Introducción

Beatriz Alvarez
Laboratorio de Enzimología
 Curso de Enzimología 2010

Coordinación: Beatriz Alvarez, beatriz.alvarez@fcien.edu.uy.

Fecha: Segundo semestre, del 7 de setiembre al 11 de noviembre.
Teóricos: 2 teóricos semanales de 2 horas cada uno, los días
martes y jueves de 10 a 12 horas, salón 107. Total de horas de
teórico: 40 horas.
Prácticos: 1 práctico por semana de 4 horas, los días martes o los
días jueves, de 13 a 17 horas, en el salón 304 o en los Laboratorios
de Enzimología y Fisicoquímica Biológica. Total de horas de
práctico: 40 horas.
Créditos: (40*2 + 40*1.5)/15 = 9.3
Ganancia del curso: El curso se ganará por asistencia a los
prácticos y aprobación de los correspondientes informes.
Evaluación: Examen.
Cupo: 40 estudiantes.

Apoya PEDECIBA Biología. Auspicia PEDECIBA Química.

Material para el curso, protocolos de
práctico, repartidos de ejercicios:

Subespacio

http://enzimologia.fcien.edu.uy/
Temas
Introducción. Cinética enzimática.
Efectos del pH.
Efectos de la temperatura.
Inhibición.
Reacciones de dos sustratos.
Cinética preestacionaria.
Mecanismos.
Regulación y cooperatividad.
Sistemas multienzimáticos.
Objetivos
Estudio sistemático de diferentes temas de
enzimología que permitan una aproximación a la
pregunta: ¿cómo funcionan las enzimas?
Curso dirigido a estudiantes avanzados y de
posgrado que provee de conceptos de cinética
enzimática y mecanismos, así como de
herramientas prácticas para el trabajo con enzimas.
 Bibliografía
Textos de Bioquímica
Lehninger, Stryer, Voet (Bioquímica), Mathews, Devlin, Zubay
Segel, Biochemical calculations, John Wiley (1976)

Textos de Enzimología
Dixon and Webb, Enzymes, Longman (1979) SUBESPACIO
Fersht, Structure and mechanism in protein science, Freeman (1999)
Cornish-Bowden, Fundamentals of enzyme kinetics, Portland (1995)
Segel, Enzyme kinetics, Wiley (1993)
Methods in Enzymology, volúmenes 63, 64, 87, 249, Academic Press.
Price and Stevens, Fundamentals of enzymology, Oxford (1989)
Frey and Hegeman, Enzymatic reaction mechanisms, Oxford (2007)
Eisenthal and Danson, Enzyme Assays, A Practical Approach, Oxford (2002)
Jencks, Catalysis in Chemistry and Enzymology, Dover (1987). Incluye el
capítulo de 1975 “The Circe Effect”.
RECURSOS DE RED

Brenda http://www.brenda.uni-koeln.de
Manual Worthington
http://www.worthington-biochem.com/manual/manIndex.html
ExPASy Proteomics Server (DE TODO!) http://ca.expasy.org
ExPASy Enzyme Nomenclature Database http://ca.expasy.org/enzyme/
ExPASy Metabolic Pathways http://us.expasy.org/cgi-bin/search-biochem-
index
Enzyme Structures Database
http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes/
Enzyme Nomenclature
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html
PubMed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi
Protein Data Bank http://www.rcsb.org/pdb/
Las enzimas son catalizadores biológicos.
Un catalizador es una sustancia que acelera la
velocidad de una reacción y se recupera
incambiado.

La catálisis biológica tiene gran importancia:

El azúcar puede guardarse
por años. Sin embargo, nos
sirve como fuente de energía
en segundos, gracias a la
catálisis.
 Reseña histórica
La especie humana no demoró mucho en aprender a
aprovechar el poder catalítico de las enzimas, por
ejemplo, para procesar alimentos (queso, pan,
cerveza, vino).

La referencia más antigua acerca

de la utilización de enzimas es la
elaboración de vino en el Código
de Hammurabi (2100 AC,
Babilonia). “I ♥ enzymes”
La comprensión de los mecanismos
como actúan las enzimas
evolucionó de estudios acerca de la
fermentación alcohólica realizados
en el siglo XIX.

La historia de la enzimología es la historia de la

bioquímica.
 Jöns Jakon Berzelius
1837, Suecia
El concepto de catálisis

"Tenemos una nueva fuerza que pertenece a

la Naturaleza orgánica e inorgánica, que
provoca reactividad química ... reordenando
los componentes de una sustancia hacia
otras relaciones sin necesariamente cambiar
sus propios componentes..."
 Pasteur y Liebig
¿Están vivas las enzimas?
 Justus von Liebig
famoso por inventar los laboratorios para estudiantes
Alemania, 1839
Teoría química de la fermentación
"Los átomos de un cuerpo en putrefacción, el fermento,
están en continuo movimiento; cambian sus posiciones y
forman nuevas combinaciones. Estos átomos móviles están
en contacto con los átomos del azúcar, que está unida solo
por fuerzas débiles. El movimiento de los átomos del
fermento no puede pasar sin efecto sobre los átomos del
azúcar. O se anula el movimiento o el azúcar se moverá
también. Así el azúcar sufre un desplazamiento de sus
átomos que se rearreglan para formar alcohol y dióxido de
carbono."
Liebig creía que la fermentación era causada por la trasmisión de
vibración de los fermentos al material a fermentar.
 Louis Pasteur
Francia, 1858
Teoría de la "fuerza vital"

"Veo en el hecho de la fermentación un fenómeno relativo a

la vida -un hecho fisiológico- que origina múltiples productos,
todos los cuales son necesarios para la célula. Creo que no
existe fermentación sin que haya, simultáneamente, la
organización, el desarrollo y la multiplicación (es decir el
crecimiento) de la levadura u otros glóbulos, o al menos la
continuación de la vida de los glóbulos que ya estaban
presentes. La totalidad de los resultados me parece en
oposición a las opiniones de M. Liebig."
Pasteur creía que la fermentación era inseparable de las células vivas.
¿De dónde sale el nombre ENZIMA?
El nombre "enzima" fue acuñado en 1878 por
Fredrich Wilhelm Kühne.
Proviene del griego:
en (dentro de) + zima (levadura).
Enfatiza que hay algo en la levadura, por
oposición a la levadura misma, que cataliza
los procesos, y distingue las enzimas de los
organismos que las producen.
 Hans y Eduard Büchner
Alemania, 1897
Las enzimas son moléculas
(Nobel 1907)
"Respecto a la teoría de la fermentación ahora podemos
hacer la siguiente afirmación: NO es necesario tener un
aparato tan complicado como la célula viviente de una
levadura para que se lleve a cabo la fermentación. Más bien
un fermento soluble, o enzima, se considera el portador de
la actividad fermentativa del jugo de la prensa. Llamaremos
a este agente subcelular de la fermentación zimasa."
Los hermanos Buchner observaron que extractos libres de células son
capaces de realizar la fermentación del azúcar a etanol y dióxido de
carbono.
 Emil Fischer
Alemania, 1894
Las enzimas son selectivas
(Nobel 1902) Hipótesis llave-cerradura

“El efecto específico en los glucósidos puede ser explicado

asumiendo que el contacto íntimo entre las moléculas,
necesario para la liberación de la reacción química, es posible
solo con configuraciones geométricas similares. Para ilustrarlo
diré que la enzima y el glucósido encajan uno en el otro como
una llave y una cerradura...”
Las enzimas puedenas distinguir entre diferentes
estereoisómeros de azúcar. Las enzimas consisten en
"moléculas construidas asimétricamente". Así, "la enzima y el
sustrato encajan uno en el otro como una llave en una
cerradura".
 Las enzimas son proteínas
James Sumner (Estados Unidos)
1926. Cristaliza la ureasa y obtiene sólo
aminoácidos cuando la hidroliza (Nobel 1946).

John Northrop (Nobel 1946) y Moses Kunitz

1926. Northrop cristaliza la pepsina. Cristalizan
enzimas digestivas y comprueban que la
actividad biológica no se puede separar de la
proteína.
COENZIMAS Y COFACTORES
Las enzimas son proteínas. La actividad catalítica
depende de la integridad de la estructura y de que la
proteína no esté desnaturalizada.
Los grupos funcionales de los aminoácidos participan en
la catálisis. Muchas enzimas no requieren nada más,
pero algunas enzimas requieren un cofactor.
Los cofactores pueden ser iones metálicos o coenzimas
orgánicas.
Si el cofactor está unido muy fuertemente o
covalentemente se denomina grupo prostético.
apoenzima + cofactor = holoenzima
NOMENCLATURA
En general, las enzimas se nombran agregando el
sufijo asa.
Ej: ureasa, lactato deshidrogenasa.
Este sufijo proviene del nombre del extracto de malta
que hidrolizaba almidón en el siglo XIX, “diastasa”.
La Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de
Bioquímica y Biología Molecular propone clasificar y
nombrar las enzimas de acuerdo a las reacciones
químicas que catalizan.
Clasificación Tipo de reacción catalizada

1. Oxidorreductasas Reacciones redox

2. Transferasas Transferencia de grupos
funcionales
3. Hidrolasas Reacciones de hidrólisis
4. Liasas Eliminación de grupos para formar
dobles enlaces
5. Isomerasas Isomerización
6. Ligasas Formación de enlaces acoplada a
la hidrólisis de ATP
Cada enzima pasa a tener:
> Un nombre recomendado, generalmente el nombre trivial
histórico.
> Un nombre sistemático: nombre del sustrato seguido por el tipo
de reacción.
> Un número formado a su vez por 4 números: EC _._._._

carboxipeptidasa A
peptidil-L-aminoácido hidrolasa
EC 3.4.17.1
EC indica “Enzyme Commission”
El primer número indica la clase: hidrolasa
El segundo indica subclase: actúa en enlaces peptídicos
El tercero, la subsubclase: metalocarboxipeptidasa (Zn2+)
El cuarto es un número arbitrario en la subsubclase

alcohol deshidrogenasa
alcohol:NAD+ oxidorreductasa
EC 1.1.1.1
 A diferencia de otros catalizadores
químicos, las enzimas se caracterizan
por:
1. Altísimo poder catalítico.
2. Condiciones de reacción suaves.
3. Alta especificidad por el sustrato (reactivo) y
por los productos de la reacción.
4. Su actividad puede ser regulada.
5. Pueden acoplar transformaciones de energía.
Las enzimas son catalizadores extraordinarios.
Aceleran las reacciones por factores de 105 a
1017. Consideremos 109 como promedio.
¿Cuánto es 109?
Por ejemplo, un estudiante tiene 21 años.
21 x 109 = 21 mil millones de años =
21,000,000,000 años.
Enzyme Nonenzyma- Uncatalyzed Catalyzed rate Rate enhance-
tic half-life rate (kun, s-1) (kcat, s-1) ment (kcat/kun)

OMP 78,000,000 2.8 × 10-16 39 1.4 × 1017

decarboxylase years

Staphylococcal 130,000 1.7 × 10-13 95 5.6 × 1014

nuclease years

AMP 69,000 years 1.0 × 10-11 60 6.0 × 1012

nucleosidase

Carboxypepti- 7.3 years 3.0 × 10-9 578 1.9 × 1011

dase A

Ketosteroid 7 weeks 1.7 × 10-7 66,000 3.9 × 1011

isomerase

TPI isomerase 1.9 days 4.3 × 10-6 4,300 1.0 × 109

Chorismate 7.4 hours 2.6 × 10-5 50 1.9 × 106

mutase

Carbonic 5 seconds 1.3 × 10-1 1 × 106 7.7 × 106

anhydrase
Especificidad de la glucosa oxidasa por el sustrato
glucosa + O2 → ácido glucónico + H2O2
Azúcar Velocidad relativa
β-D-glucosa 100
2-desoxi-D-glucosa 25
6-desoxi-6-fluoro-D-glucosa 3
6-metil-D-glucosa 1.85
D-manosa 0.98
α-D-glucosa 0.64
D-fructosa 0
sacarosa 0
glucosa-6-fosfato 0
 Sitio activo
Los sustratos se unen a una región específica de la
enzima denominada sitio activo para formar el complejo
enzima-sustrato.
La idea de complejo enzima-sustrato surge de experimentos con
invertasa a fines del siglo XIX.
O’Sullivan y Thompson, en 1890, ven que la resistencia térmica
de la invertasa aumenta cuando hay sacarosa.
Brown, en 1892, relaciona la cinética de saturación con la
formación de un complejo enzima-sustrato, deduce que cuando
se alcanza la velocidad máxima, toda la enzima está como ES.
Chance, en 1943, “ve” por primera vez un complejo enzima-
sustrato. En este trabajo utiliza por primera vez
espectrofotometría de flujo detenido y simulaciones numéricas.
¿Qué características tienen los sitios activos?
1. El sitio activo ocupa una porción pequeña de la
proteína.

Unión de la
quimotripsina a
su sustrato
2. El sitio activo es una entidad tridimensional formada
por grupos funcionales que provienen de diferentes
partes de la secuencia proteica.

Lisozima y
diferentes
residuos de
su sitio
activo
3. Los sustratos se unen a las enzimas por
múltiples uniones débiles.
- Interacciones de van der Waals.
- Interacciones electrostáticas
- Puentes de hidrógeno
- Interacciones hidrofóbicas
Las constantes de equilibrio de los complejos ES
van de 10-2 a 10-8 M, lo cual corresponde a
energías libres entre -3 y -12 kcal/mol,
considerando que ΔGº' = -RT ln K'eq.
Interacciones entre la quimotripsina y el sustrato
3. Los sitios activos son ranuras o hendiduras. En
general, tienen carácter no polar, excluyen el
agua, y tienen ciertos residuos polares, de tal
forma que constituyen un microambiente.
5. La unión del sustrato depende de una
disposición definida de átomos en el sitio activo.

El sitio de unión al sustrato

puede existir en ausencia de
sustrato (hipótesis de llave-
cerradura de Emil Fischer).

O puede formarse el sitio de

unión al unirse el sustrato
(hipótesis de encaje inducido
de Daniel Koshland).
 Encaje inducido
Estructuras de la hexoquinasa con y sin glucosa

glucosa + ATP → glucosa 6-fosfato + ADP

 ¿Cómo lo hacen?
La cuestión fundamental de la enzimología es
comprender cómo hacen las enzimas para ser
catalizadores tan potentes y específicos
Las enzimas son catalizadores, aceleran la
velocidad de la reacción pero no alteran la
posición del equilibrio.

ΔGº' = -RT ln K'eq

Teoría del estado de transición (Henry Eyring, 1935)
La teoría del estado de transición relaciona la velocidad de una
reacción a la diferencia en energía libre entre el estado basal y el
estado de transición.
La transformación de S en P ocurre a través de la formación de
un estado de transición S*.
⎯⎯
K*
S ←⎯⎯ → S* ⎯⎯
k
→P
La energía de activación de Gibbs ΔG* es la diferencia de
energía entre el estado de transición y el sustrato.
La velocidad k es proporcional a [S*], la cual a su vez depende
de K*.
[S*] = [S] e-ΔG*/RT (pues ΔGº' = -RT ln K'eq)
k = kBT/h e-ΔG*/RT
donde kB es la constante de Boltzmann y h es la constante de Planck.
Teoría del estado de transición (Henry Eyring, 1935)
k = (kBT/h) e-ΔG*/RT
La velocidad de una reacción aumenta cuando la energía de
activación, ΔG*, disminuye.
A su vez, ΔG* tiene un componente de entropía y un
componente de entalpía: ΔG* = ΔH* -TΔS*
k = (kBT/h) e-ΔS*/R e-ΔH*/RT
La energía de activación puede ser grande y la reacción
lenta cuando el estado de transición es demasiado
energético u ordenado.
ΔH* es siempre positivo porque se requiere energía para
reorganizar los enlaces. ΔS* puede ser negativo o positivo
dependiendo si el estado de transición tiene más o menos
grados de libertad.
 Las enzimas aceleran las reacciones porque
estabilizan el estado de transición y bajan la
barrera de activación.

La unión de la
enzima al sustrato
genera una nueva
vía de reacción en
la que la energía
del estado de
transición es
menor que en
ausencia de
enzima
El poder de las enzimas deriva de la energía de unión
entre la enzima y el sustrato. Esta energía surge de las
múltiples interacciones débiles entre la enzima y el
sustrato, y contribuye a la catálisis y a la especificidad.
Las interacciones débiles entre la enzima y el sustrato
se optimizan en el estado de transición. Los sitios
activos de las enzimas no son complementarios a los
sustratos sino que son complementarios a los estados
de transición.
Se establecen interacciones débiles entre la enzima y
el sustrato, pero éstas son optimizadas en el estado de
transición. La energía liberada en el establecimiento
de estas interacciones débiles hace disminuir la
barrera de activación.
sin enzima

con enzima
complementaria
al sustrato

con enzima
complementaria al
estado de transición
Los análogos del estado de transición son
inhibidores competitivos de alta afinidad.
Ejemplo: prolina racemasa bacteriana
El estado de
transición es
planar. Por lo
tanto,
análogos
planos de la
prolina actúan
como
inhibidores
competitivos
muy potentes.
Análogos de estado de transición
Proteasas de serina
Se unen preferentemente al
intermediario tetraédrico.
Si una enzima acelera la velocidad de una reacción
por un factor de 109, ¿cuánto debe bajar la barrera
de activación?
Haciendo cuentas con la ecuación k = (kBT/h) e-ΔG*/RT
podemos concluir que para acelerar la reacción por
un factor de 109, la barrera de activación debe
disminuir 12 kcal/mol.
¿Cuánta energía se libera con una estas
uniones?
- Interacciones de van der Waals.
- Interacciones electrostáticas
- Puentes de hidrógeno
- Interacciones hidrofóbicas
La energía que se libera al establecerse una de
estas uniones débiles es de 1-7 kcal/mol. Por lo
tanto, la formación de múltiples uniones débiles a
nivel del estado de transición puede dar cuenta
de las aceleraciones observadas.
La energía de unión entre la enzima y el sustrato
puede utilizarse para bajar el componente entrópico de
la barrera de activación (ΔG* = ΔH* -TΔS*)
Uno de los aspectos más importantes de la catálisis enzimática
es la entropía. Las reacciones en solución son lentas porque la
aproximación de los reactivos implica una pérdida importante de
entropía.
Las reacciones enzimáticas están confinadas al sitio activo. Los
grupos que reaccionan forman parte de la misma "molécula", el
sitio activo, por lo cual no hay pérdidas de entropía traslacional
o rotacional al formarse el estado de transición. La enzima, al
unirse al sustrato, logra que los reactivos estén próximos,
inmovilizados y alineados óptimamente para reaccionar.
Esta ventaja entrópica "se paga" con la energía de unión entre
la enzima y el sustrato.
Además de los ya mencionados:
1. catálisis por efecto de proximidad y orientación
2. catálisis por unión preferencial de estado de
transición
Determinados grupos funcionales alineados
apropiadamente en el sitio activo contribuyen a la
catálisis mediante los siguientes mecanismos:
3. catálisis general ácido-base
4. catálisis covalente
5. catálisis por iones metálicos
6. catálisis electrostática
Catálisis general ácido base
Un grupo de la enzima participa como aceptor o dador
de protón, estabilizando intermediarios cargados
inestables.

a) no
catalizada

b) Catálisis
general ácida

b) Catálisis
general básica
Catálisis covalente
Un grupo del sitio activo de la enzima, generalmente un
buen nucleófilo, reacciona covalentemente con el
sustrato modificándose transitoriamente.
Catálisis por iones metálicos
70 % de las enzimas necesitan metales!
Algunas formas por las cuales los metales participan en
la catálisis:
1. Uniéndose a los sustratos para orientarlos
correctamente.
2. Mediando reacciones redox a través de cambios en el
estado de oxidación del metal.
3. Estabilizando cargas negativas.
Catálisis electrostática
En el sitio activo de las enzimas, las interacciones
electrostáticas son muy fuertes porque el agua está
excluida y las constantes dieléctricas son bajas.
La distribución de cargas en el sitio activo es tal que
estabiliza los estados de transición.
¿Qué se preguntan hoy en día los enzimólogos?
La revolución de la ingeniería genética y los datos de
estructura cristalográfica han vuelto disponibles muchísimos
datos.
Se ha avanzado mucho en la elucidación de mecanismos
enzimáticos y en la base estructural de la catálisis.
Los ejemplos más estudiados ponen de manifiesto que es
necesaria información estructural, cinética y mecanística
para comprender un determinado sistema enzimático.

Pero, ¿qué queda por responder?

Aún no se cuenta con explicaciones cuantitativas para los
altos niveles de catálisis. Los efectos de estabilización del
estado de transición, efectos de proximidad, catálisis ácido-
base, etc., quedan cortos.
Repaso de cinética
REPASO DE CINÉTICA QUÍMICA
Una reacción ocurre en una serie de pasos individuales. Cada uno de
estos pasos se denomina reacción elemental.
Una reacción de estequiometría A → P puede ocurrir a través de una
secuencia de reacciones elementales A → Ia → Ib → P que describen
el mecanismo.
En una reacción elemental, el número de especies que se combinan
para formar el estado de transición se denomina molecularidad. En
general las reacciones son unimoleculares o bimoleculares.
Excepcionalmente, termoleculares.
A una temperatura determinada, la velocidad de una reacción elemental
es proporcional a la concentración de especies que participan, pues
depende de la frecuencia con que se encuentran las moléculas.
Convención de la IUPAC:

aA + bB + .... → pP + qQ + ....

1 d [A] 1 d [B] 1 d [P] 1 d [Q]

v=- =- = = = k [A]a [B]b
a dt b dt p dt q dt

El orden de una reacción es la suma de los exponentes de los factores

de concentración en la ley de velocidad. Debe ser determinado
experimentalmente.
Para una reacción elemental, el orden es igual a la molecularidad.
REACCIONES DE ORDEN UNO
A→P
d [A] d [P]
v=- = = k [A]

[Producto]
dt dt
Integrando entre t = 0 y t:
[A] = [A]o exp (-kt )
Tiempo
ln [A] = ln [A]o - kt
[P] = [A]o [1 - exp (-kt )]

En una reacción de orden uno, la vida media es constante

e independiente de la concentración inicial, t1/2 = ln2/k
 REACCIONES DE ORDEN DOS, v = k [A]2
2A→P

1 d [A] 2
v=- = k [A]
2 dt
[A]0
[A] =
1 + [A]0 2 kt
1 1
= + 2 kt
[A] [A]0
 REACCIONES DE ORDEN DOS
A+B→P
d [A]
v=- = k [A][B]
dt
[B] [B]0
ln = ln + k ([B]0 -[A]0 )t
[A] [A]0
Ahora, si [B]0 >> [A]0 la reacción es de pseudo primer
orden y la constante de velocidad aparente es k’ =
k[B]0.
[Producto]

[P] = [A]o [1 - exp (-kobst )]

kobs
kobs = k[B]0
[B]0
Tiempo
REACCIONES DE ORDEN CERO

d [A]
v=- =k
dt
[A] = [A]0 - kt
¿Cómo puede determinarse el orden de reacción?

Método integral: Se observa

cómo varía la concentración de
producto (o reactivo) a lo largo
del tiempo, hasta completitud. Se
ve cómo ajusta a la ecuación de
velocidad integrada, por ejemplo,
a una función exponencial.

Método de las velocidades

iniciales: Se observa la
formación de concentraciones
muy pequeñas de producto,
durante un período en el cual las
concentraciones de reactivos se
mantienen constantes.
DIMENSIONES
Concentraciones en M
Velocidades en M s-1
Constantes de velocidad de primer orden en s-1
Constantes de velocidad de orden dos en M-1 s-1

PASO DETERMINANTE DE LA VELOCIDAD

En una reacción compleja, si un paso es mucho más
lento que los otros, la velocidad del proceso será la del
paso lento.
REACCIONES CATALIZADAS ENZIMÁTICAMENTE
Las reacciones catalizadas enzimáticamente no
tienen un orden de reacción simple. Sin embargo, los
pasos individuales sí tienen órdenes simples.

Unión de enzima a sustrato

⎯⎯
E + S ←⎯→ ES
⎯ proceso bimolecular de orden dos

Transformación del complejo ES en producto

ES → E + P proceso unimolecular de orden uno

Cinética enzimática
Historia
Las velocidades de las reacciones catalizadas enzimáticamente
fueron estudiadas por primera vez a fines del Siglo XIX.
Estudios con invertasa: sacarosa + H2O → glucosa + fructosa
O’Sullivan y Thompson (1890) ven que la velocidad depende de
la acidez y que es proporcional a la cantidad de enzima. La
resistencia térmica aumenta en presencia del sustrato sacarosa.
Brown (1892) ve que la velocidad primero aumenta con la
concentración de sacarosa y luego se vuelve independiente.
Pone el concepto de complejo ES en términos cinéticos.
Problemas experimentales: control de pH y mutarrotación de la
glucosa.
No se pudo progresar hasta que se controló el pH.
Concepto de amortiguadores y escala de pH: Sorensen, 1909.
Michaelis y Menten deciden hacer experimentos más prolijos
1. Fijan el pH con amortiguador acético.
2. Consideran la mutarrotación de la glucosa.
3. Miden velocidades iniciales
¿Hoy en dìa, cómo se determina la velocidad de
una reacción catalizada enzimáticamente?

pH y temperatura constantes, amortiguador

se adiciona sustrato y enzima a una solución amortiguadora y se
mide la desaparición de sustrato o la aparición de producto
se puede seguir una propiedad física que varíe en forma
proporcional a la concentración
métodos continuos o discontinuos (de muestreo)
se determina la velocidad inicial, v0
v0 = d[P]/dt = -d[S]/dt a tiempo cero
 VELOCIDAD INICIAL
Los enzimólogos casi siempre determinan velocidad inicial, v0.

Esto es muy importante, pues se evita que la enzima se inactive,

que se consuma sustrato, que cambie el grado de saturación de
la enzima, que ocurra la reacción reversa, que haya inhibición por
producto.

Cuando se está en velocidad

inicial, las gráficas de
concentración de producto en
función del tiempo son lineales.

En general, cuando se está en

velocidad inicial, reaccionó menos
de 10% del sustrato.
 Experimentalmente, los primeros enzimólogos
encuentran que:

V0
V0

[sustrato]
[enzima]

- la velocidad inicial varía en forma lineal con la

concentración de enzima
- la velocidad inicial depende hiperbólicamente de la
concentración de sustrato
Para empezar a derivar la ecuación de Michaelis y Menten

⎯⎯→
k1
E + S ←⎯⎯ ES ⎯⎯
k2
→ E+P
k -1

d [S] d [P]
v=- = = k 2 [ES]
dt dt

Asumimos:

• velocidades iniciales

• [S]T = [S] + [ES]

como [S]T >> [E]T entonces [S]T = [S]

• [E]T = [E] + [ES]

 Hipótesis de equilibrio
(Michaelis y Menten, 1913)
ES está equilibrio con E y con S

Equilibrio de disociación: ⎯⎯
ES ←⎯→ E+S
⎯

k1[E][S] = k-1[ES]

[E][S] k -1
= = KS
[ES] k1
como [E] = [E]T – [ES]

[E][S] ([E]T - [ES]) [S]

KS = =
[ES] [ES]
despejando [ES]

[E]T [S]
[ES] =
K S + [S]
entonces

[E]T [S] Vmax [S]

v = k 2 [ES] = k 2 =
K S + [S] K S + [S]

k -1
donde Vmax = k2 [E]T y Ks =
k1
 Hipótesis de estado estacionario
(Briggs y Haldane, 1925)
ES está en estado estacionario

d [ES]
= 0 = k1[E][S] - k -1[ES] - k 2 [ES]
dt

k1[E][S] = (k -1 + k 2 ) [ES]

[E][S] k + k2
= -1 = KM
[ES] k1

[E][S] ([E]T - [ES]) [S]

KM = =
[ES] [ES]
despejando [ES]:

[E]T [S]
[ES] =
K M + [S]

entonces

[E]T [S] Vmax [S]

v = k 2 [ES] = k 2 =
K M + [S] K M + [S]

k -1 + k 2
donde Vmax = k2 [E]T y KM =
k1
En suma:

⎯⎯→ k1
E + S ←⎯⎯ ES ⎯⎯→ E + P
k2
k -1

Vmax [S]
v=
K M + [S]

k -1 + k 2
Vmax = k 2 [E]T KM =
k1
Del repartido de ejercicios

12. Para una enzima michaeliana, ¿cuánto debe

aumentar la concentración de sustrato para que la
velocidad pase de 10 % de Vmax a 90 % de Vmax? ¿Y
si la enzima presenta cooperatividad positiva?
13. La hexoquinasa cataliza la fosforilación de la glucosa con un
KM de 0.13 mM.
glucosa + ATP → glucosa 6-fosfato + ADP.
a. ¿Qué fracción de Vmax se observaría cuando la concentración
de glucosa corresponde al valor fisiológico de 5 mM?
b. Cuando la glucosa se une a la enzima, ésta sufre un cambio
conformacional. Recién entonces puede unirse el ATP a la
enzima. ¿Qué sentido tiene este fenómeno?
¿Cómo se determinan los parámetros cinéticos (KM,
Vmax y Vmax/KM) de una reacción catalizada
enzimáticamente?

Midiendo la velocidad inicial para concentraciones

crecientes de sustrato.
¿Cómo determinamos KM, VMAX VMAX

y VMAX/KM? error bars 5% VMAX

v0
¡Tratemos de no usar la Slope = VMAX/KM

linealización del doble

KM [Substrate]
recíproco de Lineweaver-Burk!

X
[Substrate]/v0
1/v0

Slope = KM/VMAX Slope = 1/VMAX

1/VMAX KM/VMAX
1/[Substrate] [Substrate]

Lineweaver-Burk plot Hanes or Woolf plot

From Cornish-Bowden, 1995, Fundamentals of Enzyme Kinetics, Portland Press.
¿Qué significan KM, Vmax, kcat y kcat/KM?
KM
• K M = [S] cuando v = ½ V max
• tiene unidades de concentración (M)
k -1 + k 2
• KM =
k1
• Si k 2 << k -1, K M = K S
• Ks representa la afinidad entre la enzima y el sustrato,
pues es la constante de equilibrio de disociación
• K M representa una constante aparente de disociación,
[E][S]
pues K M =
Σ [ES]
• cuanto más pequeño sea K M, hay menos enzima libre y
más complejo enzima-sustrato
En suma:
KM es una constante aparente de disociación que puede ser
considerada como la constante de disociación global de
todas las especies enzima-sustrato.
kcat
• Vmax = kcat [E]T entonces kcat = Vmax / [E]T
• en un mecanismo simple, kcat = k2 y representa el proceso
de primer orden de transformación de ES en P
• en un mecanismo complejo, representa el límite inferior
de las constantes de velocidad de la transformación de
ES en P
-1 -1
• unidades de tiempo (s )
• es el número de recambio (turnover number), máximo
número de moléculas de S que se transforman en P por
unidad de tiempo y por sitio activo.
En suma:
kcat es una constante de primer orden que se
relaciona con las propiedades del complejos enzima-
sustrato (incluyendo enzima-intermediario y enzima-
producto).
kcat/KM
[E][S]
• como K M = , la ecuación de Michaelis y Menten
[ES]
k
puede escribirse v = k cat [ES] = cat [E][S]
KM
• kcat/KM representa la constante aparente de orden dos
para la reacción de la enzima y el sustrato
• tiene unidades de M-1 s-1
• debe ser menor o igual que las constantes de orden dos
en el mecanismo
• da idea de la eficiencia catalítica, puede llegar a ser igual
a k1 y estar limitada por difusión
k cat k2 k k
= = 1 2
KM k -1+k 2 k -1+k 2
k1
• da idea de la especificidad de la enzima por el sustrato
A ⎯⎯
E
→ PA v A = k cat [EA] = (k cat /K M )A [E] [A]
B ⎯⎯
E
→ PB vB = k cat [EB] = (k cat /K M )B [E] [B]
vA (k /K ) [A]
= cat M A
vB (k cat /K M )B [B]
En suma:
kcat/KM es una constante aparente de orden dos que se
relaciona con las propiedades de la enzima libre y el
sustrato libre.
 Algunos valores

kcat kcat/KM
Enzima Sustrato KM (M)
(s-1) (M-1 s-1)

Acetilcolines- Acetilcolina 9.5 x 10-5 1.4 x 104 1.5x106

terasa
Anhidrasa CO2 0.012 1.0 x 106 8.3x107
carbónica
Catalasa H2O2 0.025 1.0 x 107 4.0 x 108

Fumarasa Fumarato 5.0 x 10-6 800 1.6 x 108

Ureasa Urea 0.025 1.0 x 104 4.0 x 105

 Enzimas glicolíticas
Enzima Sustrato [S] (µM) KM (µM)
Glucosa 6-P isomerasa G6P 130 210
Aldolasa FBP 32 1000
Triosafosfato isomerasa G3P 3 460
Gliceraldehído 3P deshidrogenasa G3P 3 70
Fosfoglicerato quinasa 3PG 60 1200
Fosfoglicerato mutasa 3PG 60 5000
Enolasa 2PG 7 70
Piruvato quinasa PEP 23 200
Glicerol fosfato deshidrogenasa GP 220 190
Lactato deshidrogenasa Pyr 51 59

Las enzimas que quieren maximizar la velocidad evolucionan de

tal forma de maximizar kcat/KM y de que KM sea mayor que [S], la
concentración fisiológica de sustrato, pues v = kcat/KM [E] [S].
(Ideas desarrolladas por Alan Fersht)
Del repartido de ejercicios:
14. Con respecto a las reacciones catalizadas por enzimas indique si las
afirmaciones son verdaderas o falsas.
a) Una enzima participa en la reacción alterando la constante de equilibrio de
la reacción, sin alterar la barrera de activación (Ea).
b) El sustrato con menor valor de KM tiene la mayor afinidad aparente por la
enzima.
c) Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima
que cataliza la transformación de un (1) micromol de sustrato por minuto bajo
condiciones definidas.
d) El número de recambio (kcat) es el número de moles de sustrato
transformado por minuto por mol de centro activo.
e) La catálisis puede ser explicada por una unión tipo llave y cerradura entre el
sustrato y la enzima.
f) La velocidad inicial de una reacción catalizada enzimáticamente es
independiente de la concentración de sustrato.
g) La velocidad inicial aumenta proporcionalmente a la concentración de
enzima.
h) El KM equivale a la concentración de sustrato a la cual la velocidad es la
mitad de la máxima.
i) El KM varía con la concentración de enzima.
 Experimentalmente, se encuentra que:

V0
V0

[sustrato]
[enzima]

- la velocidad inicial varía en forma lineal con la

concentración de enzima
- la velocidad inicial depende hiperbólicamente de la
concentración de sustrato
 ⎯⎯→ k1
E + S ←⎯⎯ ES ⎯⎯→ E + P
k2
k -1

Vmax [S]
v=
K M + [S]

Vmax = k 2 [E]T KM =
k -1 + k 2
k1
 ⎯⎯→
E + S ←⎯⎯ ES ⎯⎯→ E + P
k2 k1

k -1

Velocidad
inicial o de

[Producto]
estado
estacionario
0 20 40 60 80 100 120

Tiempo (s)

[Producto]
[Producto]

0 1000 2000 3000 4000 5000

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

Tiempo (s) Tiempo (s)

Preestacionario Curso total de reacción

 Ecuación de Michaelis-Menten integrada

[Producto]
Velocidad inicial

Tiempo

Cuando el enlentecimiento en la formación de producto

se debe solo a la depleción de sustrato, se puede
encontrar KM y VMAX “con un solo tubo de ensayo”:
- Determinando v para diferentes [S] con las tangentes.
- Integrando la ecuación de Michaelis-Menten.
 d[P] d[S] VMAX [S]
v= =- =
Integrando la dt dt K M + [S]
ecuación de Balance de masa [S]0 = [S] + [P]
Michaelis- d[P] VMAX ([S]0 - [P])
=
Menten dt K M + [S]0 - [P]
d[P] (K M + [S]0 - [P])
∫ [S]0 - [P]
= ∫ VMAX dt

Condicion de frontera [P] = 0 a t = 0

(K M + [S]0 ) d[P] [P] d[P]
∫ [S]0 - [P] - ∫ [S]0 - [P] = ∫ VMAX dt
[S]0
VMAX t = [P] + K M ln
[S]0 - [P]
Analogamente:
[S]0
VMAX t = [S]0 - [S] + K M ln
[S]
 [S]0
VMAX t = [S]0 - [S] + K M ln
[S]
Rearreglando:
VMAX

[S]0 - [S]
t KM
VMAX/KM

1 [S]0
ln
t [S]
 d[P] d[S] VMAX [S]
v= =- =
dt dt K M + [S]
caso limite: K M << [S]0
d[P]
= VMAX
dt
[P] = VMAX t
 d[P] d[S] VMAX [S]
v= =- =
dt dt K M + [S]
Caso limite: K M >> [S]0
d[S] VMAX
− = [S]
dt KM
Ln [S]
⎛ VMAX ⎞ VMAX
[S] = [S]0 exp ⎜ − ⎟t KM
⎝ KM ⎠
VMAX
ln [S] = ln [S]0 − t
KM t
 Sustratos con alta afinidad
Cuando [E]0 ~ [S]0, ya no se puede asumir que [E]0 <<
[S]0

Ya no se cumple: Vmax [S]

v=
K M + [S]

No va a haber un buen ajuste a una hipérbola y las

linealizaciones van a presentar desviaciones.
En cambio se puede demostrar:

v=
Vmax
2 [E]T
{ ([E]T + [S]T + K S ) − ([E]T + [S]T + K S )2 − 4 [E]T [S]T }
Sustratos con alta afinidad
 Reacciones reversibles
⎯⎯→ ES ←⎯⎯
E + S ←⎯⎯ ⎯⎯→ E + P
k1 k2

k -1 k -2
f r
Vmax [S] Vmax [P] donde f
Vmax = k 2 [E]T r
Vmax = k -1[E]T
S
-
KM K PM
v= k -1 + k 2 k -1 + k 2
[S] [P] S
K = K PM =
1+ S+ P M
k1 k -2
KM KM

En el equilibrio v = 0
[P] f
Vmax K MP (k CAT KM )S
Keq = = r = Relación de Haldane
[S] Vmax K MS
(k CAT KM )P
Los parámetros cinéticos de una reacción reversible
están relacionados por la constante de equilibrio
Del repartido de ejercicios
18. La enzima fumarasa cataliza la hidratación del fumarato
para dar malato. Esta reacción tiene un ΔGº’ de –3.8 kJ/mol.
Para la enzima de corazón de chancho, se han reportado
valores, para la reacción directa, de KM = 1.7 mM y VMAX =
0.25 mM-1 s-1; y, para la reacción reversa, de KM = 3.8 mM y
VMAX = 0.11 mM-1 s-1. En cambio, para la enzima de una
bacteria, se han reportado valores de KM = 1.6 mM y VMAX =
0.024 mM-1 s-1 para la reacción directa, y KM = 1.2 mM y
VMAX = 0.012 mM-1 s-1 para la reacción reversa. Comente en
la plausibilidad de estos reportes.
 (PARÉNTESIS)
UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Una unidad es la cantidad de enzima que cataliza la
transformación de 1 µmol de sustrato en producto en 1 min bajo
condiciones definidas.
(Comisión de Enzimas, Unión Internacional de Bioquímica y
Biología Molecular, 1961)

U mL-1: concentración
U mg-1: actividad específica

Otra unidad es el katal. Un katal corresponde a la conversión de 1

mol de substrate por segundo.
En la mayoría de los casos, las unidades se refieren a
concentraciones altas de sustrato (>KM), por lo que las unidades
no dependen de la concentración de sustrato.

40
8
35

30

v0 (uM min )
6

-1
25
v0 (µM min )
-1

20 4
15

10 2

0 0

0 10 20 30 40 50 0 20 40 60 80 100
-1
mU mL [Xanthine] (uM)

Entonces, para formar más producto, o descomponer más

sustrato, o en un período más corto de tiempo, simplemente hay
que añadir proporcionalmente más enzima.
Del repartido de ejercicios:

1. Se quiere medir la actividad de la enzima

malato deshidrogenasa en un extracto tiempo (s) absorbancia
bacteriano.
oxalacetato + NADH → L-malato + NAD+ 0 0.635
Para ello, se coloca amortiguador fosfato pH
20 0.584
7.6, oxalacetato 0.6 mM y NADH 0.1 mM en un
volumen total de 3 mL. Se dispara la reacción 40 0.536
agregando 0.01 mL de extracto bacteriano. Este 60 0.484
extracto contiene 32 mg de proteína/mL. Se 80 0.433
observa la disminución de absorbancia a 340
100 0.385
nm debido a la desaparición de NADH (ε = 6.22
mM-1 cm-1). 120 0.356
a- ¿Cuál es la velocidad de reacción? 140 0.335
b- Calcule la actividad de la enzima por mL de 160 0.324
extracto.
c- Calcule la actividad específica de la enzima.
Del repartido de ejercicios:

2. La enzima glutamato oxalacetato transaminasa (TGO) se libera a la

sangre en el infarto de miocardio. Para analizarla, se mide su actividad
siguiendo la desaparición de NADH acoplándola a la malato
dehidrogenasa:
aspartato + α-cetoglutarato ⎯⎯⎯
TGO
→ glutamato + oxalaceto
MDH
oxalaceto + NADH ⎯⎯⎯→ malato + NAD+
En una mexcla de reacción se coloca un exceso de aspartato (100
veces el Km), 0.1 mL de suero de un paciente, 0.3 µmoles de NADH y
exceso de malato deshidrogenasa para un volumen de 0.9 mL. La
reacción se inicia agregando un exceso de α–cetoglutarato contenido
en 0.1 mL. Luego de un período de latencia, se observa un
decrecimiento en la absorbancia a 340 nm de 0.04 unidades de
absorbancia por minuto siendo la cubeta de reacción de 1 cm. Calcular
la actividad de la TGO en unidades por mL de suero de paciente.
Del repartido de ejercicios:

3. Se quiere medir actividad β-galactosidasa en

un extracto bacteriano que contiene 5 mg de
proteína por mL de extracto. Para ello, se
incuban 0.25 mL de extracto en amortiguador
tiempo A400
con 3 x 10-3 M de p-nitrofenil β-galactósido en
un volumen total de 1 mL. Cada 90 segundos, 90 s 0.068
se toman alícuotas de 0.1 mL y se agregan a
2.9 mL de NaOH 0.1 M. Se mide la formación 180 s 0.135
de p-nitrofenol a 400 nm, siendo ε = 18300 M-1 270 s 0.202
cm-1 en NaOH 0.1 M.
a- ¿Cuál es la actividad de la enzima por mL de 360 s 0.270
extracto?
b- ¿Cuál es la actividad específica del extracto?
c- ¿Qué controles deben realizarse?
Del repartido de ejercicios:

8. Un gramo de músculo fresco contiene 40 unidades de

una enzima. Estime la concentración intracelular de
la enzima asumiendo que un gramo de músculo
fresco contiene 0.8 mL de agua intracelular:

a) Sabiendo que el número de recambio de la enzima

es de 6 x 104 min-1.

b) Sabiendo que la actividad específica de la enzima

pura es de 500 unidades/mg y su peso molecular es
120.000.