Introducción a la Genómica. Tarea 5.

González Simón Kathia Jazmín

Artículo: Edición in vivo de Ryr2. Corrección de Taquicardia Polimórfica
Ventricular Catecolaminérgica.
Resumen.
Taquicardia Polimórfica Ventricular Catecolaminérgica (CPVT): Arritmia cardiaca
hereditaria. Tiene una taza de mortalidad de hasta el 50% durante los primeros 8
años luego de su diagnóstico. Debido a la ineficiencia de los tratamientos (algunos
incluso dolorosos como los desfibriladores implantables) se busca, mediante la
terapia génica, hacer un cambio en la salud de quienes padecen esta enfermedad.
Fisiopatología de CPVT: Resultado de mutaciones autosómicas dominantes en el
gen codificante del receptor rianodina 2 (RYR2) (generalmente causado por
mutaciones de sentido erróneo, ganancia de función), gen que codifica para el
canal RyR2 que se activa por la entrada de Ca2+ (dependiente de voltaje), el
retículo sarcoplasmático inicia a través de RyR2 la contracción del miocito. Al
tener una subunidad mutada se producen liberaciones espontáneas de Ca2+ del
Retículo al citoplasma, y se obtiene una polarización de la célula cardiaca que,
junto a una deficiente despolarización de esta, ocasiona graves arritmias.
Del tratamiento: Se utilizó el sistema CRISPR/Cas9 (Repeticiones Palindrómicas
Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas), que utiliza una nucleasa
guiada por ARN (Cas9) para hacer roturas específicas en la doble cadena de DNA
lo que da como resultado mutaciones de deleción/inserción. Con la edición
CRISPR/Cas9 se pueden eliminar alelos mutados al introducir un codón de alto
prematuro, anomalías de splicing y/o degradación del ARN mensajero mediada
por mutación terminadora. Y debido a que en la taquicardia (CPVT), la mutación
consiste en el cabio de un codón que codifica para un aminoácido diferente, es
posible utilizar esta técnica.
Del método:
- Se utilizaron ratones hembra con mutación en heterocigosis (R176Q/+).
- El sistema CRISPR/Cas9 fue inyectado mediante un vector AVV dirigido
específicamente por ARNg al alelo mutado.
Para monitorear los resultados se utilizaron:
- Un programa de estimulación intracardiaca, para el estudio
electrofisiológico in vivo de los ratones.
- Se cuantificó a tiempo real un PCR en tejidos ventriculares, (primers
corriente arriba: exón 3-6 y corriente abajo: Exón 11-13), utilizando el
equipo iTaq Universal SYBR Green Supermix.
- Se realizó un Análisis Western Blot.
 - Se utilizó también un equipo de próxima generación para la secuenciación y
cuantificación de CRISPR/Cas9 at On-/Off-Target Sites .
- Imagen celular de Ca2+
- Y finalmente para tratamiento de datos, se realizó un análisis estadístico.
Resultados: Se demostró que el vector AAV9 junto con SaCAS9 y gRNA, editan
eficientemente los cardiomiocitos un vivo (eliminando la secuencia target de 22pb
en exón 8), reduciendo los niveles de mutación en la subunidad RyR2, se
normalizó en manejo de Ca2+ intracelular en los ratones R176Q/+, restaurando así
la función cardiaca. No se afectan los flujos de Ca2+ más allá del causante de la
enfermedad, por lo que se demuestra que el enfoque de edición de genes in vivo
es efectivo y seguro.
Comentario.
Elegí el artículo debido a que con anterioridad había leído acerca del tratamiento
génico con CRISPR/Cas9 y la conmoción que había causado por la implicación
moral que generaba en el público en general, así que quería saber más acerca de
este tema y analizar por mí misma lo que se comentaba en las redes sociales.
Primero que nada, me sorprendí de que pudiera leer un artículo con esta temática
con relativa facilidad, los conocimientos adquiridos de la materia y el estudio
propio me permitieron entender términos muy técnicos y saber a qué se referían
exactamente, palabras como PCR o Western Blot (técnicas de identificación de
secuencias de DNA o proteínas, que revisamos en clase), sólo aumentaron mi
interés con respecto al trabajo que hay detrás de la investigación. Sucedió lo
mismo al comenzar el artículo y leer la fisiopatología de la enfermedad, ya no sólo
es un mecanismo a nivel celular, sino a nivel génico, que desde mi perspectiva
aumenta la dificultad; tuve un poco de problemas para entender esta parte de la
fisiopatología, ya que me parece que la página donde encontré el artículo no
redacta de manera adecuada éste mecanismo: “Con solo una subunidad mutada
en el homotetrámero que forma, ya es suficiente para que se produzcan
liberaciones espontáneas de Ca2+ al citoplasma, incluso tras concluir la
despolarización, que ocasionan graves arritmias de resultado posiblemente
mortal.” Cuando el artículo menciona algo diferente, desde mi entendimiento, no
es la polarización (la entrada de calcio genera el cambio en el voltaje) de la célula
cardiaca lo que genera la arritmia, sino la deficiente despolarización.
Al ser una técnica bastante desconocida para mí (CRISPR/Cas9), existieron cosas
en la explicación del artículo que no comprendí, como la técnica de próxima
generación para la secuenciación y cuantificación de CRISPR/Cas9 at On-/Off-
Target Sites, pero en general, el funcionamiento se basa en mutaciones que se
revisaron en clase, como la mutación deleción/inserción, y mutaciones como la de
codón de alto prematuro.
Es cierto que falta mayor conocimiento para entender un artículo, con técnicas y
temas nuevos, pero la clase de Introducción a la Genómica da cierto alcancé para
comprender el panorama general del tema.
Me gustó mucho el artículo, primero porque era un tema que me interesaba, y
segundo, porque comprobé que, al tener mayor conocimiento respecto al tema, se
puede dejar de malignizar, algo que podría ser benéfico para la salud de las
personas.
Bibliografía:
Aguilar Ballester, María, Aplicado por primera vez de manera exitosa el sistema
CRISPR-Cas como terapia génica personalizada en un modelo animal de
enfermedad cardiaca hereditaria, Genética Médica News, Enero 2019, publicado
en: https://genotipia.com/genetica_medica_news/crispr-enfermedades-cardiacas/
Link del artículo original:
https://www.ahajournals.org/doi/pdf/10.1161/CIRCRESAHA.118.313369