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Biotecnicas Moleculares

• Dra. Stefany Solano


• Técnicas de Biologia Molecular
• Fundamentos para extracción de
macromoléculas
Extracción orgánica
Proteinasa K -> Endopeptidasa K de amplio espectro (derivada de
Engyodontium album (anteriormente Tritirachium album).
• Rompe polipéptidos
• Remueve Nucleasas que degradan la fracción soluble de ácidos nucleicos.
• Incubación a 50°C permite desdoblaje de proteínas haciendo más fácil el
trabajo de le enzima
Pronase (Streptomyces griseus)-> sustituto. Proteasas de alto poder
RNAasa (10 mg/ml) (Se adiciona en Paso re-suspensión o en el paso de lisis
celular)
• Hidroliza el ARN, soporta el autoclave.
• Purificada de pancreas de bovino
Chelex

• Suspención de resina quelante de intercambio iónico que puede ser


directamente añadida a la muestra (sangre, semen) -> 1991
• Solución al 5% (p/vol).
• Alternativa económica
• Más rápida que la extracción orgánica
• Copolimeros que contienen ionies que actuan como agentes
quelantes que se unen a iones Mg -> se inactivan nucleasas y el ADN
queda protegido.
DNA

Chelex

5% Chelex +
100º C, 8
muestra + 56ºC, 30
min
min ssDNA

Desnaturalización del ADN, Resina precipita “pellet”


Lisar células (ej. con proteínas y debris.
disrupción de membranas y
Sangre, eliminar destrucción de proteínas ADN en fase acuosa.
inhibidores (hemo) celulares Uso directo en PCR
Chelex
Ventajas Desventajas
• Remueve inhibidores de la • dsDNA-> ssDNA
PCR • RFLP
• Proceso en un solo tubo • No muy económico
• Relativamente rápido
• Extracción directa (e.j ropa)
• No usa solvents
(rendimiento menor)
Extracción diferencial

Utilizado por el FBI para aislar las fracciones


masculina y femenina en casos de asalto sexual,
que contengan una mezcla de ADN de ambas
fracciones
Involucra romper las celulas epiteliales (Fem con
una incubación en SDS/Proteinasa K)
La cabeza de esperma permanece intacta durante
esta incubación
Luego son centrifugados y el supernatante
contiene la fracción de células femeninas que son
colectadas. DTT rompe puentes enlaces disulfuro -> MN
El esperma centrifugado (pellet/boton) se lava del esperma
varias veces para remover cualquier ADN residual
de la víctima.
Extracción Diferencial
• Esta técnica funciona, por que el núcleo de los espermatozoides es
impermeable a digestion sin DTT.
• La mayor diferencia con una extracción orgánica, la incubación inicial en
SDS/Proteinasa K sin DTT.
• Promega desarrolló un protocol que involucra el uso de perlas magnéticas
para retener el esperma y proceder a los procesos de limpieza con el
sobrenanadante.
• Es una técnica de pre-PCR qur permite aislar celulas masculinas para
análisis autosomal de STR
• Alternativa a uso de Y-STR (marcadores genéticos masculinos que
amplifican gen masculine en presencia de exceso ADN femenino)
Metódos en Fase sólida
• Automatización -> una de las técnicas más eficientes en el Mercado
• Seleccionar el ADN mediante su union a un sustrato (de silica)-> ADN es
retenido y demás components son lavados-> el ADN se libera de forma
purificada.
• La química entre el sorbente y analito es la base de esta técnica
(hidrofobicidad específica, propiedas polares e iónicas del soluto y
solvente) mientras que las interacciones químicas débiles (van der Waals,
interacciones polares, puentes de hidrógeno) son las que determinan los
mecanismos de retención.
Métodos de extracción en fase sólida

2) Remoción de
3) Purificación del
membrana lipidica, 4) Concentración
1) Lisis cellular ácido nucleico y
proteinas y otras del acido nucleico
selección
macromoléculas
Métodos de extracción de fase sólida
Matrices de Silica: afinidad con ADN -> 1979 (bajo condiciones
alcalinas y ↑ [sal] )
• Fundamento: ADN (-) y matriz (+). Unión -> elución
mediante solución hipoosmótica (agua libre de nucleasas, o
buffers –TE).
“Salting-
• Iones de sodio que atraen O2 –vo en el grupo fosfato del ácido out”
nuclecio (NA), esto hace que los NA se vuelvan insoluble en
presencia de ↑ [sal] y pH ácido.
Métodos de extracción de fase sólida

Matriz de silica
Condiciones alcalinas, ↓[sal]
Métodos de Extracción en Fase sólida
• ADN de alta pureza, fácil, reproducible, repetible y cuantificable

• Incapaz de recuperar pequeños fragmentos de ADN de forma


eficiente -> se unen fuertemente a la matrix de silica.
Métodos de
extracción con
fase sólida
• Perlas magnéticas
• RNA and ADNg, plasmídico,
mADN
Métodos de extracción de fase sólida
• Papel FTA (matriz de nitrocelulosa)
• Australia –> para conservear ADN
• Fitzco/Flinder Technology
Agreement
• Matriz de nitrocelulosa que
contiene ->buffers, proteínas
desnaturalizantes, agentes
quelantes y absorción UV

Lisis, Remover
Sangre en papel inhibidores
inmovilización,
(secar)
corte y lavado™ Chelex?
Métodos de extracción de fase sólida
• Método FTA
• Una vez deshidratados, los ácidos nucleicos estan relativamente bien
protegidos del ambiente
• Extracciones de sangre seca ha sido exitosamente utilizada para
diagnosticos de PCR humano por más de 20 años.

- S. A. Cassol, N. Lapointe, T. Salas et al., “Diagnosis of vertical HIV-1 transmission using the polymerase chain reaction and dried blood spot specimens,”
Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes,vol.5,no.2, pp.113–119,1992.
- S. A. Cassol, S. Read, B. G. Weniger et al., “Dried blood spots collected on filter paper: an international resource for the diagnosis and genetic characterization
of human immune deficiency virus type-1,” Memorias do Instituto Oswaldo Cruz,vol.91, no. 3, pp. 351–358, 1996.
- E.-H. Choi, S. K. Lee, C. Ihm, and Y.-H. Sohn, “Rapid DNA extraction from dried blood spots on filter paper: potential applications in biobanking,” Osong Public
Health and Research Perspectives,vol.5,no. 6,pp.351–357,2014
Métodos de Extracción de ARN
• Muy similares a los descritos para ADN
• ARN-> moléculas cortas, menos tendencia a trasquillarse (disrupción
puede ser más vigorosa)
endógenas
• ARN-> vulnerable a digestion con ARNasas
exógena

• Utilizar agua DEPC: chemical diethylpyrocarbonate. Inactiva


ribonucleasas mediante modificaciones covalentes. Evitar soluciones
con Tris (inactivación)
• Incluir detergente fuerte para desnaturalizar inmediatamente RNAsas
• Tratamiento con ADNasa para remover ADN y precipitar ARN con
etanol o isopropanol
Métodos de Extracción de ARN
• Tiocianato de guanadina-> fuerte inhibidor de
ARNasa y desnaturalizador de proteinas

• Especie más abundante de ARN-> rRNA


• 23S and 16S for prokaryotes
• 18S and 28S for eukaryotes
Métodos de Extracción de ARN
1)Lisis declular y desnaturalización de ribonucleasas
2)Aislamiento del ARN de otras macromoléculas (minimizer actividad
de ARNasa)
3) El tipo de tejido determinará el método de extracción
4) Manejar todo en frio
Métodos de Extracción de ARN
• Preparation of Poly(A)+RNA
• Separa ARNr y ARNt del ARNm
• ARN total se desnaturaliza para exponer las colas poly-A.
• Se utilizan oligo(dT) [columnas, magnetic beads] y se lava el
sobrenadante.
• Se eluyen las colas poly-A removiendo la sal de la solución
Biotecnicas
Moleculares
Cuantificación de ácidos nucleicos
Biotecnicas Moleculáres (BIF 4780/19)
Dra. Stefany Solano González
Cuantificación y control de calidad del ADN
APROXIMACIÓn MEDIANTE GEL DE AGAROSA
• Estimación rápida de la concentración de ADN
• El % del gel de agarose determinará el rango de tamaño que se
resolverá con mayor claridad en el gel.
• Agentes intercalantes -> Bromuro de Etidio, SYBR® Green, GelRed
Cuantificación y control de calidad del ADN
Ej. 1-> 5µL de muestra de ADN sin diluir se carga en el gel y tiene una
intensidad similar a 100ng del standard, la concentración del ADN es
aproximadamente de 50 ng/uL.

Ej. 2. -> 5uL de ADN (1/10) se carga en el gel y tiene una intensidad
similar a 100ng del standard, la concentración del ADN es
aproximadamente de 10 ng/uL (100nguL-1/10uL ).
Cuantificación y control de calidad del ADN
• Métodos visuals utilizando fotografía de gel de agarosa
Cuantificación y control de calidad del ADN
ESPECTROFOTOMETRIA-> Absorbancia
• Estructura de macromoléculas las hace absorver luz UV
• Ácidos nucleicos-> dobles enlaces de las bases purinas y pirimidinas.

• Máxima absorbancia (densidad óptica –OD-) relaciona linearmente


con la [ de macromolécula] -> Ley de Beer

cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de


la concentración en la solución.
Cuantificación y control de calidad del ADN
• Factor de conversión: 1 unidad de absorbancia (OD) es
aproximadamente:

• •50 µg/mL de ADN de doble cadena


• •40 µg/mL de ARN
• •33 µg/mL de ADN de hebra sencilla
• •30 µg/mL de oligos (primers o dNTPs)

Espectrofotómetro de luz UV
Cuantificación y control de calidad del ADN
Cedido por R. Umaña

absorbancia
Cuantificación y control de calidad del ADN
Cálculo de [ ADN/ARN] mediante espectrofotometría
¿15 uL de ADN en 735 uL de agua?
735+15 = 750/15 = 50

DNA yield (µg) = DNA concentration × total sample volume (ml)

Equivalencias:

ug/uL -> 1.63/1000 -> 0.00163 ug/uL


ng/uL -> 1.63*1000 -> 1630 ng/uL
Cuantificación y control de calidad del ADN
Calidad del ácido nucleíco
• Densidad óptica

Ácidos nucleicos absorben a 260 nm

Amino ácidos de proteínas absorben a 280 nm

Compuestos fenólicos, aromáticos, carbohidratos y otros a


230 nm
¿Cómo saber si mi ADN esta limpio? Obtuve coeficiente de 1.5
260/230 (óptimo 1.7 a 2.2; > a 1.5)
260/280 -> 1.7-2 (1.8 IDEAL para ADN) ¿Contaminado
260/280 -> 2 IDEAL para ARN con qué? Carbohidratos, sales, fenoles o
compuestos aromáticos
Cedido por R. Umaña Castro
NanoDrop

- Pipeteo directo en el micropedestal (No cubetas)


- Poco volumen utilizado (1uL)
Module: Nucleic Acid
- Obtención directa de datos
Path: 10 mm
Software: 2.1.0
Firmware:

Plate ID Well Sample ID Conc. 260/280 260/230

PC104 P 17,28 ng/ul 0,45 0,08


PC104 T 77,05 ng/ul 1,9 1,51

ARN PC48 P
PC48 C
50,22 ng/ul
75,83 ng/ul
1,27
1,07
0,48
0,4
PC48 T 101,2 ng/ul 1,86 2,02
PC48 S 69,78 ng/ul 1,43 0,74
PC104 S 40,85 ng/ul 1,66 0,99
C17 104 ng/ul 1,31 0,76
Sano A/B 30,31 ng/ul 1,93 1,59
Cuantificación y control de calidad del ADN
FLUORIMETRIA-> Fluorescencia
• Fluorómetros y tintes fluorescents de union al ADN
• Métodos de fluorescencia más sensibles que absorbancia -> ↓[material]
• Métodos de fluorescencia más mediciones específicas de ADN y ARN
que espectrofotometría
• Buffers que contienen fluoróforos son altamente selectivos-> kit
específico para dsDNA, RNA total - sRNA, Proteínas, ssDNA-Oligos
(target)
• Los fluoróforos tienen fluorescencia basal muy baja, pero cuando se
unen al target se intensifica la fluorescencia.
Cuantificación y control de calidad del ADN

¿Qué se require?
Fluoróforo
Fluorómetro
Material a cuantificar
Estándares
Cuantificación DNA y integridad/calidad de RNA mediante fluorimetría
Cedido por R. Umaña Castro

http://www.thermofisher.com/cr/en/home/industrial/spectroscopy-elemental-isotope-
analysis/molecular-spectroscopy/fluorometers/qubit/qubit-fluorometer.html
Qubit 4 Fluorometer (VIDEO)

https://www.youtube.com/watch?v=gtSLkbaLlMU

Qubit vs Nanodrop

https://www.youtube.com/watch?v=586i_mviiNc
Integridad del ADN/ARN
Bioanalyzer Agilent
• Altamente sensible
fragmentos de ADN
hasta de 0.1 ng.
50 pg/µL of total RNA
• Mínimo consumo de or 250 pg/µL of mRNA
muestra (1 µL)
• Resultados rápidos (~30
minutos).
• Seguro y no tóxico
25–500 ng/μl Total ARN 5-500 pg/μl de
ó 25–250 ng/μl mRNA ADN total
Integridad del ARN
Integridad del ARN
Integridad del ARN
Integridad del ADN