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TÉCNICAS MOLECULARES NA IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS EM FEIJÃO-CAUPI

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Paulo Sergio Torres Brioso

Federal Rural University of Rio de Janeiro
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 TÉCNICAS MOLECULARES NA IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS EM FEIJÃO-CAUPI

P. S. T. BRIOSO1

No Brasil, de acordo com os dados do Censo Agropecuário de 1996/IBGE (http://www.ibge.gov.br),

foram produzidas 14.462 toneladas de feijão-caupi, em uma área de 40.509,143 ha, sendo a região
nordeste responsável por mais de 85 % da área colhida. Dos 15 % restantes, mais de 8 % da área foi
colhida na região sudeste, tendo sido mais da metade (2.682,880 ha) no Estado do Rio de Janeiro.
Vários são os agentes patogênicos que podem incidir na cultura e provocar perdas na qualidade e
no rendimento, em especial fungos, bactérias, nematóides e vírus (Santos et al., 1999). A virulência do
patógeno, o efeito sinérgico entre patógenos, a suscetibilidade do cultivar, a idade da planta na época da
infecção, além das condições ambientais, irão determinar o grau de severidade da doença.
A Fitopatologia, definida de forma ampla como o estudo das doenças de plantas e, especifica-
mente, como o estudo da interação entre patógeno, hospedeira e meio ambiente, passou a ter, progres-
sivamente a partir da década de 1950, a Biologia Molecular como uma forte aliada, seja na taxonomia,
na etiologia, na diagnose, no estudo da interação entre patógeno e hospedeira ou vetor e, também, no
controle.
A Biologia Molecular praticamente iniciou em 1944, com o trabalho de Avery, MacLeod & McCarty,
que indicou que o DNA contido no genoma de uma bactéria seria o material genético da célula e o
responsável pela transmissão de seus caracteres hereditários. Isso foi confirmado em 1952, por Hershey
& Chase, a partir do uso de um bacteriófago contendo o DNA viral marcado radioativamente que,
injetado numa bactéria, promoveu o aparecimento de novas partículas virais, confirmando o papel do
DNA como material genético; e culminou em 1953, com a proposta de modelo estrutural de dupla hélice
da molécula de DNA desenvolvida por Watson & Crick (Lambais, 1995; Agrios, 1997; Barros & Moreira,
2000). No entanto, o marco inicial da dita Fitopatologia Molecular pode ser considerado o trabalho de
Gierrer & Schramm, em 1956, utilizando como modelo o “Tobacco mosaic virus” (TMV) e plantas de
fumo, confirmando que o RNA viral era o responsável pela infecção das células vegetais e pela reprodu-
ção de novas partículas virais, demonstrando assim o papel do RNA como material genético. Em 1960,
a partir das informações obtidas por Anderer et al. e por Fraenkel-Conrat et al., através do seqüenciamento
de aminoácidos do capsídeo do TMV, foi decifrado o código genético deste vírus (Matthews, 1991;
Agrios, 1997). Outros avanços da Biologia Molecular, como o isolamento e uso de enzimas de restrição,
a ligação de fragmentos de DNA através da DNA ligase e a construção de uma molécula de DNA circular
recombinante, com o desenvolvimento em paralelo de inúmeras técnicas moleculares, impulsionaram a
atual Fitopatologia Molecular, um híbrido entre a Fitopatologia e a Biologia Molecular.
Como principais técnicas moleculares utilizadas na diagnose dos fitopatógenos e seus possíveis
vetores temos a Extração e Eletroforese do ácido nucléico; o RFLP (“Restriction Fragment Length
Polymorphism”); a Clonagem e Seqüenciamento do ácido nucléico; a Hibridização de ácidos nucléicos
(Teste de Northern Blot, Teste de Southern Blot e Teste de Dot Blot) e o “Polymerase Chain Reaction”
(PCR) nas suas diferentes modalidades. Em relação a esta última técnica, diversas variações foram
desenvolvidas, podendo também estar combinada a outras técnicas (Brioso, 2000). Dependendo do
princípio e das condições de condução, os testes moleculares podem ser eficientes para discriminar
gêneros, espécies, estirpes e subgrupos de fitovírus (Brioso et al., 2001).

1
Instituto de Biologia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Caixa Postal 74585, CEP: 23851-970,
Seropédica, RJ. E-mail: brioso@bighost.com.br
 Em muitos países, as doenças viróticas são o fator limitante para a produção do caupi. No mundo,
esta leguminosa apresenta suscetibilidade a cerca de 34 gêneros virais envolvendo mais de 119 espé-
cies virais (Tabela 1).

Tabela 1. Relação de alguns gêneros e famílias virais para os quais o caupi (V. unguiculata) é suscetível.

Gênero viral Família viral

Alphacryptovirus Partitiviridae
Alfamovirus Bromoviridae
Begomovirus Geminiviridae
Bromovirus Bromoviridae
Capillovirus -
Carlavirus -
Carmovirus Tombusviridae
Comovirus Comoviridae
Cucumovirus Bromoviridae
Curtovirus Geminiviridae
Dianthovirus Tombusviridae
Enamovirus Luteoviridae
Fabavirus Comoviridae
Ilarvirus Bromoviridae
Macluravirus Potyviridae
Nanovirus -
Necrovirus Tombusviridae
Nepovirus Comoviridae
Nucleorhabdovirus Rhabdoviridae
Oleavirus Bromoviridae
Ourmiavirus -
Pecluvirus -
Polerovirus Luteoviridae
Potexvirus -
Potyvirus Potyviridae
Sobemovirus -
Soybean chlorotic mottle-like viruses Caulimoviridae
Tobamovirus -
Tobravirus -
Tombusvirus Tombusviridae
Tospovirus Bunyaviridae
Trichovirus -
Tymovirus -
Vitivirus -

Métodos biológicos, sorológicos e físico-químicos, com suas vantagens e desvantagens, têm

sido utilizados para detectar, diagnosticar e classificar os vírus vegetais durante décadas. Com o avan-
ço da Biologia Molecular, parâmetros moleculares também começaram a ser amplamente explorado no
estudo desses fitopatógenos. Com a automatização do seqüenciamento houve um aumento expressivo
no número de seqüências disponíveis para os diferentes fitovírus, que podem ser acessadas no endere-
ço eletrônico do “National Center for Biotechnology Information” (NCBI) - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Entrez/index.html ou através de diferentes sistemas computadoracionais (por exemplo, VAX/VMS, UNIX,
IBM-PC, MACINTOSH, etc) associados a programas específicos (por exemplo, GCG Fragment Assembly
TM
System, Omiga 2.0, etc) que acessam diferentes bancos de dados e permitem a manipulação e
análise a nível de nucleotídeo e de aminoácidos das inúmeras seqüências. Tais dados têm auxiliado na
confecção de oligonucleotídeos e sondas moleculares específicas aos diferentes vírus que infectam o
feijão-caupi.
Em 1992, foi diagnosticado pela primeira vez no Brasil, através de uma modalidade da técnica de
PCR, um vírus da família Comoviridae (Brioso, 2000). Desde então, essa é uma das técnicas moleculares
mais adotadas na Virologia e, em especial, para o diagnóstico molecular de vírus em feijão-caupi.
No Brasil, os principais vírus que infectam o feijão-caupi são: o Cucumber mosaic virus (CMV)
(família Bromoviridae), o Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) (família Comoviridae), o Cowpea golden
mosaic virus (CpGMV) (família Geminiviridae), o Bean common mosaic virus (BCMV) (família Potyviridae),
o Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) (família Potyviridae), o Cowpea green vein banding virus
(CGVBV) (família Potyviridae), o Cowpea rugose mosaic virus” (CPRMV) (família Potyviridae), o Cowpea
severe mottle virus (CPSMoV) (família Potyviridae) (Kitajima, 1986; Kitajima, 1995; Lima et al., 1998).
Em relação a tais vírus na cultura do feijão-caupi, os primeiros trabalhos utilizando técnicas
moleculares foram os conduzidos por Brioso et al. (1996), Passos (1999), Figueiredo et al. (2000) e
Passos et al. (2000) envolvendo o CPSMV e o CABMV, de forma a diagnosticar precocemente a espé-
cie viral na cultura, na seleção inicial de plantas de caupi resistentes ao vírus ou na detecção de vetores
virulíferos (no caso do besouro Cerotoma arcuata Oliv. - Coleoptera: Chrysomelidae - infectado com o
CPSMV).
A partir de um par de oligonucleotídeos degenerados correspondentes às seqüências de aminoácidos
conservados, AWSTQV e GPN*GFE (* = N ou R), nas subunidades do capsídeo das espécies do gênero
Comovirus foi possível obter fragmento de 593 pb através do teste de “Reverse Transcriptase –
Polymerase Chain Reaction” (RT-PCR) para os sorotipos I e II do CPSMV oriundo de preparação de RNA
foliar de caupi ‘Seridó’ infectado. Assim como foi possível obter padrão de amplificação distinto entre
as três espécies do gênero que foram testadas, permitindo a identificação das mesmas (Brioso et al.,
1996).
Sondas moleculares para o CPSMV, produzidas por PCR (a partir de produto amplificado com um
par de oligonucleotídeos degenerados do teste de RT-PCR), permitiram a diagnose deste vírus após o
teste de Northern Blot (Brioso et al., 1996).
Passos (1999) utilizando a técnica de RT-PCR, a partir de um par de oligonucleotídeos degenera-
dos correspondentes às seqüências de aminoácidos conservados, procedeu a seleção inicial de plantas
de feijão-caupi resistentes aos sorotipos do CPSMV.
Figueiredo et al. (2000) utilizando-se da técnica de RT-PCR, a partir de um par de oligonucleotídeos
específicos ao CABMV obteve fragmento específico de 759 pb a partir de extratos foliares de feijão-
caupi infectado.
Nogueira et al. (2003), utilizando a técnica de RT-PCR, conseguiu identificar e separar os sorotipos
I e II do CPSMV.
Nogueira (2003) e Nogueira et al. (2005), após seqüênciamento de produto amplificado e confec-
ção de sonda molecular específica ao CPSMV e ao CABMV conseguiram identificar e selecionar plantas
imunes a estes vírus, permitindo desta forma auxiliar o melhoramento genético na obtenção de linha-
gens de feijão-caupi adaptadas para o Estado do Rio de Janeiro. Graças a esse trabalho, em 2006,
deverá ser lançada a primeira cultivar de feijão-caupi produtiva, imune a estes dois vírus e adaptada ao
Estado do Rio de Janeiro.
Nogueira, M.S.R. & Brioso, P.S.T., em 2006, (dados não publicados) tem desenvolvido teste
molecular para a detecção simultânea do CPSMV e do CABMV em amostras foliares de feijão-caupi,
agilizando ainda mais o processo de detecção molecular destes vírus.
 A presença de vetores ou organismo de transmissão é, por vezes, condição essencial para alguns
fitopatógenos acarretarem doença. Desse modo, a detecção do patógeno nesses organismos pode
representar importante auxílio na predição de epidemias, na identificação de possíveis vetores ou trans-
missores do patógeno, no exame dos mecanismos de transmissão em nível de interações entre o patógeno
e o vetor. O mais comum é o estudo dos organismos vetores de vírus, onde vários métodos (microscopia
eletrônica, ELISA, etc) têm sido usados para detectar os vírus nos seus vetores e para estudar o
mecanismo de transmissão em nível de interação vetor-patógeno. Porém, tais métodos têm demonstra-
do uso limitado, especialmente nos casos de transmissão não persistente, devido aos curtos períodos
de aquisição e à pequena quantidade de patógeno adquirida (López-Moya et al., 1992). Com a maior
sensibilidade oferecida pelos métodos moleculares, onde é possível detectar o patógeno a partir da
análise de um único organismo vetor, registros de detecção do patógeno no vetor têm sido demonstra-
dos. Como o caso da detecção do CPSMV, por Dot Blot, no besouro C. arcuata virulífero através de
sondas moleculares produzidas por PCR (a partir de produto amplificado com um par de oligonucleotídeos
degenerados no teste de RT-PCR) (Brioso et al., 1996).
Desta forma, observa-se que as técnicas que exploram o ácido nucléico têm representado um
verdadeiro elo entre os fitopatologistas, pois devido a sua ampla versatilidade, eficiência, precisão e
sensibilidade podem ser aplicadas nas mais diferentes linhas de trabalho, independentemente do patógeno,
do vetor e da cultura enfocada, tornando-se uma linguagem comum entre tais profissionais. Atualmente,
a utilização das técnicas de biologia molecular passou a ser uma ferramenta ímpar para os fitopatologistas,
sendo adotadas em grande parte dos laboratórios de universidades e de empresas, públicas ou privadas
na diagnose molecular de vírus de feijão-caupi (Brioso et al., 2001).

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