CONTEO DE CELULAS

ANAYA ANGÉLICA, PERTÚZ MARÍA TERESA, RODRÍGUEZ DÍAZ ANDREA

CAROLINA

Informe de Laboratorio

Profesora: Carmiña Vargas Z

UNIVERSIDAD DEL ATLANTICO

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

ATLANTICO, COLOMBIA

2017-2

1
RESUMEN

Los conteos celulares son una serie de procedimientos que tienen por objeto
determinar el número de cada uno de los tipos celulares que están comprendidos
en una unidad de volumen de sangre (generalmente, en 1 mm3). En este
laboratorio se realizó un conteo celular del alga Chlorella, haciendo soluciones
seriadas hasta 10-9, para obtener la mayor disolución. Esto fue implementado con
el método de conteo de la cámara de Neubauer ya que es muy implementado para
este tipo de procedimientos.

2
CONTENIDO

INTRODUCCION.............................................................................................................................4
OBJETIVOS.....................................................................................................................................5
MARCO TEORICO..........................................................................................................................6
Hemocitómetros...........................................................................................................................6
Errores en la hemocitometría.....................................................................................................6
Usos y aplicaciones del conteo celular.....................................................................................6
CHLORELLA VULGARIS...........................................................................................................7
LA CÁMARA DE NEUBAUER, O HEMATOCITOMETRO.....................................................7
Crecimiento celular......................................................................................................................8
FACTORES DE CRECIMIENTO...............................................................................................8
MATERIALES Y METODOS........................................................................................................10
METODOLOGIA............................................................................................................................10
RESULTADOS Y DISCUSION.....................................................................................................10
CONCLUSION...............................................................................................................................12
Bibliografía......................................................................................................................................13
ANEXOS.........................................................................................................................................14

3
INTRODUCCION

Desde un punto de vista estadístico, el conteo celular se basa en tomar una

muestra de una población existente (la concentración original), mediante la
extracción de una cantidad reducida de dicha población (la muestra), con el
objetivo de estimar el tamaño original de la población. El problema subyacente en
muestras con baja concentración es que la muestra es demasiado pequeña para
determinar de una manera precisa el tamaño original de la concentración.
(http://www.celeromics.com/es/resources/Technical%20Notes/cell-count-for-low-
concentration-samples/conteo-celular-baja-concentracion.php). El conteo celular
es un paso necesario cuando se efectúan siembras o subcultivos celulares o
cuando se preparan experimentos para ensayos basados en células. [ CITATION
Qui11 \l 9226 ].

4
OBJETIVOS

Objetivo general

- Proporcionarnos como estudiantes el correcto uso de la utilización de

herramientas de conteo celular (cámara de Neubauer), para tomar
destrezas en el campo técnico de laboratorio

Objetivos específicos

- Realizar el procedimiento del conteo celular del alga Chlorella con el

método de la cámara de Neubauer
- Determinar la absorbancia para cada disolución del alga Chlorella.

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MARCO TEORICO

Hemocitómetros

Los hemocitómetros están hechos de un vidrio óptico especial en los que se

cargan suspensiones celulares en volúmenes especificados y se efectúan los
conteos bajo un microscopio óptico.

Aun cuando la hemocitometría es de bajo costo, los múltiples pasos que hay que
seguir para completar un conteo celular son tediosos y además pueden dar como
resultado conteos imprecisos.

Errores en la hemocitometría

Las causas de errores en la hemocitometría pueden ser:

 Una distribución irregular en la muestra

 Demasiadas o muy pocas células en la muestra

 Juicios subjetivos con respecto a si una célula dada se encuentra dentro del
área de conteo definida

 Contaminación del hemocitómetro

 Diferencias en general en las técnicas que siguen los usuarios

Cualquiera de estos factores puede afectar de forma negativa la capacidad de

reproducción de las pruebas.

Usos y aplicaciones del conteo celular

Los conteos celulares pueden ser usados principalmente en:

1. Monitoreo de la salud de los cultivos

2. Monitoreo de los niveles de proliferación

6
 3. Evaluación de la inmortalización para la transformación

Es importante que los conteos celulares sean precisos, consistentes y rápidos, en

particular cuando se monitorean las respuestas celulares cuantitativas.

A pesar de la necesidad de velocidad y precisión, la gran mayoría de los conteos

celulares se efectúan por medio de un hemocitómetro, una técnica introducida por
primera vez a finales del siglo XIX, para el conteo de células sanguíneas
[ CITATION Qui11 \l 9226 ].

CHLORELLA VULGARIS

Su taxonomía es la siguiente: Reino: Protista, División: Chlorophyta, Clase:

Chlorophyceae, Orden: Chlorococcales, Familia: Oocystaceae, Genero: Chlorella,
Especie: vulgaris. (Chlorella vulgaris). Esta es una microalga unicelular de color
verde, de forma esférica, con un diámetro que está entre 100 y 1000 veces menor
a 1 milímetro. El color verde lo obtiene gracias a los cloroplastos que son las
estructuras encargadas de hacer la fotosíntesis, no presenta flagelo y en la
mayoría de veces se encuentra en los cuerpos de agua dulce; se reproduce de
forma acelerada y de forma asexual. Para eso precisa el carbono que obtiene de
la fotosíntesis, agua, luz y pequeñas cantidades de minerales. Contiene grandes
cantidades de proteínas, vitamina C, betacaroteno y vitaminas B (B1, B2, B6 y
B12). Su composición química es de 51-58% de proteína, 12-17% de
carbohidratos, 14- 22% de lípidos, estos porcentajes se presentan en materia
seca. Cuando sus células alcanzan su tamaño máximo, el núcleo se divide en
cuatro u ocho partes y en el interior de la célula madre se forman de cuatro a ocho
células más pequeñas idénticas a la célula madre, estas son las autoesporas que
son liberadas por la célula madre por eclosión, transformándose entonces en
nuevas Chlorellas al crecer; estas microalgas pueden resistir temperaturas de
hasta 36ºC [ CITATION Car17 \l 9226 ].

LA CÁMARA DE NEUBAUER, O HEMATOCITOMETRO.

7
Se trata de una gruesa placa de cristal con forma de portaobjetos, de unos 30 x
70 mm y unos 4 mm de grosor. En una cámara simple, la porción central, que es
donde se realiza el conteo, está dividida en 3 partes. En la parte central se
encuentra grabada una retícula cuadrangular. En el caso de cámara dobles, que
son las más comunes, existen 2 zonas de conteo, una superior y otra inferior al
eje longitudinal de la cámara. La reticula completa mide 3 mm x 3 mm de lado.
Subdividida a su vez en 9 cuadrados de 1mm de lado cada uno. En caso de
recuento de sangre, los cuadrados de las esquinas son los destinados al recuento
de leucocitos. Al existir estos en menor número que los hematíes, se necesitan
menos líneas de referencia para realizar el conteo. El cuadrado central es el
destinado al recuento de hematíes y plaquetas. Se divide en 25 cuadrados
medianos de 0,2 mm de lado. Cada uno de estos cuadros se subdivide a su vez
en 16 cuadrados pequeños. El cuadrado central está por tanto formado por 400
cuadrados pequeño (Documento de sitio Web 1).

Crecimiento celular

Todos los organismos vivos poseen como unidad fundamental de función y

estructura a la célula, esta se desarrolla únicamente a partir de una célula
preexistente y posteriormente la célula generada tiene vida propia. Mediante
varias investigaciones y con la evolución de los instrumentos tecnológicos, se
logró descubrir la parte esencial de la vida en el siglo XVII y tras la invención del
microscopio se lograron determinar las células en los tejidos animales y vegetales,
por último, se encontró similitud en la organización estructural de los organismos.

FACTORES DE CRECIMIENTO

Los factores de crecimiento son señales bioquímicas capaces de modicar las

respuestas de las células del organismo. Están involucrados en el control del
crecimiento y diferenciación celular. Existen muchísimos tipos de factores de
crecimiento diferentes. Muchos de estos factores se encuentran en la sangre y

8
especialmente en las plaquetas. Los Factores de crecimiento son péptidos, es
decir, secuencias cortas de aminoácidos, que usualmente transmiten señales
entre las células modulando su actividad. Los avances de los últimos años en
biología molecular y biotecnología han permitido la identicación de este tipo de
elementos y su estudio ha sido decisivo en el tratamiento de diversas
enfermedades como veremos más adelante. Se trata habitualmente de proteínas
solubles que actúan de mediadores biológicos naturales siendo responsables de
distintos eventos celulares como la mitosis, la quimiotaxis (desplazamiento de las
células en el medio líquido), la citodiferenciación y la síntesis de la matriz entre
otros. Los factores de crecimiento ejercen varios efectos sobre los procesos de
reparación y regeneración, y por ejemplo son considerados iniciadores de los
procesos de cicatrización. La síntesis de los factores de crecimiento se encuentra
mediada por receptores de membrana específicos en la superficie celular, sobre
los cuales a su vez ellas actúan, promoviendo una proliferación o una inhibición en
diferentes situaciones [ CITATION Mur07 \l 9226 ]. Se puede clasicar los factores
de crecimiento según sea su especialidad:

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Fig 1.
Factores de

crecimiento según su especialidad

MATERIALES Y METODOS
- Cámara de NEWBAUER
- Solucion (Chorella)
- Agua destilada
- Micropipetas
- Gotero
- Beaker
- Tubos de ensayo
- Gradilla

METODOLOGIA
Se Lavaron bien 10 tubos de ensayo de aprox. 12-15 ml, y pipetas Pasteur de
vidrio. Se Colocó en cada tubo 9 ml de agua destilada. Posteriormente se realizó
una solución de 500 microlitros (Aprox.) de ampolletas de levadora (Genero:

10
Chlorella) mas 500 microlitros de agua destilada. En el primer tubo se colocó 1 ml
de solución de levadura (Chlorella “Solución Madre”) y se le agregó 9 mL de agua
destilada, siendo esta enumerada la seria 10 -1 , posteriormente se realizaron
soluciones seriadas de; 10-2; 10-3; 10-4; 10-5; 10-6; 10-7; 10-8; 10-9, 10-10, 10-11 , 10-12.
Por último se Tomó 1ml del tubo 1 y se llevó al siguiente tubo hasta homogenizar
bien (Se realizó el mismo procedimiento hasta llegar al tubo 12). Se Contó el
número de células en cada uno de los tubos en la cámara de NEWBAUER.

RESULTADOS Y DISCUSION
Se tienen 12 tubos con diferentes concentraciones de la solución madre (diluidos)
en los cuales a cada uno se realizará el conteo de células (solo se realizó conteo
en las primeras 6 muestras ya que en las demás por estar tan diluida no se
observaban células).

Muestras N° de células Absorbancia

A B C D Total
10-1 757 877 823 911 3368 0.708
10-2 99 77 66 78 320 0.043
10-3 10 20 13 5 48 -0.003
10-4 5 14 10 8 37 -0.010
10-5 12 7 9 8 36 -0.009
10-6 1 1 5 2 9 0.068

Para hallar la concentración celular, utilizamos la siguiente formula:

Concentración ( Cell
mL )=
N ° de celulas
Volumen(en mL)

Se tiene que:

- Para tubo 1: Concentración ( Cell

mL )=
3368 cell
9 mL
=374.22
Cell
mL
Cell 320 cell Cell
- Para tubo 2: Concentración ( )= =35.55
mL 9 mL mL
Cell 48 cell Cell
Concentración (
mL ) 9 mL
- Para tubo 3: = =5.33
mL

11
 - Para tubo 4: Concentración ( Cell
mL )=
37 cell
9 mL
=4.11
Cell
mL
Cell 36 cell Cell
- Para tubo 5: Concentración ( )= =4
mL 9 mL mL
Cell 9 cell Cell
- Para tubo 6: Concentración ( )= =1
mL 9 mL mL

TUBO CONCENTRACIO ML DE ML DE DILUCIÓN

N AGUA SOLUCION
1 0.1 M 10-1 9 mL 1 mL 1:10
2 0.01 M (10-2) 9 mL 1 mL solución 1:100
3 0.001 M (10-3) 9 mL 1 mL solución 1:1000
4 0.0001 M (10-4) 9 mL 1 mL solución 1:10000
5 0.00001 M (10-5) 9 mL 1 mL solución 1:100000
6 0.000001 M (10-6) 9 mL 1 mL solución 1:1000000

Para hallar una concentración de celulas por dilución y teniendo en cuenta los
cuadros de la cámara de Neubauer:

Concentración ( Cell
mL )=
N ° de celulas∗10000
N ° de cuadros∗dilucion

Nos queda que:

- Para tubo 1: Concentración ( Cell

mL )
=
3368 cell∗10000
16∗0.1
=21050000 cell

Cell 320 cell∗10000

Concentración (
mL )
- Para tubo 2: = =20000000 cell
16∗0.01
Cell 48 cell∗10000
Concentración (
mL )
- Para tubo 3: = =30000000 cell
16∗0.001
Cell 37 cell∗10000
Concentración (
mL )
- Para tubo 4: = =231250000 cell
16∗0.0001
Cell 36 cell∗10000
Concentración (
mL ) 16∗0.00001
- Para tubo 5: = =2250000000 cell

Cell 9 cell∗10000
Concentración (
mL ) 16∗0.000001
- Para tubo 6: = =5625000000cell

Estos últimos cálculos de concentración de células por dilución, da erróneos

porque para este análisis se debe tener una muestra representativa de al menos
200 celulas. También pudo ser causado este error, debido a un mal pipeteo o
errores de volúmenes introducidos en la cámara.
12
Como resultado pudimos aprender a identificar las diferentes zonas de la cámara
de Neubauer, además de aprender a realizar un conteo celular que nos sirve para
monitoreo de la salud por medio de cultivos, conteo Leucocitos, sangre, monitorio
de niveles de proliferación a ciertas respuestas celulares, entre otras cosas de
gran ayuda para determinar ciertas enfermedades o patologías en los seres
humanos y animales.

CONCLUSION

La cámara de Neubauer es un método muy utilizado para el conteo celular a

grandes concentraciones celulares, esto nos permitió en el laboratorio agarrar
técnicas para este tipo de procedimientos e ir tomando experiencias de ello,
además de conocer su uso y ponerlo en práctica se pudo observar
microscópicamente las células de Chlorella e iniciar su conteo.

Bibliografía

1. QuimiNet. [En línea] 03 de Marzo de 2011.

https://www.quiminet.com/articulos/las-3-aplicaciones-principales-del-conteo-
celular-50722.htm.

2. Cartagena, Julia y Malo M, Brian. Universitaria Americana. EVALUACIÓN DEL

USO DE LA MICROALGA Chlorella vulgaris . [En línea] 2017.
http://repository.uamerica.edu.co/bitstream/20.500.11839/6035/1/1014249411-
2017-I-IQ.pdf.

3. Murakami, E. EuSalud. Tema 3: Factores de crecimiento. [En línea] Enero de

2007. http://eusalud.uninet.edu/apuntes/tema_03C.pdf.

13
4. University of Minnesota, Nanchang University. p.11WANG, L. Cultivation of
Green Algae Chlorella in Different Wastewater for Municipal Wastewater treatment
plant. (2009). University of Minnesota, Nanchang University. p. 11

5. WANG, L. Cultivation of Green Algae Chlorella in Different Wastewater for

Municipal Wastewater treatment plant. (2009).

6. Bastidas, O. (2012). Conteo Celular con Hematocitómetro. Uso Elemental del

Hematocitómetro.

7. Meneses Marcel, A., Rojas, L., Sifontes Rodríguez, S., López, Y., & Sariego
Ramos, I. (2001). Aplicación de un método alternativo al conteo en cámara de
Neubauer para determinar la concentración de Trichomonas vaginalis. Revista
Cubana de Medicina Tropical.

ANEXOS

1) ¿Que es masa o concentración celular?

Dependiendo del tipo de muestra a medir, se ha de habrá de preparar una muestra

con una concentración apta para su recuento. Típicamente, el rango de
concentraciones que permite contar el hematocitómetro está entre 250.000 células
y 2,5 millones de células por ml.

Intentaremos que la muestra tenga una concentración en torno a 106 (1 millón)

aplicando las diluciones correspondientes. Por debajo de 250.000 células / ml (2,5
* 105) la cantidad de células contadas no es suficiente para poder dar una
estimación lo suficientemente fiable de la concentración celular 1

14
La concentración óptima para conteo en hematocitómetro es de 1 millón de células
por ml = 106 células /ml

2) ¿Qué métodos son usados para determinar o contar células de una muestra
biológica y qué equipos o materiales son requeridos en cada método?

R/= Para resolver el problema de conteo celular, se ha optado, en algunos casos

por calibrar sistemas espectrofotométricos, cuyo fundamento se finca en las
propiedades de absorción de la luz por parte de las células; sin embargo, tales
sistemas son poco exactos y los resultados que se obtienen son difíciles de
repetir.

Una alternativa a este problema es contar directamente el número de células

presentes en un volumen conocido; esto puede ser un trabajo agobiante si
consideramos, por ejemplo, a las células procariontes que miden generalmente
menos de 10 micras (>1X10-6 metros o 1X10-3 milímetros o bien 0.010
milímetros) y por lo tanto se pueden encontrar muchas en un volumen muy
pequeño. No obstante, se cuenta con la cámara de Neubauer, la cual es un
instrumento muy útil que permite contar células de distintos tamaños.

Materiales requeridos

a) muestra celular a medir

b) hematocitómetro, o cámara de Neubauer

c) microscópico óptico

d) cubre objeto

e) micropipeta con puntas

f) buffer para diluciones

3) ¿Qué procedimientos previos son requeridos para contar células de un tejido

animal, vegetal, de microorganismos?

R/= para un adecuado conteo celular se deben tener en cuenta los siguientes
pasos

Paso 1. Preparación de la muestra: dependiendo del tipo de muestra a medir, se

debe preparar una muestra con una concentración apta para su recuento.

Paso 2. Introducción de la muestra en la cámara de Neubauer: se toman 10uL de

la mezcla en el paso 1 con la micropipeta.

15
Paso 3. Preparación y enfoque del microscopio

Paso 4. Calculo de la concentración: aplicamos la fórmula del cálculo de la

concentración celular

4) ¿Para qué es importante determinar la concentración celular de una solución

biológica?

R/= es importante conocer la concentración de células en soluciones biológicas ya

que nos permite saber cuál es el número de células que se encuentran en un
volumen determinado de la disolución.

16