PLANTA DE PRODUCCIÓN DE BROMELINA (ENZIMA PROTEOLÍTICA)

1. Pretratamiento: Las piñas son cosechadas en diferentes localidades y en diferentes épocas del año. La bromelina en
el interior de los tallos de piña es extremadamente perecedera, especialmente si es alternativamente congelada y
deshelada. Por lo tanto debe ser procesado inmediatamente después de cosechado excepto si emplea extraordinarios y
costosos medios de almacenamiento. Los tallos de piña, después de ser peladas, son transportados a la planta de
producción de bromelina. Una limpieza minuciosa es requerida cuando llegan a la planta. Excesos de tierra, piedras y
basura son removidos. Después de la limpieza, los tallos de piña son pasados a través de un transportador de cadena y
lavados por caída en un limpiador de transporte de malla rociando vapor de agua. Luego, ellos son raspados y cortados en
trozos para un fácil manejo en la posterior extracción de jugos de tallos. El jugo es separado desde los tallos pasando a
través de la prensa de tornillo.

B. Purificación: El jugo de los tallos de piña es tamizado, para eliminar impurezas flotantes, y luego es tratado con una
solución de metanol para la parte coagulada de la materia coloidal, precipitando algunas de las impurezas y cambiando el
valor del pH en un tanque de solución amortiguadora. Luego, la solución es mezclada con aditivos y asentado en grandes
asientos continuos o espesadores. El jugo de los tallos de piña recuperados desde los asientos o espesadores es filtrado.

D. Destilación: Los líquidos de fase ligera desde el decantado conteniendo metanol son recuperados en una torre de
absorción y destilado, luego es reciclado a través del proceso.

F. Secado del producto y empaquetado: Los líquidos de fase pesada desde el decantado son secados y pulverizados
como polvo de bromelina. Los cristales secos pasan a través de una serie de tamices o filtros. Varias máquinas de pesado y
empaque automáticas empaquetan la bromelina en bolsas y cajas.

3. DESCRIPCIÓN DE LA PLANTA.

3.1 CAPACIDAD DE PRODUCCIÓN.

La planta equipada con la maquinaria y equipo descrita en la sección 3.4 de este estudio, operando turnos de ocho horas
diarias, tratando 20 toneladas métricas de tallos de piña, es capaz de producir 80-100 Kg de bromelina de alta actividad por
día, y 4,000 Kg de residuos como alimento animal. La bromelina activada es controlada por las normas CDU 800-1,200 de
acuerdo a estándares japoneses y 1,200-2,000 GDU de acuerdo a los patrones europeos.

3.2 MATERIAS PRIMAS.

Tallos de piña.

Metanol.

Aditivos.

3.3 MANO DE OBRA REQUERIDA.

CLASIFICACIÓN DEL TRABAJO. PERSONAS/TURNO.

Operadores de la sección pretratamiento. 2

Operador de la sección secado de residuos. 1

Operador de la sección purificación. 1

Operador de la sección ultrafiltración. 1

Operador de la sección destilación. 1

Operador de la sección concentración. 1

Operador de la sección secado del producto. 1

Operador de la sección de empaque. 1

Operador de servicios. 1

Supervisor de la planta. 1

TOTAL. 11

3.4 MAQUINARIA Y EQUIPO.

A. SECCIÓN PRETRATAMIENTO.

ITEMS. N° DE MÁQUINAS.

Transportador. 5

Limpiador de malla transportadora. 1

Máquina de raspado de los tallos de piña. 1

Cortador de tallos. 1

Prensa de tornillo. 2

Tanque de jugo de piña. 1

Bomba. 1

B. SECCIÓN DE SECADO DE RESIDUOS (OPCIONAL)

ITEMS. N° DE MÁQUINAS.

Secador de residuos. 1

Pulverizador de alimentos. 1

Separador y filtro vibratorio. 1

Licuadora de banda. 1

Máquina pesadora y selladora automática. 1

Empaquetador de escala. 1

C. SECCIÓN PURIFICACIÓN.

ITEMS. N° DE MÁQUINAS.

Tanque amortiguador. 1

Refrigerador de plato de una estación. 2

Tanque de asentamiento. 6

Filtro de prensa. 1

Tanque de mezcla. 1

Bomba. 1
D. SECCIÓN DE ULTRAFILTRACIÓN.

ITEMS. N° DE MÁQUINAS.

Filtro U.F. 1

Tanque del semiproducto. 1

Neo-filtro. 1

Decantador. 1

E. TANQUE DE DESTILACIÓN.

ITEMS. N° DE MÁQUINAS.

Torre de destilación. 1

Condensador aéreo. 1

Receptor aéreo. 1

Caldera. 1

Tanque de metanol puro. 1

Refrigerador de plato de una estación. 1

F. SECCIÓN DE CONCENTRACIÓN (OPCIONAL)

ITEMS. N° DE MÁQUINAS.

Calentador. 1

Evaporador. 1

Condensador de superficie. 1

Drenaje automático. 1

Bomba. 2

G. SECCIÓN SECADO DEL PRODUCTO.

ITEMS. N° DE MÁQUINAS.

Secador por aspiración. 6

Tanque de agua caliente. 2

Pulverizador del producto. 1

Bomba de aspirado. 3

H. CUARTO DE LIMPIEZA.

ITEMS. N° DE MÁQUINAS.

Bañera o ducha de aire. 1

Ventilador. 1
I. SECCIÓN AGUA ENFRIADA.

ITEMS. N° DE MÁQUINAS.

Torre de enfriamiento. 1

Tanque de aguas blandas. 1

Bomba. 1

J. SECCIÓN DE AGUA REFRIGERADA.

ITEMS. N° DE MÁQUINAS.

Compresor de refrigeración. 3

Separador de aceite. 3

Condensador. 3

Receptor. 3

Aparejador de hielo. 1

Acumulador. 3

Bomba. 2

3.5 GASTOS GENERALES DE LA PLANTA.

Energía eléctrica: 19,600 KwH/día.

Vapor: 14,400 Kg/día, 5 Kg/Cm2.

Agua enfriada: 12,000 Kg/día.

3.6 ÁREA DEL TERRENO Y EDIFICIO DE LA PLANTA.

Fábrica: 840 m2.

Almacén: 100 m2.

Oficina y laboratorio: 60 m2.

Área total de la planta: 50m (L) x 20m (A) = 1,000 m2.

3.7 LOCALIZACIÓN DE LA PLANTA.

Los siguientes factores podrían ser tomados en consideración cuando seleccionan una ubicación para la planta de
producción de bromelina:

(1) Cercano a un área de cultivo de piñas.

(2) Bajas tasas de servicio y de mano de obra.

3.8 DISTRIBUCIÓN DE PLANTA.

(A) Sección de pretratamiento.

(B) Sección de secado de residuos.

(C) Sección de purificación.

(D) Sección de filtración U. F.

(E) Sección de destilación.

(F) Sección de concentración.

(F1) Sección de reserva de concentración.

(G) Sección de secado del producto.

(H) Sección de limpieza.

(I) Sección de agua refrigerada.

(J) Sección de agua helada.

(K) Caldera.

(L) Oficina y laboratorio.

 (M) Almacén.

http://www.buenastareas.com/ensayos/Extracci%C3%B3n-y-Evaluaci%C3%B3n-De-La-Enzima/2507144.html BROMELINA
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Extraciòn, cuantificaciòn e identificaciòn de la actividad enzimàtica contenida

en el cultivo de piña (Ananas comosus).
 Publicado por JUAN CASTILLO HERNÀNDEZ. el agosto 29, 2011 a las 2:49pm
 Ver blog

Extracción, cuantificación, identificación y determinación de la actividad enzimática de la

bromelina contenida en el tallo del cultivo de Ananas comosus, comúnmente conocido como
piña.
Resumen
Se llevo acabo la extracción de la bromelina contenida en el cultivo de piña mediante una
extracción por solubilidad con solventes, de igual manera se cuantificó el contenido de
bromelina en las muestras mediante el método de Biuret, se hicieron pruebas de identificación
de aminoácidos con la finalidad de determinar la naturaleza proteica de la bromelina,
finalmente se evaluó la actividad enzimática de la bromelina utilizando caseína como sustrato.
Introducción
Las proteínas son moléculas formadas por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno y la mayor
parte de ellas también contiene azufre, están formadas por cadenas de alfa aminoácidos que se
encuentran unidas entre sí mediante enlaces peptídicos, las proteínas exhiben una gran
diversidad funcional ya que pueden ser estructurales, protectoras, toxicas, hormonales,
mensajeras, contráctiles, transportadoras y enzimáticas. Las enzimas son proteínas producidas
por células vivas que se encargan de catalizar reacciones bioquímicas termodinámicamente
espontáneas, esta función la llevan a cabo mediante su sitio activo el cual es la porción de
aminoácidos que se une al sustrato para que se lleve a cabo la reacción, la función de las
enzimas es dependiente de una temperatura y pH óptimos, mismos que son específicos para
cada enzima, en algunas ocasiones las enzimas requieren de la ayuda un cofactor o coenzima
para llevar a cabo su función (Lehninger, 1995)
Las enzimas se clasifican en oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerazas y
ligasas (J. I. routh, 1977)
La bromelina es una enzima perteneciente a las proteasas, se encuentra contenida en el cultivo
de piña y dentro de sus usos se ha encontrado que se utiliza para mejorar la digestión, como
antitrombotico, antitumoral, antiséptico entre otros ( Revista Venemedica, 2004)
El cultivo de piña (Ananas comosus) pertenece a la familia de las bromelaseas, es una planta
arbustiva que se adapta a diversos microclimas preferentemente en zonas tropicales y
subtropicales, requiere de una precipitación que va de 800 hasta 1200mm y se puede encontrar
en altitudes hasta de 800m sobre el nivel del mar, completa su ciclo vegetativo de 1 a 1.5 años
de acuerdo a la variedad y de 3 a 5 meses en la maduración del fruto, las hojas del cultivo
maduras son ricas en sílice y el peso promedio de los tallos va de los 250 a 400g (Jesús
Fernández, 2005).
Justificación
En la actualidad el mundo globalizado ha traído como consecuencia graves problemas como
desempleo, falta de vivienda, contaminación ambiental y el resurgimiento de enfermedades del
pasado que se creían erradicadas, tales como la viruela, el sarampión, la tuberculosis entre
otras, de igual manera el surgimiento de enfermedades que no mostraban tanta frecuencia tales
como la diabetes mellitus, obesidad, bulimia, anorexia, cáncer, depresión, estrés y además
enfermedades cardiovasculares, por lo que es fundamental en la actualidad llevar a cabo la
investigación de principios activos de origen vegetal que contrarresten estos problemas de
salud pública, en base a estudios realizados en diferentes países se ha encontrado que la piña
presenta un amplio espectro de propiedades terapéuticas sobre el tratamiento de enfermedades
como el cáncer así como sus efectos antisépticos y antitromboticos, se ha encontrado que
estas propiedades se deben a un principio activo de naturaleza proteica contenido en la piña
que recibe el nombre de bromelina, misma que también se utiliza como ablandador de carnes y
es así como surge la curiosidad y a la vez necesidad de llevar a cabo la realización de este
experimento.
Hipótesis
Hipótesis alternativas (Ha)
Ha El tallo del cultivo de piña contiene a la enzima bromelina.
Ha El fruto del cultivo de piña contiene a la enzima bromelina
Ha El tallo del cultivo de piña presenta mayor contenido de bromelina que el fruto y el follaje.
Ha Algunos de los aminoácidos de la bromelina pueden ser identificados mediante reactivos
específicos.
Ha La bromelina contenida en una masa determinada de muestra puede ser cuantificada
mediante él método de Biuret.
Ha La caseína es sustrato de la enzima bromelina, por lo que es posible evaluar la actividad
enzimática.

Hipótesis nulas (H0)

H0 El tallo del cultivo de piña no contiene a la enzima bromelina.
H0 El fruto del cultivo de piña no contiene a la enzima bromelina
H0 El fruto y el follaje del cultivo de piña, presentan mayor cantidad de bromelina que el tallo.
H0 Los aminoácidos que constituyen a la bromelina no pueden ser identificados mediante los
reactivos utilizados en este experimento.
H0 La bromelina contenida en una masa determinada de muestra, no es posible cuantificarla
mediante el método de Biuret.
H0 La caseína no es sustrato para la enzima bromelina, por lo que no se puede evaluar la
actividad enzimatica.

Objetivos
Objetivo general
Extraer cuantificar, identificar y determinar la actividad enzimática de la bromelina contenida
en el cultivo de piña.

Objetivos particulares
Encontrar el mejor disolvente que proporcione mayor rendimiento en la extracción de la enzima.
Cuantificar la enzima extraída mediante el método de Biuret.
Determinar la naturaleza proteica de la bromelina mediante pruebas de identificación de
aminoácidos que constituyen su estructura.
Evaluar la actividad enzimática de la bromelina utilizando caseína como sustrato.

Materiales y reactivos
Materiales
40 tubos de ensayo
Vasos de precipitado de diferentes volúmenes
2 Pipetas volumétricas de 5mL
2 Pipetas graduadas de 10 mL
2 Vidrio de reloj
5 Matraces volumétricos de 100mL
2 Espátulas
1 pipeta serológica de 1mL
2 recipientes para baño en frío y en caliente.
1 plato caliente
2 gradillas metálicas para tubos de ensayo
1 balanza granataria
1 mortero de porcelana con pistilo
2 perillas
1 embudo de plástico
3 cajas Petri
1 cuter
1 papel filtro
Y como material biológico se utilizó el cultivo de piña.

Reactivos
100 mL de disolución de albúmina serica bovina al 0.5%
100 mL de disolución de caseína al 0.5%
100 mL de disolución de ninhidrina al 0.5%
100 mL de disolución de ácido acético de concentración 1M
100 mL de disolución de hidróxido de sodio al 40%
100 mL de reactivo de Biuret
10mL de ácido nítrico concentrado
20mL de ácido acético concentrado
100mL de acetona
20mL de disolución buffer de fosfatos a pH (6.5 a 6.75)
 Hielo
Agua destilada


Metodología experimental
Extracción
Una vez realizadas varias pruebas con la finalidad de obtener la mejor mezcla de extracción que
proporcionara el mejor rendimiento, se trabajó de la siguiente manera: primeramente se hizo
una selección aleatoria del cultivo de piña, posteriormente se realizaron cortes finos de la
muestra (tallo, fruto y follaje por separado), se pesó 2g de muestra la cual se colocó en un
mortero de porcelana con pistilo para su maceración, se adicionó 5mL de agua destilada, una
vez llevado a cabo el macerado se decanto a un tubo de ensayo y se colocó en un baño de hielo
durante 5 minutos y se agregó 5mL de acetona fría (0-1oC) dejándose reposar hasta observar un
precipitado blanco.
Cuantificación
Se realizó una curva de calibración con disoluciones estándar de albúmina sérica bovina a
diferentes concentraciones mediante el método de Biuret agregando los contenidos como se
indica en el cuadro número 1:
Tubo Volumen de disolución estándar de albúmina sérica bovina (mL) Concentración de la
disolución estándar (mgmL-1) Volumen de reactivo de Biuret (mL) Volumen de agua destilada
(mL)
B0041
1 0.2 0.2 4 0.8
2 0.3 0.3 4 0.7
3 0.4 0.4 4 0.6
4 0.5 0.5 4 0.5
5 0.6 0.6 4 0.4
6 0.7 0.7 4 0.3
7 0.8 0.8 4 0.2
8 0.9 0.9 4 0.1
9 11 40

Al mismo tiempo que se elaboraba la curva de calibración, a 10 tubos de ensayo con extracto se
les agregó 4mL del reactivo de Biuret, para después de 20 minutos hacer la interpolación y
obtener la concentración de proteína en el extracto.

Pruebas de identificación de aminoácidos

Para cada prueba de identificación se preparó 4 tubos de ensayo, uno como control positivo que
contenía disolución de albúmina sérica bovina, otro como control negativo que contenía agua
destilada y 2 tubos con extracto para efectos de evaluar la prueba por duplicado.
Reacción de la ninhidrina
Se preparó una disolución de ninhidrina al 0.5%, pesando 0.5g de ninhidrina, disolviendo y
aforando con etanol del 96% en un matraz volumétrico de 100mL, posteriormente a los 4 tubos
de ensayo previamente mencionados se les agregó 0.5mL de la disolución de ninhidrina, y se
llevaron a un baño de agua caliente, hasta observar viraje.

Reacción Xantoproteíca
Se preparó 4 tubos de ensayo como se menciona al inicio, a cada tubo se les agregó 1mL de
ácido nítrico concentrado y se llevaron a un baño de agua caliente, se dejó hervir,
posteriormente se dejó enfriar a temperatura ambiente, para agregar disolución de hidróxido de
sodio al 40%, alcalinizando hasta observar viraje.
Reacción de ácido glioxilico
Una vez preparados los 4 tubos de ensayo como en las pruebas anteriores, se les agregó 2mL de
ácido acético concentrado, posteriormente se les agregó 2mL de ácido sulfúrico concentrado
deslizándolo por las paredes del tubo hasta observar la formación de un anillo.
Determinación de la actividad enzimática
Para la determinación de la actividad enzimática se rotuló 3 tubos de ensayo a uno de estos se
les adicionó disolución de caseina, a otro extracto y disolución de caseina y al último se le
agregó únicamente extracto, en las cantidades mostradas en el cuadro número 2:
Tubo Volumen de extracto (mL) Volumen de disolución de caseína al 0.5% (mL) Volumen de
disolución buffer de fosfatos de (pH=6.5-6.7)(mL) Volumen de ácido acético de concentración
1molL-1 (mL)
10422
25422
35422

El ácido acético se adicionó sobre los tubos 2 y 3 después de diferentes intervalos de tiempo,
con la finalidad de evaluar la actividad enzimática del extracto.

Resultados
Extracción
Se observó la formación de un precipitado blanco, que indicó la presencia de la enzima
bromelina contenida en la muestra (tallo, follaje y fruto.)

Cuantificación
El cuadro número 3 muestra los resultados comparativos en cuanto a la concentración de
bromelina en las 3 muestras procesadas.

Muestra Concentración (mgmL-1) gramos de bromelina por Kg de muestra

fruto 0.55 +- 0.05 3.85
follaje 0.65 +- 0.05 3.5
tallo 0.95 +- 0.05 6.65

Pruebas de identificación de aminoácidos

El cuadro número 4 muestra los resultados obtenidos en cuanto a la identificación de
aminoácidos presentes en la bromelina.
Prueba Tubo 1 (muestra problema) Tubo 2 (muestra problema) Tubo 3 (control positivo) Tubo 4
(control negativo) Características
Ninhidrina + + + - Coloración violeta
Xantoproteíca + + + - Coloración amarillo verdosa
Ácido glioxilico + + + - Formación de un anillo en el fondo del tubo.

+= Positivo - = negativo

Determinación de la actividad enzimática

El cuadro número 5 muestra los resultados en cuánto a la actividad enzimática
Tubo Tiempo (minutos) Características Actividad enzimática
1 (caseína + buffer + ácido acético) 25 Formación de precipitado blanco 0
2 (extracto + caseína + buffer + ácido acético) 25 No se observó la formación de precipitado
0.8mgmin-1
3 (extracto + buffer+ +ácido acético) 25 No se observó la formación de precipitado 0

Discusión de resultados
Extracción
El agua destilada dentro su estructura forma dipolos por lo que las cargas parciales positivas y
negativas dentro de esta misma provocan que los solutos iónicos al disociarse en cationes y
aniones, sean atraídos por los dipolos del agua (constante dieléctrica), es decir que estos
solutos sean solubles en el agua, la enzima bromelina se disuelve en el agua en función de las
cargas positivas y negativas de sus aminoácidos, por lo que al adicionar acetona al agua, su
constante dieléctrica disminuye y ocurren atracciones electrostáticas entre las cargas
positivas y negativas de los aminoácidos, por lo que de esta manera se indujo a la precipitación
de la bromelina.

Cuantificación
Las proteínas están formadas por aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos, mismos
enlaces que presentan 2 pares de electrones libres que forman un complejo de coordinación
con el ion cúprico que se forma por la disociación del sulfato de cobre contenido en el reactivo
de Biuret, el complejo formado da origen al color observado en la curva de calibración y el
extracto que se interpolo dentro de la misma. Los resultados en cuanto a la cuantificación se
pueden emitir de manera más precisa con el uso de un espectrofotómetro, ya que de esta
manera se obtiene un coeficiente de correlación que genera mayor confiabilidad (Lehninger,
1995).

Identificación de aminoácidos
Reacción de la ninhidrina
Una molécula de ninhidrina reacciona con una molécula de un aminoácido de tal manera que se
genera amoniaco, bioxido de carbono por efectos de una descarboxilación y una molécula de
ninhidrina reducida, paulatinamente el amoniaco generado condensa 2 moléculas de ninhidrina
una oxidada y otra reducida, finalmente este complejo formado es quien genera el viraje,
(Lehninger, 1995).
Reacción Xantoproteíca
El viraje en esta prueba fue generado por una reacción de sustitución electrofilica aromática
entre el grupo fenilo de la tirosina y el ácido nítrico, (J. I. routh, 1977)
Reacción del ácido glioxilico
La formación del anillo en el fondo del tubo de ensayo fue originada por una reacción de
sustitución electrofilica aromática entre el ácido sulfúrico y los grupos fenilo de los
aminoácidos aromáticos (J. I. routh, 1977)
Determinación de la actividad enzimática
Al adicionar ácido acético a los tubos 2 y 3 no se observó la formación de precipitado debido a
que en el tubo 2 ya no había caseína, puesto que se había degradado por la acción enzimática
de la bromelina, en el caso del tubo 3 la bromelina no precipita con el ácido acético, y en tubo 1
se observó la formación de precipitado puesto que sólo contenía caseína y esta si precipita por
la adición de ácido acético, (J. I. routh, 1977).

Conclusión
Se llevo a cabo la extracción, la cuantificación, la identificación y la determinación de la
actividad enzimática de la bromelina contenida en el cultivo de piña (Ananas comosus), por lo
tanto se rechazan las hipótesis nulas.
Perspectivas
Implementar el cultivo de piña en la región bajo condiciones especiales.
Elaboración de una composta para su uso como sustrato.
Evaluar el efecto antitrombotico de la enzima bromelina en muestras de sangre.
Investigar sobre posibles efectos adversos de la bromelina para tratar de controlarlos
Investigar sobre posibles inhibidores de la bromelina que se encuentren dentro del organismo
e impidan su acción enzimática.
Tratar de llevar a cabo la determinación de la secuencia de aminoácidos de la bromelina
mediante reactivos y tecnicas de separación adecuados.
Evaluar el efecto antiseptico de la bromelina mediante su efecto inhibitorio del crecimiento de
microorganismos en diferentes medios de cultivo.
Bibliografía
Obesidad; J. González McGraw- Hill, México 2003,
Síndrome metabólico y enfermedad cardiovascular; A. Gonzalez, F. la Valle y J. Ríos
(intersistemas SA. De C.V, México 2004)
Química orgánica y bioquímica; Donald J. Burton y Joseph I. Routh; McGraw-Hill, Interamericana
de México SA de CV, 1997
Anatomia y Fisiología CP. Anthony, G.A. Thibodeau, McGraw-Hill, Interamericana de México SA
de CV, 1983
Venemedica, Acerca de la bromelina Rapha Health network Internacional news paper, volume 1,
año 3, mayo de 2004
Vitaminas, minerales, y suplements herbales una nueva visión terapéutica medica; Dr. Alberto
Guzman, MD, MS, PhD.
Colegio de Bachilleres del Estado de Querétaro, plantel 11 “Ezequiel Montes”

Nombre del equipo: Los aluchines” new generation”

Integrantes:
Hipólito Salazar Berenice

Trejo Guerrero Juana Lizeth

Asesores del equipo:

Castillo Hernández Juan

Castillo Ortega José Juan

Jiménez Barcenas Nadia Rosalina

Titulo de experimento: Extracción, cuantificación, identificación y determinación de la actividad

enzimática de la bromelina contenida en el cultivo de piña (Ananas comosus)

“En la ciencia, por la ciencia y para la ciencia.”