BIOLOGIA CELULAR

MICROSCOPIA
Y
CLASIFICACION DE BACTERIAS

PAOLA GIULLIANA DIAZ RODRIGUEZ

PRESENTADO A:
Dr. PABLO ENRIQUE PEDRAZA

UNIVERSIDAD PEDAGOGICA Y TECNOLOGICA DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE MEDICINA
TUNJA
SEPTIEMBRE 2, 2015
 INTRODUCCIÓN

La microscopia es el conjunto de técnicas y métodos destinados a hacer visible los

objetos de estudio que por su pequeñez están fuera del rango de del ojo normal. La
microscopía óptica, consiste en hacer pasar luz visible de una fuente (en el sujeto de
estudio) a través de lentes ópticos simples o múltiples, para lograr una vista ampliada
de la muestra. La imagen resultante puede ser detectada directamente por el ojo humano,
impresa en una placa fotográfica o registrada y mostrada digitalmente. El microscopio
es un instrumento óptico que le ha permitido al hombre realizar numerosas
investigaciones y descubrimientos, para mostrarle al mundo la realidad de mucho de los
objetos y seres microscópicos. Comprobada la utilidad del microscopio como
instrumento científico, el trabajo posterior de los ópticos se centró en el
perfeccionamiento de las lentes y la consecución de una mejor calidad de imagen y
mayores ampliaciones de la misma.

De esta forma, podemos hacer uso de la microscopia óptica para estudiar y clasificar
microorganismos tanto eucariotas como procariotas. Las bacterias son un ejemplo de
microorganismos procariotas que pueden ser observados en el microscopio óptico.

Las bacterias son seres generalmente unicelulares que pertenecen al grupo de los
protistas inferiores. Son células de tamaño variable que habitan abundantemente en
nuestro medio y hasta en nosotros mismo, las diferencias más notorias entre las bacterias
dependen de su forma. Hay tres tipos morfológicos generales muy distintos entre sí: La
forma esférica o de cocos, la forma alargada o de bacilos y las formas espirales, de las
cuales son subgrupos los vibriones, espirilos y espiroquetos. Para poder estudiar más a
fondo las bacterias existen diversas técnicas que permiten diferenciar las estructuras y
el grupo al cual pertenecen, en esta ocasión utilizamos la tinción de Gram (Cristian
Gram 1883) la cual es muy común y efectiva en momento de estudio de bacterias ya
que nos permite hacer una clasificación más concisa teniendo en cuenta los parámetros
de Gram negativa y Gram positiva. Basándonos en estos conceptos el manejo de
bacterias es más sencillo ya que esta técnica nos permite reconocer las características
de la composición química de los microorganismos.
 OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL:

 Reconocer la acoplación, partes y manejo del microscopio óptico y sus

conceptos, para clasificar los diferentes tipos de bacteria existentes, según su
tamaño y morfología.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

 Comprobar la importancia del microscopio en el desarrollo de las ciencias

biológicas.
 Manejar adecuadamente la técnica de preparar y observar diferentes materiales,
así como el ajuste y enfoque correctos de sus imágenes.
 Conocer y estudiar la morfología de bacterias.
 Realizar la tinción de Gram con el fin de obtener algún tipo de clasificación
bacteriana.
 Aprender a diferenciar los microorganismos Gram positivos de los Gram
negativos.
 MARCO TEORICO

MICROSCOPÍA

El estudio detallado de los componentes de células y tejidos Animales o vegetales, por

el tamaño que poseen, requiere el Uso de instrumentos que permitan ampliar muchas
veces Más la imagen de las estructuras que los constituyen.
El instrumento que fue empleado por los primeros biólogos para estudiar la célula y los
tejidos, es el microscopio. El Nombre deriva etimológicamente de dos raíces griegas:
mikros, que significa pequeño y skopéoo, que significa observar. Es decir el microscopio
es un instrumento que sirve para observar objetos o estructuras pequeñas.

RESEÑA HISTORICA DEL MICROSCOPIO

Los orígenes del microscopio son inciertos; probablemente en Holanda, en la ciudad de

Middelburg entre 1590 y 1610, algunas personas relacionadas con el mundo del
espectáculo inventaron tanto el microscopio compuesto como el telescopio. Hans
Janssen y su hijo Zacharias, fabricantes de anteojos, se mencionan como posibles
inventores. Sin embargo, algunos atribuyen a Galileo Galilei su invención en la primera
mitad del siglo XVII, gracias a que él difundió el microscopio y su uso. El microscopio
compuesto original consistía en dos o más lentes colocadas en un tubo rígido.

Los primeros usuarios bien conocidos fueron M. Malpighi, de Italia, A. van

Leeuwenhoek, de Holanda; Hooke y N. Grew, de Inglaterra. Leeuwenhoek fabricó un
microscopio simple (fig. 4-1) y Hooke utilizó un microscopio compuesto. Los
instrumentos empleados por Leeuwenhoek eran superiores a aquellos utilizados por
Hooke, en parte debido a que se desconocía el efecto de las aberraciones de las lentes y
como corregirlas. El microscopio compuesto de Hooke sumaba los defectos de los dos
juegos de lentes (objetivo y ocular), dificultando la observación, de manera que en la
historia de la microscopía fue Leeuwenhoek quien realizó la mayor cantidad de
descubrimientos con su microscopio simple.

Sin embargo, el microscopio compuesto sería el instrumento con más futuro. El

instrumento de Hooke del año 1665 tenía las partes básicas, dos lentes (una que
aumentaba la imagen de la otra), una estructura mecánica, mecanismos de enfoque y un
frasco esférico para concentrar la luz (fig. 4-2). Mejoras considerables se han realizado
desde entonces.

Aunque algunos fabricantes como Culpeper y Cuff crearon microscopios apropiados y

mejorados por modelos con bases en trípode y la conocida base en herradura; no
obstante, el verdadero microscopio útil apareció con la invención de las lentes
acromáticas, desarrolladas en Inglaterra por Chester Moore Hall en 1729. El desarrollo
de los instrumentos de óptica es inseparable del de la industria del vidrio y la fabricación
de las lentes (61). Sin embargo, aún era difícil fabricar lentes acromáticas poderosas y
a finales del siglo XVIII Jan y Harmanus van Deyl lo lograron e iniciaron la
comercialización de objetivos acromáticos. Las lentes con mayores aperturas numéricas
fueron realizadas alrededor de 1890. Un fabricante famoso de microscopios de calidad
superior era la firma de Powell y de Lealand, quienes elaboraron objetivos de alto poder,
apocromáticos y de inmersión con una apertura numérica de 1,50.

Otros creadores fueron Ross y Smith. Karl Zeiss Jena realizó objetivos de inmersión
diseñados por Ernst Abbe quien fue el fundador de la teoría óptica de las lentes del
microscopio y desarrolló el diseño de las mismas basado en un procedimiento
matemático riguroso. A finales del siglo XIX los microscopios de campo claro fueron
modificados para obtener campo oscuro y polarización, detalles que permitieron
incrementar el contraste.

A principios del siglo XX la fabricación de microscopios se concentró en Alemania y

en los años sucesivos se desarrolló la fluorescencia, contraste de fase, interferencia,
holografía, luz ultravioleta, rayos X, métodos con electrones y protones, microscopios
computarizados para la observación, cuantificación y análisis tridimensional. Estos
instrumentos abrieron muchas posibilidades en el campo de la microscopía.

Los fabricantes (Leitz, Zeiss, Olympus, y otros) respondieron a muchas necesidades,

haciendo microscopios más efectivos, de uso universal, capaces de utilizar el tipo de
radiación (luz visible o no) que revele de la mejor manera posible la naturaleza del
espécimen y convierta detalles invisibles de la imagen en un patrón visible que pueda
ser analizado.
Figura 4-1.-Microscopio de Leeuwenhoek. La lente está instalada entre dos placas de
bronce. Lo que se quiere observar se coloca en la punta de un tornillo, de manera que
se puede regular en forma precisa la distancia entre el objeto y la lente; el observador
tiene que acercar el ojo al instrumento y mirar a través de la lente.

Figura 4-2.-Microscopio utilizado por Hooke.

PASOS PARA EL USO DEL MICROSCOPIO:

1. Encienda el microscopio
2. Coloque el objetivo de menor aumento ( 4X)
3. Baje la platina completamente girando el tornillo macrométrico.
4. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar
en esas condiciones
5. Tome la lámina con la preparación fíjese que esté completamente seca en la
parte inferior
6. Coloque la lámina con la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas.
7. Procure que la preparación quede centrada, girando el tornillo para
desplazamiento del carro móvil
8. Gire el tornillo macrométrico en sentido contrario a las agujas del reloj para subir
la platina hasta el tope. Debe hacerlo mirando directamente y no a través del
ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación.
9. Cierre o abra el diafragma hasta una posición intermedia, accionando su perilla
en sentido contrario a las agujas del reloj para que la luz no sea ni muy brillante
ni demasiado tenue.
10. Inicie la observación con el objetivo de 4X.
11. Mirando a través de los oculares, separe lentamente el objetivo de la preparación
con el tornillo macrométrico en sentido de las agujas del reloj, hasta lograr
observar la imagen.
12. Cuando se observe algo nítida la muestra, gire el tornillo micrométrico hasta
obtener un enfoque fino
13. Gire el revolver
14. Coloque el objetivo de 10X
15. Visualice con el objetivo de 10X y detalle las estructuras
16. Gire el revólver y visualice con el objetivo de 40X enfoque con el tornillo
micrométrico y detalle las estructuras.
PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO MODERNO

El microscopio compuesto de uso común también se conoce con el nombre microscopio

óptico en base a que sus propiedades derivan del empleo de lentes ópticas. Está
constituido por cuatro grupos de dispositivos o sistemas articulados de tal manera que
garantizan un funcionamiento óptimo y ergonómico (ver fig. 4-3):

• Sistema mecánico: Conjunto de piezas que sirven de soporte a las lentes y demás
elementos (pie o base, columna, mecanismo de enfoque, platina, revolver, tubo).

• Sistema óptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y resolución

(objetivos y ocular)

• Sistema de Iluminación: Elementos que producen las radiaciones (luz visible o no) y
transmiten, reflejan y regulan tanto la intensidad como la cantidad de rayos que van a
incidir sobre el espécimen (lámpara o fuente de iluminación, espejo, condensador y
diafragma).

• Accesorios: Son aditivos que permiten extender las capacidades del instrumento
(cámaras fotográficas, de video, computadoras, accesorios para dibujar, entre otros).

Figura 4-3.-Microscopio compuesto moderno con sus partes.

SISTEMA MECÁNICO DEL MICROSCOPIO

La parte mecánica del microscopio también se denomina montura y es de forma y

dimensiones muy variables, dependiendo del fabricante y el precio del instrumento.

De manera general se describen modelos grandes, medianos y pequeños o portátiles.

Los modelos grandes poseen todos los aditamentos que garantizan un trabajo
profesional y permiten el intercambio de piezas y accesorios para realizar los trabajos
más variados y su costo es el más elevado. Los modelos medianos no convienen a todo
tipo de investigación pero son más prácticos puesto que su precio es menor gracias a su
construcción más simple. Los microscopios portátiles responden a necesidades más
restringidas y producen aumentos menores, conviniendo para observaciones someras.
Toda montura, por complicada que sea posee los siguientes elementos: pie o base,
mecanismo de enfoque, la platina, el revólver y el tubo del ocular.

Pie o base

Generalmente en herradura o en Y, aunque también puede ser rectangular, con un peso

considerable que garantiza la estabilidad del instrumento. La base aloja la fuente de
iluminación y puede contener un mecanismo para regular la intensidad luminosa.

Sirve de soporte a una columna o brazo sobre el cual reposa el resto del aparato. La
columna puede ser inclinada; en su parte más inferior se dispone el condensador y la
parte superior posee una cremallera que permite desplazar en sentido vertical el
condensador, la platina o el revólver y el tubo. Las ventajas que procura el microscopio
inclinado son múltiples y la posición es más confortable para el observador (actividad
que es muy incómoda cuando el tubo del microscopio es vertical).

Mecanismo de enfoque

Se logra desplazando en sentido vertical ya sea la platina donde se coloca el espécimen

o ya sea el revólver donde están colocados los objetivos, de modo que se pueda centrar
el punto focal del objetivo que se está utilizando es ese momento. Se logra mediante dos
mecanismos, primero uno rápido del tornillo macrométrico y segundo, otro lento del
tornillo micrométrico.

La cremallera que permite el movimiento rápido del tornillo macrométrico posee dientes
que se engranan y producen un movimiento tosco para lograr un enfoque aproximado.
Se utiliza para enfocar con los objetivos de poco aumento y para subirlos rápidamente
con la finalidad de colocar o retirar de la platina el preparado histológico.
El tornillo micrométrico por el contrario posee una graduación tal que cada división de
la rosca permite un movimiento vertical imperceptible en el orden de 0,001 mm. Esta
disposición permite evaluar de manera aproximada el espesor de los objetos,
considerando el número de vueltas que realiza el tornillo al enfocar su parte más
superficial y luego la más profunda.

El movimiento del tornillo micrométrico tiene una extensión de 5mm aproximadamente

y está limitado. Permite un enfoque fino y se utiliza con los objetivos de mayor aumento
.

La platina

Es el soporte horizontal donde se colocan las preparaciones histológicas. Presenta en el

centro un orificio circular por donde pasa el rayo de luz producido por la fuente luminosa
y proveniente del condensador. Generalmente es de forma cuadrada y posee un sistema
de fijación e inmovilización de la lámina porta-objeto compuesto por pinzas o una pieza
articulada que esta fija a otro dispositivo, el carro.

Este dispositivo permite el examen metódico y completo de la preparación al

proporcionar un desplazamiento hacia adelante o hacia atrás y de derecha a izquierda y
viceversa.

Otra pieza, el vernier (denominado así gracias al nombre de su inventor en 1631),

también llamado nonius, consiste en dos pequeñas reglas graduadas en milímetros cuya
finalidad es la de obtener coordenadas aproximadas que sirven de referencia para
localizar una estructura determinada en la preparación. En la práctica, el uso del vernier
no es frecuente, se hace un poco complicado anotar las cifras y más difícil aún colocarlas
en las reglas y localizar la estructura en cuestión. Además, estas cifras solo son válidas
para el microscopio en el cual se obtuvieron. Hay otros procedimientos más simples
para tal fin.

El revólver

Considerado como un accesorio del tubo. Es un implemento muy importante que

permite el intercambio rápido de objetivos mediante un movimiento de rotación. El
revólver está constituido por una semi-esfera que posee una serie de anillos en los cuales
van atornillados los objetivos. Esta pieza gira alrededor de un eje que está colocado en
la parte inferior del tubo. Puede ser de diversas formas y de igual manera, alojar un
número variable de objetivos (dos, tres, cuatro o más).
El tubo

Soporta la porción óptica del microscopio. Es un cilindro hueco de longitud variable,

cuyo interior está pintado de negro mate y posee un diafragma para impedir la formación
de reflejos y facilitar la observación. El tubo puede ser doble y alojar dos lentes oculares
(microscopio binocular). En los modelos de microscopios grandes destinados a la
microfotografía, hay un tercer tubo accesorio, generalmente más largo y vertical que
sirve para conectar una cámara fotográfica sin necesidad de lente ocular.

SISTEMA ÓPTICO DEL MICROSCOPIO

Los microscopios modernos están diseñados para proporcionar imágenes aumentadas y

nítidas de los especímenes que se observan. Los componentes ópticos están colocados
en una base estable que permite un intercambio rápido y un alineamiento preciso. El
sistema óptico está constituido por dos juegos de lentes: El objetivo y el ocular.

Los objetivos

Representan el componente óptico más importante del microscopio. Su principal

función consiste en colectar la luz proveniente del espécimen y proyectar una imagen
nítida, real, invertida y aumentada hacia el cuerpo del microscopio.

Constituyen un sistema óptico formado por una o varias lentes, las cuales deben estar
centradas y los ejes ópticos de cada una deben coincidir exactamente para formar el eje
óptico del sistema.

Sus lentes están hechas a partir de cristales (espatos, fluorita, entre otros) con un alto
grado de calidad y funcionamiento; su precio depende del poder de aumento, resolución
y de la corrección de las aberraciones. Muchos fabricantes elaboran objetivos que
pueden ser intercambiados y empleados en microscopios de otras marcas comerciales.

Clasificación:
Tomando en cuenta el grado de corrección de las aberraciones hay dos categorías de
objetivos para el microscopio, los objetivos acromáticos y los objetivos apocromáticos.
En cada categoría se distinguen aún dos grupos, los objetivos secos y los objetivos de
inmersión:

• Objetivos acromáticos: Presentan corrección cromática para la luz azul y roja.

Corrección de esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz de
color verde y son ideales para microfotografía blanco y negro. Se asume que un objetivo
es acromático cuando no posee ninguna denominación.

• Objetivos semi-apocromáticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita. Corrigen

para el azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La corrección de esfericidad es para
dos colores, el verde y el azul. Dan buenos resultados con luz blanca y están mejor
diseñados para la microfotografía en colores.

• Objetivos apocromáticos: Poseen el más alto nivel de corrección de aberraciones y por

ello, son más costosos. Presentan corrección cromática para cuatro colores (azul oscuro,
azul, rojo y verde); corrección de esfericidad para dos o tres colores. Son los mejores
objetivos para microfotografía y video a color. Debido a su alto grado de corrección,
estos objetivos poseen mayores aperturas numéricas que los acromáticos y las fluoritas.
Esto puede ser un inconveniente puesto que el campo de observación se presenta un
poco curvo.

Los tres tipos de objetivos proyectan imágenes con cierta distorsión que se manifiesta
como curvaturas y al ser corregidos para este defecto se denominan plan-acromáticos,
plan-fluoritas o plan-apocromáticos.

Objetivos secos y objetivos de inmersión:

Estos objetivos difieren entre sí por la naturaleza del medio interpuesto entre el cubre-
objeto de la lámina histológica y la lente frontal del objetivo. En los objetivos secos el
medio interpuesto es el aire cuyo índice de refracción (n=1) es muy diferente del
índice del vidrio porta y cubre-objeto (n=1,5). Por el contrario, en los objetivos
denominados de inmersión el medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del
objetivo es un líquido cuyo índice de refracción es lo más próximo al del vidrio. Este
líquido puede ser agua destilada (n=1,33) o mejor aún aceite de cedro, que posee un
índice de refracción (n=1,515) casi idéntico al del vidrio.

La ventaja de los objetivos de inmersión consiste en la disminución o eliminación de la

refracción de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia la
luminosidad de la imagen está aumentada, mientras que en los objetivos secos, está
disminuida. El empleo de la inmersión aumenta el ángulo de apertura del objetivo y
permite mayor resolución gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos
refractados (ver fig. 3-5) y solo puede utilizarse con objetivos de mayor aumento.

Óptica finita y óptica infinita:

La microscopia de luz o fotónica ha experimentado cambios radicales en sus sistemas
ópticos en los últimos años. El tubo que soporta tanto el revólver por un extremo, como
el ocular por el otro, se confeccionaba con una determinada longitud y los fabricantes
elaboraban objetivos que funcionaban para esa longitud (longitud finita) que fue
estandarizada a 160mm y en algunos casos (Leitz) a 170mm. En muchos modelos de
microscopios modernos el tubo no es rectilíneo y los rayos de luz transmitidos desde el
objetivo hacia el ocular son desviados por prismas, especialmente en los microscopios
trinoculares para fotografía. Emplear objetivos diseñados para una determinada longitud
de tubo en otro microscopio que no corresponda produce incremento en las aberraciones
de esfericidad, ocasionado por una longitud de tubo diferente.

Los microscopios modernos poseen un ensamble complejo de lentes, espejos y prismas

que transmiten la luz desde el objetivo al ocular y actualmente casi todos los fabricantes
están elaborando microscopios que puedan aceptar objetivos diseñados para realizar una
corrección infinita. Tales objetivos proyectan una imagen al infinito la cual es captada
por otra lente que se introduce en el tubo y que a su vez la proyecta al punto focal del
ocular. Los objetivos con esta corrección poseen el símbolo infinito grabado en la parte
externa.

Los sistemas corregidos al infinito son significativos porque corrigen la aparición de

imágenes fantasma que con frecuencia se observa en microscopios anteriores, no
obstante estos nuevos modelos son de mayor tamaño (fig. 4-4).

Figura 4-4.-Esquema que muestra el principio de

los objetivos con corrección al infinito.

Estructura de los objetivos:

Generalmente es un tubo cilíndrico que contiene en su interior un revestimiento anti-
reflejos y las diversas lentes colocadas en serie y alineadas (fig. 4-5). En la parte externa
posee grabadas las especificaciones y características.

Figura 4-5.-Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromático que contiene una lente frontal
y dos pares internos, (b) objetivo semi-apocromático o fluorita, con cuatro pares de
lentes y (c) objetivo apocromático que contiene un triplete, dos pares, un menisco y una
lente esférica frontal.

Nomenclatura de los objetivos:

La identificación de las propiedades individuales de los objetivos es posible gracias a la
nomenclatura grabada en la parte exterior y contiene todas las especificaciones
necesarias para su uso apropiado. La minuciosa información, generalmente en el idioma
inglés, puede contener (fig. 4-6):

Figura 4-6.-Nomenclatura del objetivo. Las propiedades ópticas especiales en este

objetivo denotan que puede emplearse en Interferencia de contraste diferencial (DIC
differential interference contrast) y la H significa que puede emplearse en microscopios
con platina caliente (heating stage).
 Código de color
Medio de inmersión
de inmersión

Negro Aceite

Naranja Glicerol

Blanco Agua

Rojo Especial o multiuso

Código de color
Aumento
de aumento

Negro 1x, 2.5x

Marrón 2x, 2.5x

Rojo 4x, 5x

Amarillo 10x

Verde 16x, 20x

Azul turquesa 25x, 32x

Azul celeste 40x, 50x

Azul cobalto 60x, 63x

Blanco, crema 100x, 250x, 200x

Tabla 4-1.-Códigos de color en los objetivos microscópicos.

El ocular

El ocular (del latín oculus = el ojo) está formado por lentes que generalmente son
separadas por un diafragma, montadas en las extremidades de un cilindro que va
introducido en la parte superior del tubo. El ocular sirve para observar la imagen real e
invertida que produce el objetivo, ejerciendo dos funciones:

• Aumenta la imagen y la transforma en una imagen virtual, derecha con respecto a la

imagen del objetivo, pero aun invertida, con respecto al objeto. Posteriormente el ojo
endereza la imagen.

• Aplana y aclara el campo óptico o plano circular en el que aparece el objeto.

La lente superior se denomina lente ocular y es la que produce el aumento de la imagen
real del objetivo; la lente inferior también se denomina colectora y es la que aplana y
aclara el campo (fig. 4-7).

Clasificación:

• Oculares de Huygens: Empleados con los objetivos acromáticos y formados por dos
lentes plano-convexas cuya convexidad está dirigida hacia el objetivo y el diafragma se
ubica entre ambas. También denominado ocular negativo porque la imagen se forma
entre las dos lentes. Muy común en modelos de microscopios antiguos.
• Oculares de Ramsden: Conocido como ocular positivo, formado por varias lentes
unidas entre sí y colocadas por encima del diafragma. Generalmente corrigen
aberraciones y funcionan de manera óptima con los objetivos corregidos al infinito.
• Oculares compensadores: Son oculares que corrigen la diferencia de aumento para
los diversos colores (diferencia cromática de aumento) que se aprecia en los objetivos
apocromáticos. No tiene buen rendimiento con objetivos acromáticos secos.
• Oculares de proyección: Posee una lente que permite la proyección de la imagen en
una pantalla colocada a cierta distancia del ocular, ideal para dibujar o para exhibición.
• Oculares aplanéticos: Tienen la propiedad de formar un campo perfectamente plano
y el poder de resolución es igual tanto en el centro como en la periferia del campo óptico.
• Oculares peri-planáticos: Aplanan la curvatura de campo que se produce con
objetivos de mayor aumento. Son semejantes a los oculares de tipo Huygens pero con
una doble lente ocular.
Figura 4-7.-Modelos de oculares. (a) Ocular de Huygens, (b) ocular compensador y (c)
ocular de Ramsden. Los oculares negativos (a y b) poseen el diafragma entre las dos
lentes (colectora y ocular) y los oculares positivos poseen el diafragma por debajo de
las lentes (c).

Uno de los diseños de oculares más avanzados es el ocular Periplan (fig. 4-8) que
contiene siete lentes que corrigen las aberraciones cromáticas, la curvatura de campo y
su empleo óptimo es en combinación con objetivos de gran poder de aumento.

Figura 4-8.-Diagrama de la constitución del ocular Periplan. Es un ocular negativo Los

modelos de microscopios más simples poseen un solo ocular (mono-oculares), sin
embargo hay microscopios binoculares y algunos modelos más modernos son
trinoculares, especiales para la microfotografía. Los binoculares tienen los objetivos
dispuestos con una inclinación de 45º para realizar la observación cómodamente.

Campo del microscopio:

Se denomina campo del microscopio al círculo visible que se observa en el ocular.
También podemos definirlo como la porción del plano visible observado a través de las
lentes. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir que el campo
es inversamente proporcional al aumento del microscopio. La forma del campo está
determinada por el diafragma fijo del ocular, que generalmente es de forma circular, no
obstante el campo puede ser cuadrado y esta forma es muy útil al realizar estudios de
coprología o hematología, en donde se requiere reconstruir la totalidad del campo de
observación de la preparación, lo cual se dificulta con un campo circular clásico al
quedar zonas superpuestas.

El ocular produce un aumento adicional a la imagen proporcionada por el objetivo. El

valor de este aumento está inscrito en la superficie del ocular y generalmente es de 10x,
12.5x, 15x, 20x o 25x. Otro valor es el número de campo que consiste en el diámetro en
milímetros de la apertura fija del diafragma, la cual puede variar desde 18mm hasta
26.5mm.

Los oculares modernos poseen otro tipo de inscripciones que denotan sus
características:
• UW: Ultra wide, en oculares que poseen un campo visual muy amplio.

• H: Para un alto punto focal del observador que usa lentes durante la observación
microscópica.

• K, C, comp: Para oculares compensadores.

• Plan-comp: Objetivos que corrigen curvatura de campo y dan campos planos.

Otra de las aplicaciones del ocular consiste en la cuantificación o medición de

estructuras del espécimen en estudio. En ciertos casos es relevante conocer el número,
tamaño o dimensiones de las células y demás elementos del tejido.

Usualmente se coloca en el plano de la apertura fija del diafragma una pieza circular de
vidrio con una escala o gradilla (fig. 4-9), la cual aparece enfocada y superpuesta a la
imagen del espécimen al encontrarse en el plano de formación de la misma. Los oculares
para la medición poseen un mecanismo de enfoque mediante rotación. Se debe calibrar
la escala de medición del ocular con cada objetivo que se use (15). En la actualidad se
puede emplear algún software de computación para realizar mediciones sobre las
imágenes digitales y obtener datos muy precisos, no obstante, el método más económico
y de uso más generalizado es la medición con los oculares.
En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura filamentosa (alambre,
pestaña, cerda) denominada señalador, con la finalidad de indicar de manera específica
alguna estructura en particular en el campo de observación. El señalador se aprecia
como una línea oscura que parte del borde del campo hacia el centro del mismo.

Muchos oculares modernos poseen una copa de goma cuya finalidad es, por una parte
colocar los ojos a la distancia correcta de observación y por otra, impedir la formación
de reflejos luminosos que dificulten la visualización. Algunos microscopios binoculares
poseen un mecanismo de enfoque del ocular que ajusta las dioptrías en caso que el
observador posea una disminución de su agudeza visual. El ajuste se realiza por
separado tanto para el ojo derecho como para el izquierdo; de igual manera se ajustan a
la distancia interpupilar del observador (usualmente entre 55 y 75 mm).

Figura 4-9.-Microfotografía de un frotis de sangre periférica en la que se observa un

campo rectangular con una escala de divisiones precisas, que en este caso son en el
orden de 1/10 mm. Para determinar el tamaño de una célula se cuenta el número de
divisiones que ocupa y la cifra se divide entre el aumento del objetivo empleado, dando
como resultado un valor que corresponde al tamaño de la misma. Si la célula mide 7
divisiones, corresponde a 7/10mm; si el aumento del objetivo es 100x, se divide
0.7mm:100 = 0.007mm = 7µm.

SISTEMA DE ILUMINACIÓN
El sistema de iluminación está constituido por las partes del microscopio que producen
o captan, reflejan y regulan la intensidad de la luz que se utiliza para la observación
microscópica. Uno de los aspectos críticos a considerar en la microscopía óptica es la
fuente de luz que se emplea para iluminar el espécimen. Si la muestra es iluminada de
manera inadecuada, la calidad de la imagen que se obtiene se verá afectada, aun cuando
se disponga de un excelente sistema óptico. La iluminación óptima debe ser brillante,
sin resplandores y en lo posible debe dispersarse de manera uniforme en el campo de
observación.

Si se emplea luz visible (fotones) es usual que al microscopio se le denomine fotónico.

En sus inicios, la microscopía se practicaba con iluminación por reflexión; se utilizaba
un espejo que se orientaba para recoger la luz solar o en su defecto, luz artificial (la luz
de una vela, mechero a gas, lámparas de aceite o petróleo) y la desviaba hacia la
preparación. Este método se mantuvo durante mucho tiempo, en parte debido al lento
perfeccionamiento de las bombillas incandescentes, que consisten en un globo de cristal
en el que se ha hecho el vacío y dentro del cual va colocado un hilo de metal (platino,
carbón, tungsteno, entre otros) que al paso de una corriente eléctrica se pone
incandescente y sirve para alumbrar.

Con el uso de la bombilla eléctrica se suprime este espejo y los microscopios pueden
utilizarse en cualquier lugar. Sin embargo, algunos modelos de microscopios actuales,
desde los más sencillos y económicos hasta los más sofisticados, aún poseen un espejo
que sirve para desviar la luz producida por la bombilla, en el caso que ésta no se
encuentre alineada con la platina.

El sistema de iluminación está constituido por la fuente de luz, el condensador y un

diafragma o iris. Como regla general, el sistema de iluminación está colocado debajo de
la platina y la finalidad es de iluminar mediante luz transmitida. En la mayoría de los
casos el estudio de las preparaciones histológicas se hace por transiluminación. En otros
casos muy específicos se emplea el método de luz reflejada, en el cual se ilumina la
superficie del espécimen mediante epi-iluminación. La fuente de luz emite una radiación
que es recogida por un dispositivo denominado condensador, que a su vez forma un
cono luminoso necesario para la visualización con objetivos de mayor aumento.

Fuentes de luz
Aparte de la luz solar, empleada en microscopios sencillos con espejo, existen
numerosas fuentes de iluminación artificial, tanto para la observación rutinaria como
para la microfotografía. La luz artificial presenta numerosas ventajas tales como la
constancia, la uniformidad y la intensidad; además es muy favorable para los mayores
aumentos. Existen varios tipos de fuentes de luz artificial:

• Bombillas de tungsteno y halógenas: La mayoría de microscopios de luz están dotados

de lámparas de este tipo cuyo poder oscila entre 10W y 100W. Se emplean como fuentes
principales o accesorias. Estas lámparas son radiadores térmicos que emiten una luz
continua en un espectro comprendido entre 300 – 1200 nm. Están constituidas por un
bulbo de cristal relleno de un gas inerte y un filamento de tungsteno que es activado por
una corriente eléctrica produciendo una importante cantidad de luz y calor. Varían
mucho en tamaño, diseño y forma. Producen una luz blanca pero incrementan la
intensidad del azul al rojo. La luz puede ser muy brillante para la observación y se reduce
con filtros que disminuyen la intensidad, denominados filtros de densidad neutra,
disminuyendo la intensidad sin alterar los colores. También se emplean filtros de colores
que compensen el color rojo, de manera que se pueda observar la imagen del espécimen
sobre un fondo iluminado neutro, blanco y claro. El vidrio azul corrige el tinte amarillo
que tiene la luz incandescente y se obtiene una luz suave y agradable que aumenta la
definición.

• Lámparas de arco eléctrico: Son lámparas que pueden contener gases (vapor de
mercurio, xenón o circonio) y son empleadas para proveer una luz monocromática con
filtros apropiados, ideal para microfotografía en blanco y negro o a colores. También se
utilizan en microscopios especiales (fluorescencia).

• Láser: En los últimos años se ha incrementado el uso de láser (Light Amplification by

Stimulated Emission of Radiation, Amplificación de Luz por Emisión Estimulada de
Radiación) (42), que consiste en un dispositivo que genera un haz de luz con
características de tamaño, coherencia, forma y pureza controladas. El láser de argón es
uno de los más utilizados, cuya emisión está en el orden de 488-514 nm. Su costo es
muy elevado y se emplea principalmente en microscopía confocal.

• LED: De las siglas en inglés Light-Emitting Diode (diodo emisor de luz) es un

dispositivo emisor de luz con características muy próximas a la luz monocromática
(espectro reducido). La luz se produce cuando una corriente eléctrica pasa a través del
material semiconductor (arseniuro de galio-aluminio) del que están hechos. Se utilizan
en una amplia gama de artefactos y lámparas. En comparación con las bombillas
incandescentes, son más interesantes porque permiten ahorro de energía con un mayor
rendimiento lumínico. Para microscopía se emplean LED de larga duración que provee
una luz muy brillante y fría; esto último es una gran ventaja, puesto que no genera calor
y la observación es más cómoda para el usuario. En la actualidad se producen
combinaciones de diodos que emiten una luz blanca.

Condensador

Es un dispositivo que tiene por finalidad formar conos luminosos grandes, con aperturas
mayores, necesarios para ver con los objetivos de mayor aumento. El término
condensador puede considerarse inadecuado, ya que no produce una condensación de
los rayos luminosos, por el contrario, produce un aumento de la sección del cono
luminoso que a su vez forma una imagen más clara. El condensador está conformado
por una o varias lentes situadas debajo de la platina del microscopio, colocadas entre la
fuente de luz y el espécimen. El primer condensador que se fabricó en 1838 (por
Dujardin) poseía tres lentes acromáticas. Al igual que en los objetivos, las lentes del
condensador poseen poder de aumento y también producen aberraciones, sin embargo,
éstas también pueden corregirse.

Figura 4-10.-Condensador tipo Abbe y objetivo adaptado. Se observa un condensador

con dos lentes y el trazado del haz de luz en un microscopio fotónico. El medio de
inmersión, en este caso aceite, se puede colocar tanto entre la lente frontal del
condensador y el preparado histológico como entre el preparado y la lente frontal del
objetivo.

Diafragma o iris

Es un dispositivo que se coloca inmediatamente debajo de la platina. Debe permitir

cambios en la apertura y con diámetros variables cuya finalidad es la de obtener conos
luminosos cada vez más estrechos y eliminar los rayos de luz sobrantes. Los primeros
diafragmas consistían en un disco de metal con agujeros de diferente diámetro, el cual
se rotaba según la necesidad. Estos discos fueron substituidos por el iris, otro dispositivo
más elaborado y con un diseño que le permite cambiar de diámetro. La apertura del
diafragma se regula en relación con el tipo de objetivo que se esté utilizando. El
diafragma o iris está pintado de negro con la finalidad de eliminar los rayos de luz
reflejada que pueden interferir con la iluminación del objeto (fig. 4-11).

Figura 4-11.-Iris con mecanismo para variar la apertura.

Iluminación Köhler

La iluminación es una variable crítica que hay que considerar al poner en

funcionamiento el microscopio. Con frecuencia el uso incorrecto de la iluminación, aún
en equipos sofisticados, conduce a la obtención de imágenes defectuosas. El espécimen
debe ser iluminado mediante una fuente de luz artificial, la cual puede producir artificios
en la imagen que se observa.

En el año 1893, el profesor August Köhler propuso un método de iluminación para

optimizar la observación microscópica y la microfotografía (15), que permite
aprovechar al máximo las capacidades de las lentes (objetivos) iluminando la muestra
en estudio con un campo de luz uniforme cuyo diámetro sea igual al del área de captura
del objetivo.

Los microscopios modernos están diseñados para aplicar la iluminación Köhler y los
requerimientos son (figs. 4-12 y 4-13):

• Condensador que sube y baja para enfocar el cono de luz.

• Bombilla con lente colectora.

• Dos diafragmas, un diafragma de campo situado a nivel de la lámpara y un diafragma

de apertura, colocado debajo del condensador.
Figura 4-12.-Iluminación Köhler. Se debe iluminar el espécimen siguiendo el esquema.
La lámpara posee un filamento (S) incandescente cuya luz es captada por la lente
colectora L1 y regulada por el diafragma de campo D1. La imagen S’ del filamento de
la lámpara es proyectada al plano del segundo diafragma D2. Este primer paso se realiza
con D1 completamente abierto. La altura del condensador L2 se regula de manera que
su punto focal esté en el plano D2. La imagen del diafragma de campo D1 es proyectada
en el plano de la preparación por el condensador.

El condensador se desplaza verticalmente hasta obtener una imagen nítida del diafragma
de campo. La iluminación ideal se consigue cuándo el condensador se encuentra lo más
cerca de la preparación. El diafragma de campo regula el diámetro de la apertura de la
iluminación y al cerrarlo se incrementan los contrastes (15). Una vez ajustada la
iluminación Köhler no se debe regular la intensidad de la luz o el brillo bajando el
condensador o cerrando la apertura de diafragma-iris, por el contrario, se regula la
intensidad de la lámpara mediante un ajuste de voltaje.
Figura 4-13.-Trayectoria de la luz en la iluminación Köhler.

FORMACIÓN DE LA IMAGEN EN EL MICROSCOPIO COMPUESTO

Con la finalidad de facilitar la comprensión de la propiedad de aumento que tienen las

lentes y en consecuencia el microscopio para observar objetos minúsculos, es necesario
conocer algunos aspectos del fenómeno de la visión. El ojo humano está constituido de
tal manera que sólo puede tener una visión clara cuando los rayos luminosos incidentes
son paralelos o ligeramente divergentes, debido a que la retina requiere la participación
del cristalino para enfocar los rayos en su superficie.
El límite para visión cercana es la mínima distancia a la cual se puede observar
claramente un objeto; varia de un individuo a otro y se estima entre 15 y 25 cm (6 y 10
pulgadas respectivamente), depende de la edad y otros factores. El valor considerado
normal es de 25 cm. El tamaño aparente de un objeto depende del ángulo formado por
dos líneas proyectadas desde el centro del ojo a las extremidades de dicho objeto (fig.
4-14)

Figura 4-14. Las líneas dibujadas desde el ojo a A y R forman un ángulo, el cual es dos
veces más grande que el ángulo de las líneas O-W. De igual manera, la distancia del ojo
a la flecha OW es dos veces la distancia del ojo a la flecha AR. La flecha en AR aparece
dos veces más grande que la flecha en OW. Las proporciones se mantienen al alejar o
acercar la flecha.

Este ángulo así formado se conoce como ángulo de visión o ángulo visual. La utilidad
de una lente convexa interpuesta entre el ojo y un objeto cercano consiste en la reducción
de la divergencia de los rayos luminosos emanados del objeto, de manera que puedan
entrar al ojo en un estado de moderada divergencia, como si emanaran de un objeto
situado más allá del límite de visión cercana y en consecuencia se forma la imagen en
la retina (fig. 4-15).
Figura 4-15. Diagrama que representa una lente bi-convexa cercana al ojo y a una
flecha pequeña (objeto en estudio) cuyos conos dibujados representan parte de los rayos
de luz divergentes emanados de varios puntos. Los rayos emanados del objeto muy
cercano, al incidir en la pupila, son aún tan divergentes que no permiten formar una
imagen enfocada en la retina; pero al pasar primero por la lente son desviados para
formar líneas casi paralelas que si pueden ser captadas por el ojo si éste está a su vez
muy cercano a la lente.

Esos rayos luminosos emanados del objeto cercano y desviados por la lente son
recibidos por el ojo como si fuesen emanados directamente por una flecha (objeto) más
grande, aparentemente situada en el límite de visión cercana del observador (aprox. 25
cm del ojo). La diferencia de tamaño entre la flecha real y la flecha imaginaria estará
determinada por el poder de aumento de la lente. La imagen formada no es real, no
puede ser proyectada en una pantalla o recogida en una placa fotográfica; es una imagen
mental. Por esta razón la imagen se denomina virtual y la distancia desde la lente hasta
la imagen formada se denomina distancia focal virtual (74,75).

Al interponer una lente bi-convexa entre un objeto y el ojo se incrementa el ángulo de

visión y en consecuencia el objeto se verá más grande (fig. 4-16)
Figura 4-16. Sin la lente colocada en f’g’ el ojo verá la flecha con el ángulo formado
por las líneas punteadas b y c, formando la imagen b’c’. Los rayos b’f’ y c’g’ emanados
de las extremidades de la flecha son refractados por la lente hacia el ojo en dirección f
y g, los cuales crean un ángulo visual mayor que hace que la fecha se vea más grande
(d-e).

Lo que se conoce sobre las propiedades de las lentes permitirá comprender el principio
del microscopio compuesto, denominado así, en oposición a la lupa (microscopio
simple) en base a que está conformado por dos sistemas de lentes, los cuales deben estar
centrados, es decir, tener el mismo eje óptico. El primer sistema, cercano al objeto en
estudio, se denomina objetivo, posee una distancia focal muy corta y es posible colocar
el objeto un poco más allá de su punto focal para obtener una imagen real, invertida y
aumentada.

El sistema de lentes a través del cual el observador examina se denomina ocular y

funciona como una lupa que aumenta la imagen real producida por el objetivo. La
distancia entre el ocular y el objetivo debe ser calculada de manera que la imagen real
obtenida por el objetivo se forme entre el ocular y su punto focal (11). El aumento del
microscopio dependerá en principio de la longitud focal del objetivo. Mientras más
pequeña sea esta longitud y el objeto se acerque al objetivo, más grande será la imagen
real.

El aumento también depende de la distancia focal del ocular y mientras más corta sea
esta, mayor será el aumento (fig. 4-17).
Figura 4-17. Esquema simplificado que muestra el trayecto que siguen los rayos
emanados del espécimen en estudio y su paso a través de las lentes objetivo y ocular
para la formación de las imágenes. La flecha ab corresponde al espécimen, que está
colocado un poco por delante del foco (f) del objetivo, el cual forma una imagen real,
aumentada e invertida en a’b’. Esta imagen se forma por dentro del foco (f ’) de la lente
ocular. El ojo del observador percibirá a través del ocular la imagen virtual, aumentada
y derecha a’’b’’ de la imagen real a’b’.
2. CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS

De acuerdo al Arbol de la Vida de Woese, microbiólogo creador de la nueva taxonomía

molecular basada en la comparación entre especies de la fracción 16s del ARN
ribosomal, se proponen 3 dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, en los que se incluye
a todos los seres vivos, aunque existen controversias.

Árbol de la vida según Carl Woese. Modificación.

Los dominios Archeae y Bacteria corresponden a las células procariotas, una de cuyas
características es la de carecer de membrana nuclear. Con base en el estudio de fósiles
y modelos, se calcula que emergieron hace unos 3.6 - 4 billones de años. Su importancia
radica en el hecho de haber desarrollado una pared celular o membrana externa que les
confirió, desde el principio, de autonomía y protección con respecto a su medio
ambiente. Desde entonces constituyeron la forma de vida más abundante en el planeta
en términos de biomasa y número de especies.

A pesar de su menor complejidad en relación a Eucarya, los integrantes de los dominios

Archeae y Bacteria pueden vivir en hábitats extremos: se les encuentra en las
profundidades de la Tierra, sobreviviendo gracias al lento catabolismo del carbono
orgánico depositado en los sedimentos, y en las profundas fuentes hidrotermales
submarinas.
Se acepta la aparición del dominio Eukarya, con membrana nuclear y orgánulos más
desarrollados, desde hace unos dos billones de años; de este dominio derivan todos los
organismos eucariontes uni y multicelulares.
Otra clasificación de los seres vivos muy utilizada es la propuesta por Whitaker y
Margulis. Ellos clasifican a los organismos en cinco reinos, Animalia, Plantae, Fungi,
Protista y Monera, en éste último reino se incluyen todas las bacterias.

Importancia De Las Bacterias

Los miembros pertenecientes a los dominios Bacteria y Archaea son las formas más
abundantes en el planeta. Las bacterias constituyen una proporción significativa por lo
que respecta al peso corporal de los diferentes hospederos (desde 0.5 k hasta unos 2.5
k). Su biomasa total llegó a estimarse en 3.5 × 1014 kg de carbono. Sin embargo, en
2008 solo se aceptaban ~7,000 especies microbianas, versus 300 000 especies de
plantas y 1 250 000 de animales, lo cual no refleja la biodiversidad total de las
bacterias. (Achtman et al., 2008).

La Bacteriología es una disciplina de la Microbiología, que ha estado presente a lo

largo de la historia de la humanidad. Las bacterias son responsables de millones de
muertes de personas a nivel mundial. Entre algunas enfermedades infecciosas
bacterianas, causantes de grandes epidemias que han mermado la población, se
encuentran: la difteria, cólera, tuberculosis, sífilis, tétanos, tos ferina, y fiebre tifoidea.
Sin embargo, también existen infecciones bacterianas que aunque están asociadas en
menor frecuencia como causa de muerte, son un problema de salud pública en países en
vías de desarrollo como el nuestro, entre las que se puede mencionar algunas de las
enfermedades "menospreciadas", emergentes. (TDR. 2015).

Otro aspecto de primordial importancia en bacteriología es la microbiota del cuerpo

humano, en especial del tracto gastrointestinal. Se estima que en el intestino de un ser
humano adulto, existe un billón (1012) de microorganismos por mililitro de contenido
fecal y alberga entre 500 y 1000 diferentes especies bacterianas. La mayoría de esos
microorganismos pertenecen al Dominio Bacteria, que incluye tanto a bacterias
gramnegativas como grampositivas.

La microbiota intestinal difiere de una persona a otra y esa diversidad se ha visto en la

composición del lumen (heces) y de la mucosa (epitelial), aunque el genotipo del
hospedero es más importante en determinar la microbiota intestinal que la dieta, edad y
estilo de vida.

La microbiota intestinal está implicada en una gran variedad de funciones en el

hospedero, involucrando cambios en el epitelio intestinal, modulación inmune,
movimiento intestinal y el metabolismo de algunas drogas.

La microbiota también está involucrada en la degradación de algunas toxinas y

carcinógenos que se ingieren en la dieta, síntesis de micronutrientes, fermentación de
substancias del alimento, ayuda en la absorción de electrolitos y minerales; asimismo
afecta el desarrollo y diferenciación de los enterocitos, a través de la producción de
ácidos grasos de cadena corta. Finalmente, la microbiota previene la colonización del
intestino por bacterias patógenas como: Escherichia coli, Salmonella, Clostridium y
Shigella.

Actualmente se ha resaltado el papel que tiene la microbiota en la obesidad del humano.

Las actividades metabólicas de la microbiota intestinal facilitan la extracción de calorías
de los alimentos ingeridos y el almacenaje de esas calorías en el tejido adiposo del
hospedero, para su posterior utilización y proveen energía y nutrimentos para el
desarrollo y proliferación microbiana. Las diferencias en la recuperación de energía en
los individuos puede ofrecer una explicación fisiológica del porqué algunos pacientes
presentan obesidad, pero no comen en abundancia. Se ha sugerido que la microbiota
intestinal de algunas personas tiene una eficiencia metabólica específica y que ciertas
características en la composición de la microbiota pueden predisponer a obesidad.

Por otra parte, las bacterias presentan un metabolismo tan diverso que les permite llevar
a cabo funciones tales como: La fijación de nitrógeno (conversión de nitrógeno gaseoso
a amonio), la fijación de una cantidad importante de CO2, la metanogénesis (producción
biológica de metano), así como la reducción de azufre y fierro.

Hay bacterias con capacidad para metabolizar los plaguicidas clorados e hidrocarburos.
Actualmente se trabaja en la producción de polímeros bacterianos biodegradables para
sustituir a los plásticos sintéticos.

Además, mediante procesos vigentes a nivel industrial, las bacterias se utilizan en la

producción de antibióticos (bacitracina, cefalosporina, cloranfenicol, cicloheximida,
lincomicina, nistatina, penicilina, polimixina B, estreptomicina, son algunos de ellos);
vitaminas tales como la vitamina B12 y la riboflavina, cuya síntesis es más fácil por
fermentación; aminoácidos, por fermentación directa o síntesis enzimática, entre ellos
el ácido aspártico y la fenilalanina (ingredientes del aspartame), el ácido glutámico
(empleado como saborizante bajo la forma de glutamato monosódico), la lisina (aditivo
alimentario). Por lo que respecta a enzimas microbianas, éstas se producen
comercialmente y se emplean en la elaboración de jarabes edulcorantes, detergentes,
ablandadores de carnes.

Las aplicaciones prácticas de las bacterias en la ingeniería genética incluyen: vacunas

virales (citomegalovirus, hepatitis B, sarampión, rabia); proteínas y péptidos (insulina,
factor estimulante del crecimiento, interferón alfa, interferón beta, factor de necrosis
tumoral y otros que aún no se encuentran en el mercado); vegetales y animales
transgénicos; regulación y terapia génicas.

TIPIFICACIÓN BACTERIANA

La tipificación de las bacterias se basa en el estudio de sus características mediante

técnicas que oscilan entre las más sencillas tinciones y los más complejos estudios
moleculares. Una técnica útil y de bajo costo consiste en la tinción de Gram y posterior
observación de la muestra mediante el microscopio de luz para estudiar las bacterias, su
forma, tipo de agrupación y color: grampositivas o gramnegativas. La mayor parte de
las bacterias puede ser ubicada en uno de estos dos grupos o en un tercero, de acuerdo
a la ácido-alcohol resistencia que presenten (Ziehl-Neelsen).

Algunas propiedades genéticas y fisiológicas constituyen herramientas utilizadas para

definir algunas características de las cepas, como los serotipos y biotipos, determinación
de especies en algunos grupos de bacterias, producción de toxinas. Los métodos más
sensibles se basan en el análisis del material genético. Cabe mencionar que éstos han
diversificado sus objetivos; se emplean en la identificación de subgrupos de genes
esenciales para el crecimiento, colonización, adhesión e invasión bacterianos (un
ejemplo es el IVET - siglas de "in vivo expression technology"), desarrollada para
seleccionar los genes activos únicamente durante la infección).

MORFOLOGÍA BACTERIANA

Las bacterias que tienen forma esférica u ovoide se denominan cocos. Y si se tiñen de
azul con el Gram, se les llama grampositivos. Cuando los cocos se agrupan en
cadenas, se les denomina estreptococos y cuando lo hacen en racimos, se les llama
estafilococos; también se pueden agrupar en pares que reciben el nombre de
diplococos. Las bacterias en forma de bastón reciben el nombre de bacilos. Si al
teñirlos con el Gram quedan de color rojo, se les denomina gramnegativos. Los bacilos
curvados que presentan espirales se llaman espirilos, rígidos; algunas bacterias en
espiral presentan formas fácilmente reconocibles, como las espiroquetas, semejantes
a un tornillo o sacacorchos, flexibles. Las bacterias que carecen de pared celular tienen
gran plasticidad (micoplasmas) y adoptan una variedad de formas. Las bacterias
esféricas tienen un tamaño promedio de 1 micrómetro de diámetro, mientras que los
bacilos miden 1.5 de ancho por 6 micrómetros de largo.

SEM. Escherichia coli. Bacilos

SEM. Staphylococcus aureus.
cortos gram negativos no
Cocos Gram positivos. CDC/
esporulados, flagelados.
Matthew J. Arduino, DRPH
CDC/Janice Haney Carr
 SEM. Leptospira interrogans.
Campo oscuro. Treponema Borrelia, Leptospira y
pallidum. Se le ubica dentro de Treponema conforman las
las espiroquetas. CDC familias de espiroquetas
patógenas. CDC

PARED CELULAR:

Con la tinción de Gram, una proporción importante de bacterias puede dividirse en dos
grandes grupos: grampositivas (se observan de color azul - debido al colorante cristal
violeta) y gramnegativas (pierden el cristal violeta y conservan la safranina - se aprecian
de color rojo o rosado). La técnica se basa en las diferencias físicas fundamentales de la
pared celular y emplea colorantes catiónicos (cristal violeta y safranina), que se
combinan con elementos cargados negativamente.

Las bacterias grampositivas cuentan con tres capas externas: cápsula (en algunos casos),
pared celular gruesa y membrana citoplásmica. Las bacterias gramnegativas presentan
cápsula (algunas), una pared celular delgada, membrana externa (que equivale al
lipopolisacárido) y una membrana interna (citoplasmática).

La pared celular le da forma a la bacteria y su composición varía entre bacterias. En

bacterias grampositivas, consiste de varias capas de peptidoglucano (formado por los
azúcares N-acetilglucosamina más N-acetilmurámico y un tetrapéptido) que retienen el
cristal violeta utilizado en la tinción de Gram; otros componentes de la pared incluyen
redes de ácido teicoico y ácido lipoteicoico. Las bacterias gramnegativas cuentan con
dos membranas (una externa y una interna) así como una capa delgada de
peptidoglucano entre ambas, en el llamado espacio periplásmico.
Esquema. Pared celular bacteria Esquema. Pared celular bacteria
grampositiva. T. Uribarren B. gramnegativa. T. Uribarren B.

TINCION DE GRAM

La tinción GRAM es uno de los procesos más utilizados a la hora de determinar al

microscopio óptico la filogenia de un microorganismo. Siendo una de las primeras
pruebas que se hacen para clasificar a un posible patógeno. Fue desarrollada en 1884
por el bacteriólogo danés Christian Gram. El proceso tradicional fue mejorado por
Hucker en 1921, hallando la manera de que los reactivos fueran más estables y
mejorando la calidad diferenciadora del proceso. Existe otra modificación diseñada por
Kopeloff en 1923 que permitía teñir de forma más eficiente aquellas bacterias de difícil
tinción, sobre todo las anaerobias. No obstante la explicación de porqué se teñían de
forma diferente tuvo que esperar hasta 1974 cuando Gregersen estableció que las
diferencias entre las GRAM+ y las GRAM- eran debidas a la diferente composición de
la pared celular.
Aunque las Archaea también responden a la tinción GRAM, son las especies del Reino
Bacteria las que se dividen tradicionalmente entre las GRAM+ (GRAM positivas) que
son aquellas bacterias que se tiñen con este procedimiento y las GRAM- (GRAM
negativas) que no retienen el tinte.

PASOS PARA TEÑIR BACTERIAS CON LA TINCIÓN DE GRAM

Fijación: Primero de todo hay que coger bacterias sanas de un cultivo y ponerlas en un
portaobjetos (el laboratorio muchas veces se abrevia por “porta”) y secar la gota bien
con mechero, sin quemar ni hervir las células, o bien al aire.

Tinción 1: durante 1 minuto se cubre la superficie donde están las bacterias con unas
pocas gotas del colorante cristal violeta. Pasado este tiempo se elimina el exceso y se
lava el portaobjetos con agua corriente, con cuidado para que el chorro de agua no caiga
directamente sobre la muestra ni sea un flujo demasiado rápido como para eliminar las
bacterias del porta.

Tinción 2: Aquí es donde se introdujeron las mejoras de Hucker, agregando lugol

durante 30 segundos y decolorando con alcohol: acetona (en proporciones 1:1) 3
segundos y se vuelve a lavar como antes. La modificación de Kopeloff utiliza como
decolorante alcohol-acetona (7:3) segundos y los tiempos de tinción son diferentes.

Tinción 3: Se añade safranina durante 30 segundos y se vuelve a lavar. Que puede

sustituirse por carbol-fucsina, para bacterias anaerobias.

Se deja secar y ya puede verse al microscopio óptico las bacterias teñidas

Teoría de la tinción
Las células bacterianas sanas y vivas se tiñen sin problemas con cristal violeta, un
colorante básico y se tiñen poco o nada con colorantes ácidos, como la eosina. El cristal
violeta es introducido activamente por las bacterias, por eso solo las vivas se teñirán,
además las características ácidas de las células procariotas son las que permiten esta
coloración básica. El lugol forma un compuesto insoluble con el cristal violeta. El
lavado con alcohol: acetona, un solvente lipídico, actúa en la pared celular y afecta a la
membrana plasmática a la que se unen los péptidoglucanos de la pared en las bacterias
GRAM- de tal manera que dejan salir el complejo lugol-cristal violeta. Por otra parte
las GRAM+ poseen una gruesa pared de péptidoglucanos con pocos lípidos por lo que
el alcohol: acetona no puede entrar y retienen el colorante. Si la decoloración no se lleva
a cabo correctamente las bacterias GRAM- pueden aparecer como positivas. Para
concluir se añade la safranina que es un tinte de contraste que tiñe en rojo, de esta
manera las células GRAM- quedan teñidas en rojo-rosa de forma diferenciadora de
las GRAM+ que se tiñen en violeta intenso o azul.

METODOLOGIA
 MATERIALES Y MÉTODOS

En el desarrollo de estos laboratorios se ha utilizado

microscopia para la visualización de bacterias y el uso de los
siguientes materiales:

 Microscopio Óptico
 Colorantes Tinción De Gram
(Cristal Violeta, Fucsia)
 Porta Objetos
 Cubre Objetos
 Asa Bacteriológica
 Erlenmeyer
 Agua Destilada

Usados en

LABORATORIO No 1 LABORATORIO No 2

Se trabajó la inducción al uso del microscopio

óptico, se determinó que este presenta 4
cuadrantes que van separados en una Se trabajó clasificación de las bacterias cocos,
circunferencia imaginaria y en contra de las bacilos y cocobacilos; para esto se utilizó el
manecillas del reloj. proceso conocido como Tinción De Gram, el cual
se usa para diferenciar bacterias de acuerdo a su
De esta manera: padre celular en el cual se tuvieron los siguientes
pasos:
1. El microscopio debe ser conectado y
encendido a potencia máxima de luz, la 1. Asa Bacteriológica para Estafilococo
base debe estar en la parte inferior y ser Henidermides y E. Coli.
graduada de forma progresiva de acuerdo 2. Esterilización en calor de la pinza
a la visión propia con el macrométrico y 3. Enfriamiento de la pinza
posteriormente con el micrométrico para 4. Toma pequeña de la muestra al porta objetos.
darle enfoque. 5. Se aplica colorantes de Gram sobre las
2. Se debe iniciar siempre en objetivo de 4 x muestras cristal violeta o fucsia
para ubicar la imagen, luego proseguir de 6. Se deja secando la muestra
manera sucesiva a objetivo de 10 x, 40 x, y 7. Y finalmente con aceite de inmersión se
finalmente de 100 x, objetivo con el cual se observa en el Microscopio y se determina la
debe usar 1 gota de aceite
PROCEDIMIENTO PARA de TINCION
inmersión DE GRAMnaturaleza de cada bacteria.
sobre la muestra para poder observarla de
manera totalmente clara
3. El microorganismo observado se debe
llevar siempre al centro de la circunferencia
para tener una mirada objetiva y puntual del
objeto, la luz media será usada para
observación en fresco, mientras que para el
caso de este laboratorio se usó el total de
la luz ya que se observaron muestras secas
o deshidratadas.
1. En un portaobjetos limpio, coloque una gota de agua y una muestra del cultivo
de bacterias.
2. Ponga la muestra a la llama del mechero para fijar las bacterias en la lámina.
3. Cubra el frotis con cristal de violeta por un minuto.
4. Lave al chorro del agua y escurra.
5. Luego cubra el frotis con lugol por un minuto
6. Lave al chorro de agua y escuna.
7. Cubra el frotis con alcohol por 10 segundos y lave inmediatamente.
8. Cubra la placa con fucsina de Gram por un minuto y lave.
9. Agrega una gota de aceite de inmersión y observe en 100x
10. Observar y apuntar resultados.
 RESULTADOS

1. MICROSCOPIA
Durante la práctica de microscopia se utilizaron las placas con tejidos nervioso,

epitelial y conjuntivo de los siguientes órganos:

 Cerebro

 Vagina

 Útero

 Uña

En donde se pudo observar cada una de las partes que componen estos tejidos y su

morfología mediante el uso del microscopio de luz y el análisis de las placas

debidamente preparadas. Se procedió al análisis de las mismas mediante el uso de

los diferentes objetivos en resolución de 4X , 10X Y 40X. El objetivo de 100X no

fue utilizado para esta práctica.

2. CLASIFICACION DE BACTERIAS

Se observa la E. Coli y la Mirabilis G. (estafilococo) en tinción de Gram. Se pudo

detallar la presencia de cocos, bacilos y algunos estreptococos en el microscopio y

de igual forma es evidente su identificación en Gram Positivas (moradas) y Gram

negativas (rosadas). Pudimos identificar y reconocer algunas de las formas en que

las bacterias pueden clasificarse, según su morfología. Las placas estaban en buen

estado y fue posible la exitosa realización de la práctica.

 DISCUSION

Durante nuestra práctica en el laboratorio de biología celular sobre microscopia y

clasificación de bacterias, se comenzó por el reconocimiento de las partes del
microscopio óptico en las cuales está el sistema óptico (Ocular, Objetivo, Condensador,
Diafragma y Foco) y el Sistema mecánico (Soporte, Platina, Cabezal, Revólver,
tornillos (Macrométrico y Micrométrico). Durante la práctica de microscopia se
utilizaron las placas con tejidos nervioso, epitelial y conjuntivo.

Durante la práctica se aprendió a colocar la placa para el posterior análisis, se ajustaron

los oculares al espacio del puente nasal de cada integrante, para poder observar con
ambos ojos la muestra, luego se procedió a visualizar las muestras con el objetivo 4x,
posteriormente con el objetivo 10x y 40x.

Para realizar el enfoque acercamos al máximo la lente del objetivo a la placa, empleando
el tornillo macrométrico. Lo hicimos mirando directamente y no a través del ocular, ya
que se puede correr el riesgo de romper la placa incrustando el objetivo.
Mirando, a través de los oculares, fuimos separando lentamente el objetivo de la placa
con el macrométrico y, cuando se observó algo nítido el tejido, giramos el tornillo
micrométrico hasta obtener un enfoque adecuado.

Al pasar al objetivo 10x la imagen está casi enfocada y se corrigió con mover un poco
el micrométrico para lograr el enfoque adecuado. Nos recomendaron que sí perdíamos
el enfoque era preferible volver a utilizar el objetivo 4x y realizar el proceso de enfoque
nuevamente. El objetivo de 40x se utilizó para finalizar la práctica, este objetivo enfoca
a muy corta distancia y es necesario tener un enfoque adecuado en 4x o 10x antes de
utilizar el objetivo 40x.

Para la segunda práctica las muestras analizadas fueran extraídas de cultivos de bacterias
E. Coli y Proteous Mirabilis de los cultivos propios del material del laboratorio para
diferenciar los Gram Positivos y los Gram Negativos. Con el haza bacteriológica
esterilizada se tomó una muestra del cultivo para hacer una emulsión en un tubo de
ensayo. En una lámina porta objetos se colocó una gota y se flameó la placa hasta que
se secó para que las bacterias se fijen a la placa. Se aplicó el cristal violeta (colorante
catiónico) y penetró en todas las células bacterianas (tanto Gram Positivas como Gram
Negativas) a través de la pared bacteriana, el procedimiento tomó una duración de 1
minuto y se limpió el exceso de cristal violeta con agua. Luego se aplicó el lugol,
compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl
(Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el yodo, y actúan de mordiente,
haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula
bacteriana, el procedimiento dura 1 minuto y luego se limpia el exceso con agua. Para
finalizar la mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración,
ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram
Positivos no se decoloran, mientras que los Gram Negativos sí lo hacen.

Los resultados obtenidos fueron medianamente satisfactorios ya que la tinción de gram

se llevó de manera correcta predominaron las bacterias con tinción gram positivas
puesto que la coloración de las muestras, en su mayoría, quedaron de color violeta.
Como se puede ver en la imagen se hizo la observación de la muestra bacteriana
coloreada con tinción de Gram (Gram Positiva y Gram Negativa), en la muestra de
Proteous Mirabilis se hicieron más visibles aglomeración de bacterias como cocos,
diplococos y tétradas con tinción Gram positiva y hasta colonias, en la muestra de E.
Coli no se puedo encontrar la bacteria para ser diferencia.
Las prácticas fueron satisfactorias ya que con ellas mejoramos el manejo del
microscopio y el uso correcto de todas sus partes, además nos familiarizamos con la
técnica de tinción de Gram y el uso adecuado de sus materiales lo cual es fundamental
para futuras prácticas en el laboratorio.

CONCLUSIONES

 Se reconoció la acoplación, partes y manejo del microscopio óptico y sus

conceptos, para clasificar los diferentes tipos de bacteria existentes, según su
tamaño y morfología.
 El microscopio fue la principal herramienta para los descubrimientos
histológicos, celulares y moleculares que cambiaron nuestra perspectiva del
concepto de célula.
 El microscopio óptico es una herramienta fundamental e indispensable para la
formación investigativa del estudiante de medicina.
 El microscopio ha avanzado tanto en su conformación que hoy en día no hay
célula que no pueda ser descrita detalladamente con el correcto uso de la
microscopía.
 La tinción de Gram a pesar de ser un método antiguo para clasificar las bacterias,
nos da una herramienta para diagnosticar infecciones bacterianas en el cuerpo
actualmente.
 Las bacterias tienen diversidad de formas y organizaciones dentro de su llamada
¨simplicidad¨.
 Las bacterias se clasifican en Gram positivas y Gram negativas según la
complejidad de su pared celular.

BIBLIOGRAFIA

1. http://www.facmed.unam.mx/deptos/biocetis/PDF/Portal%20de%20Recursos
%20en%20Linea/Apuntes/2_microscopia.pdf.
2. http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitu
lo4.htm.
3. Cooper, Geoffrey M; Hausman, Robert E. La Celula.5ª ed. USA: Marbán Libros,
2011.
4. http://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/tincion-de-gram-13399.
5. http://emedicine.medscape.com/article/226434-overview.