada miliQ
14.-Agregar alrededor de 5-
15.-Montar con coverslip, te recomiendo que coloques el vidrio sobre los cortes con Fluoromount y
luego lo envuelvas en servilleta, teniendo siempre en cuenta que el coverslip quede hacia arriba, en
ese momento aplastas para eliminar el exceso de Fluoromount. Deja secando a temperatura
ambiente, nunca dentro de una cámara húmeda cerrada.
19
PRÁCTICO VII
Automatización
1. Entregar un informe de la vista al centro de automatización de PROLAB
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Soluciones de uso habitual
1. Solución de Peróxido de hidrogeno al 3% (10 ml H20 + 300 µl H2O2)
2. Tampón Citrato de sodio pH 6.0
Solución A: 50 ml ácido cítrico 0,1 M [C6H8O7 ]
Solución B: 50 ml Citrato de Sodio 0,1 M [ Na3C6H5O7)
La solución de trabajo se prepara mezclando 9 ml de la solución A con 41 ml de la solución B. Llevar

a un volumen final 500 cc con agua destilada.
El tampón también puede prepararse con un detergente, en este caso debe agregar 1 ml de tritón
x-100 .
3. Tampón Fosfato salino 0,1 M – TWEEN 20 al 0,5% pH 7,4 (10x)
(10,9 gr Na2HPO4 (anhidro) + 3,2 gr NaH2PO4 (anhidro) + 90 gr de NaCl)
Disolver en 1000 cc de agua destilada, controlar pH y agregar 5 cc de tween 20. Ajustar pH.
4. Tampón EDTA 1Mm - TWEEN 20 al 0,05% pH 8,0 ( 0,37 gr EDTA + 1000 ml Agua destilada)
Una vez disuelto el EDTA, agregar 0,5 ml de tween 20, ajustar a pH 8,0 con Hidróxido de Sodio 1 N.
5. Tampón Tris 10 mM - EDTA 1 mM con TWEEN 20 al 0,05% pH 9,0 ( 1,21g Tris + 0,37 g EDTA +
1000 ml Agua destilada (100 ml 10x; 50 ml 20x)
Nota: la solución tiene una duración de 3 meses a temperatura ambiente, si se almacena a 4ºC
tiene mayor duración.
21
Algoritmos para diagnóstico diferencial de neoplasias
22
23
24
25

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MANUAL DE LABORATORIO DE ANALISIS TISULAR III

TM. Marjorie Castro Herrera

1. Preparación de portaobjetos y corte de material

1. Lavado en Alcohol Clorhídrico al 2% (4 minutos)

1.- Silanizado de Portaobjetos. Cada estudiante deberá

1. Lavado en Alcohol Clorhídrico al 2% (4 minutos)

2.- Corte de casos para estudio inmunohistoquimico.

- Siempre se debe trabajar con una muestra control

o Conocer la utilización de los Tissue Microarray.

Anticuerpo + Glicerol = Anticuerpo: Glicerol (1:1)

Punto fusión < -20°C

Recuperación Antigénica de muestras fijadas en formaldehido:

a) Vaporizador: Se carga el vaporizador a nivel completo con agua destilada, poner en el

C) Recuperación Enzimática: El mecanismo de acción es la inducción de la rotura de enlaces

d) KOS: Este equipo funciona por un efecto de microondas y agitación de la solución

3.- Bloqueo de peroxidasa endógena con peróxido de hidrogeno al 3%

4.- Luego se dejarán por 5 minutos en Buffer Fosfato pH 7,2-7,6.

5.- Bloqueo de proteínas inespecíficas por 10 minutos

- 1 hora a temperatura ambiente

- 30 minutos en estufa a 37° C

- Toda la noche a 4°C

7.- Lavar con Buffer Fosfato.

8.- Incubación con anticuerpo secundario biotinilado 10 min en cámara húmeda

9.- Lavado con buffer fosfato

10.- Incubación con complejo ABC por 10 min en cámara húmeda.

11.- Lavar con buffer Fosfato

14.- Deshidrate, aclare y monte en resina sintética.

15.- 14.- Observe al microscopio, describa e interprete los resultados

Anticuerpos utilizados: Pan Citoqueratina, Vimentina, S100.

o Análisis de Imágenes, gráficos y resultados presentes en el paper.

Anticuerpos utilizados: Pan Citoqueratina, Citoqueratina 7, Citoqueratina 20

o Análisis de Imágenes, gráficos y resultados presentes en el paper.

Anticuerpos utilizados: Pan Citoqueratina, ki 67, Receptor Estrogeno, Receptor Progesterona,

3.- Discusión de paper : “Breast Cancer Classification According to Immunohistochemical Markers:

Análisis de Imágenes, gráficos y resultados presentes en el paper.

Anticuerpos utilizados: Pan Citoqueratina, TTF-1, 34 Be 12

3.- Discusión de paper : “Immunohistochemistry in the Differencial Diagnostics of Primary Lung

3.- Discusión de paper : “Immunohistochemical Analysis of Chromophobe Renal Cell Carcinoma,

Anticuerpos utilizados: Sinaptofisina, Cromogranina A, Enolasa

3.- Discusión de paper: “Mived Adenoneuroendocrine Carcinomas (MANECs) of the

Anticuerpos utilizados: CD45 – CD20 – CD 3

3.- Discusión de paper: “Nodular Lymphocyte Predominant Hodgkin Lymphoma” (paper

Protocolo Inmunofluorescencia cortes de tejidos en criostato

1.-Secar cortes histológicos durante 30 minutos a 37 grados Celsius

2.-Rodear cortes histológicos con tinta de lápiz hidrofóbico

4.-Lavar 3 veces con PBS

5.-Bloquear 30-60 minutos con BSA 5%

6- lavar X 2 con PBS

7.-Lavar 1 vez con BSA 5%

8.-Lavar 2 veces con BSA 5%

11.-Lavar 2 veces con BSA 5%

12.-Lavar 2veces con PBS

13.-Sumergir 1 vez en agua destilada miliQ

Soluciones de uso habitual

1. Solución de Peróxido de hidrogeno al 3% (10 ml H20 + 300 µl H2O2)

2. Tampón Citrato de sodio pH 6.0

Solución A: 50 ml ácido cítrico 0,1 M [C6H8O7 ]

Solución B: 50 ml Citrato de Sodio 0,1 M [ Na3C6H5O7)

La solución de trabajo se prepara mezclando 9 ml de la solución A con 41 ml de la solución B. Llevar

3. Tampón Fosfato salino 0,1 M – TWEEN 20 al 0,5% pH 7,4 (10x)

(10,9 gr Na2HPO4 (anhidro) + 3,2 gr NaH2PO4 (anhidro) + 90 gr de NaCl)

Algoritmos para diagnóstico diferencial de neoplasias