REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

Laboratorio N° 4 & Laboratorio No. 5

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María J. Álvarez P.¹; Vanessa de la Espriella A. ; Jomaria Medina M. ; Andrés R. Pérez D.
Estudiantes de la Universidad de Sucre, adscritos al programa de biología, Facultad de
Educación y Ciencias

1. maria.alvarez@unisucrevirtual.edu.co
2.vanessa.delaespriellaa@gmail.com
3.jhomairamedinamolano1@gmail.com
4.andresrafael.perezdiaz@gmail.com
RESUMEN
La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica para hacer muchas copias
de una determinada región de ADN in vitro. Conjuntamente, la electroforesis en gel de
agarosa, es una técnica en la que una corriente eléctrica impulsa fragmentos de ADN a
través de una matriz de gel y los fragmentos de ADN se separan según su tamaño, de
esta manera se pueden visualizar los resultados de la PCR. En el presente artículo se
aplicó la técnica de la PCR, para determinar la especie de una muestra de ADN
previamente dada y desconocida, asimismo, se llevó a cabo la técnica de electroforesis
en gel de agarosa con cóctel de PCR, para reflejar lo obtenido en esta última reacción.Para
lo cual, se preparó un cóctel de PCR, que incluía: Buffer, MgCl2, dNTP’S, cebadores, Taq
polimerasa y agua destilada, donde cada una de estos elementos propiciaron (por su
constitución), para que se de la efectiva reacción en cadena de la polimerasa,
posteriormente se acomodaron los tubos en el termociclador durante cierto tiempo y
más adelante se analizaron en la electroforesis en gel de Agarosa al 1.5% a 80 Voltios por
60 min. Según los resultados obtenidos, la especie identificada fue de una vaca
reconocido por su valor numérico del patrón de banda que es exactamente 561 (valor
teórico) y el adquirido en el laboratorio fue de 520.853 (Valor experimentales), por lo que
se aproximó para dar respuesta de la especie.

Palabras claves: Técnica, ADN, PCR, electroforesis, Agarosa, patrón de banda.

ABSTRACT

The polymerase chain reaction, or PCR is a technique to make many copies of a particular
region of DNA in vitro. Together, the agarose gel electrophoresis is a technique in which
an electric current drives fragments of DNA through a gel matrix and the DNA fragments
are separated according to their size, in this way you can view the results of the PCR. In
the present article the skill of the PCR was applied, to determine the species of a sample
of ADN previously given and unknown, also, the electroforesis skill was carried out in
agarosa gel with PCR cocktail, to reflect the obtained in the latter reaction. For which,
there was prepared a cocktail of PCR, which it was including: Buffer, MgCl2, dNTP'S,
primers, Taq polymerase and distilled water, where each of these elements propitiated
(by its Constitution), to be of the effective polymerase chain reaction, subsequently the
tubes were arranged in the ThermoCycler during Some time and later were analyzed in
agarose gel electrophoresis at 1.5% at 80 volts for 60 min. According to the results
obtained, the species identified was of a cow recognized by its numerical value of the
band pattern which is exactly 561 (theoretical value) and the one acquired in the
laboratory was of 520,853 (experimental value), so it approached to give Response of the
species.

Keywords: Technique, DNA, PCR, electrophoresis, agarose, band pattern

INTRODUCCIÓN
La gran complejidad de los procesos
biológicos en los seres vivos ha sido por
años la razón por la que los
investigadores han centrado su atención
en descifrar los mecanismos que se
esconden detrás de esos procesos. En la
búsqueda de soluciones, han ido
apareciendo diferentes tecnologías
cuyos protocolos están dirigidos al
estudio del ADN; probablemente, la más
importante sea la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR, por sus siglas en
inglés), desarrollada por Kary Mullis y
que revolucionó la biología molecular y
la forma en cómo se estudiaban los
ácidos nucleicos en ese momento (de
Dios, Tamay L., et.al., 2013). Actualmente
sabemos que la misión de la PCR es
copiar millones de veces una secuencia
específica de ADN blanco mediante una
poderosa catálisis llevada a cabo por una
enzima conocida como ADN polimerasa,
de tal manera que cantidades pequeñas
de ADN pueden ser sintetizadas y
copiadas fielmente para analizarse con
diferentes fines. El desarrollo de esta
técnica permitió estudiar y manipular
mejor al ADN, facilitando el
establecimiento de protocolos
experimentales en biología molecular. El
progreso de esta técnica ha sido muy
notable y ha ido en paralelo con los
nuevos retos para estudiar y
comprender mejor el rol de los genes,
tanto en condiciones fisiológicas como
patológicas. Es por ello que una de las
formas recientes para detectar y
cuantificar a los ácidos nucleicos es a
través de la PCR en tiempo real, la cual es
una modalidad de la PCR considerada
como una técnica cuantitativa (de Dios,
Tamay L., et.al., 2013), para lo cual se
desarrolló la electroforesis en gel, la cual
es una técnica en la que una corriente
eléctrica impulsa fragmentos de ADN a
través de una matriz de gel y los
fragmentos de ADN se separan según su
tamaño. Típicamente se incluye un
estándar, o marcador de peso molecular,
para que pueda determinarse el tamaño
de los fragmentos en la muestra de PCR.
Los fragmentos de ADN de la misma
longitud forman una "banda" en el gel
que se puede identificar a simple vista si
el gel se tiñe con un pigmento que se una
al ADN (Fierro, F., 2014).
En esta revisión, se muestra los métodos
de la reacción en cadena de
MATERIALES Y MÉTODOS
Inicialmente se calculó la cantidad de
mezcla de PCR necesaria para el número
deseado de reacciones, el master mix se
realizó con 5 ul de buffer de PCR, 1,5 ul
de MgCl2, 2,5 ul de dNTP’S, 1,5 ul de cada
cebador (6), 0,2 ul de Taq Polimerasa. En
5 tubos eppendorf se adicionó 22 ul de
master mix con los reactivos anteriores,
en tubo se adicionó 3 ul de agua
destilada para completar 25 ul, en los 4
restantes se adicionaron 3 ul
muestras de ADN. La reacción de
amplificación se realizó en
termociclador, allí se obtuvo el perfil
térmico de cada muestra. En la siguiente
sesión se preparó el gel de agarosa. se
pesó 1,8 gramos de agarosa y se midió
un volumen de TBE, se agregó cada uno
de estos reactivos en un recipiente de
RESULTADOS
[1]
Buffer 5x
MgCl2 25 mM
dNTP’S 2 mM
polimerasa, así como su comprensión y
aplicación, para la identificación del ADN
de una especie previamente
desconocida y el conocimiento óptimo
de la electroforesis en gel agarosa y su
importancia para interpretar
lógicamente los resultados en la PCR.
la
200 ml y se calentó la solución hasta que
se disolvió la agarosa. Seguido de esto se
ensambló la cámara de electroforesis y
los peines donde se realizó el gel de
agarosa, cuando el gel de agarosa bajó
su temperatura se adicionó 3 ul de
gelstar, la agarosa se dispensó en la
cámara de electroforesis y se dejó
solidificar por 40 minutos. El plato de gel
se colocó en el tanque de electroforesis
de con buffer. La muestras de DNA se
preparó con 3 ul de buffer green y 5 ul de
un la muestra de DNA, adicionalmente se
sembró la muestra en el pozo de gel de
agarosa. Se conectó cada electrodo a la
fuente de poder, se encendió y se dejó
correr la muestra por 40 minutos. El gel
se trasladó al fotodocumentador para
visualizar los resultados obtenidos.
[2] V1rx v4rx
1x 5 µl 20 µl
1,5 mM 1,5 µl 6 µl
0,2 mM 2,5 µl 10 µl
 C1 10mM 0,5 mM 1,25 µl 5 µl
C2
C3
C4
C5
C6

Taq Pol 5 u/µl 1 u/µl 0,2 µl 0,8 µl

H2O UP 500u/µl 1u/µl - -

Total 10,45 µl 41,8 µl
100
Tabla N°1. Resultado del cóctel de PCR

Cálculos:

CiVi=CfVf Vf= 25 µ𝑙

𝐶𝑓𝑉𝑓
Vi=
𝐶𝑖

1𝑋 𝑥 25 µ𝑙
V1= =5 µl (Buffer)
5𝑋

1,5 𝑚𝑀 𝑥 25 µ𝑙
V2= = 1,5 µ𝑙 (MgCl2)
25𝑚 𝑀

0,2𝑚𝑀 𝑥 25 µ𝑙
V3= 2 𝑚𝑀
= 2,5 µ𝑙 (dNTP’S)

0,5 𝑚𝑀 𝑥 25 µ𝑙
V4= 10 𝑚𝑀
= 1,25 (Cebadores)

Desnaturalización Desnaturalización Alineamiento Extensión Ext. final

inicial

94°C 94°C 58° C 72° C 72° C

2 min. 30 seg 30 seg 48 seg 5 min.

Tabla N°2. Perfil Térmico
Gráfica N°1. Tiempos de cada fase del perfil térmico con relación a la temperatura.

CEBADORES BANDA (Pb)

Humano 741 F 334

Perro 368 F 680

Cerdo 573 F 453

Cabra 894 F 132

Vaca 121 F 561

Tabla N°3. Indicador de cebadores

Figura N°1. Muestra de ADN Figura N°5. Peso de la agarosa

Figura N°2. Tubos ependorff con control Figura N°6. 0,75 de agar + 5ml de
positivito y control negativo Buffer y agua destilada

Figura N°3. Diferentes reactivos a utilizar Figura N°7. PCR con buffer green

Figura N°4. Datos arrojados por el Figura N°8. Resultados arrojados por el
termociclador fotodocumentador

ANÁLISIS DE RESULTADOS

La reacción en cadena de la polimerasa utilizarse para amplificar secuencias

(PCR) es una técnica que permite específicas de DNA relativamente
amplificar rápidamente muestras pequeñas determinadas por los
pequeñas de DNA, es decir, aumentar su cebadores (Tortora et al., 2007). Los
cantidad de modo que sea suficiente cebadores para PCR son pedazos cortos
para poder analizarla. La PCR sólo puede de ADN de cadena sencilla. En cada
reacción de PCR se utilizan dos fundamental para la optimización de la
cebadores que están diseñados para reacción.
flanquear la región blanco (la región que
debe ser copiada). Es decir, les agregan Durante la PCR las moléculas de DNA de
secuencias que harán que se unan a cadena doble se desnaturalizan, cada
cadenas opuestas del molde de ADN cadena simple sirve como molde para la
sólo en los extremos de la región a síntesis de una nueva cadena, y luego se
copiar. Los cebadores se unen al molde renaturaliza (se vuelven a unir) con una
mediante complementariedad de bases. cadena complementaria en condiciones
Cuando se unen al molde, la polimerasa controladas. La PCR es una reacción en
los extiende y la región que se encuentra cadena de 25 a 35 ciclos, presentando
entre ellos se copia. cada uno 3 pasos: 1) desnaturalización
del DNA de cadena doble, 2) hibridación
Todas las muestras se procesaron con del cebador que depende de la
control positivo y negativo lo que temperatura de fusión, 3) síntesis de
permitió asegurar la ausencia de DNA que utiliza una polimerasa
compuestos orgánicos e inorgánicos en termorresistente (Passarge, 2009).
las muestras, que influyeran en la
amplificación de un posible ADN Los resultados de una reacción de PCR se
micobacteriano presente. visualizan (se hacen visibles) al usar
electroforesis en gel. Con este método se
En esta reacción se utiliza un polimerasa separan, identifican y purifican
(Taq polimerasa) , la cual es una enzima fragmentos de ADN. La agarosa es un
termoestable aislada que simplifica la polímero lineal, en el cual las moléculas
técnica de PCR, ya que permite la de ADN de doble cadena migran de
automatización (desarrollo del manera inversamente proporcional al
termociclador). El desoxinucleótidos logaritmo en base 10 de sus tamaños
trifosfato (dNTPs) capta Mg++, por lo que moleculares. El amortiguador TBE
las concentraciones de ambos favorece la electroforesis de moléculas
componentes deben guardar siempre la chicas a medianas, en cambio el segundo
misma relación. Por otra parte, el para moléculas grandes a medianas.
tampón de la reacción ayuda en la Dado que el DNA está cargado
práctica de aumentar la especificidad y negativamente debido a los grupos
fidelidad de la reacción en la cadena de fosfatos de la molécula, la migración en
la polimerasa. Además es de gran la cámara de electroforesis ocurre del
importancia de dos cationes que son polo negativo hacia el polo positivo. La
añadidos en forma de sales. El cloruro de migración de ADN se ve afectada tanto
magnesio (MgCl2), aumenta la por la composición como por la fuerza
temperatura de hibridación del DNA. La iónica del amortiguador empleado,
concentración de este ión resulta buffer, (Puerta & Ureña, 2005). Los
fragmentos de ADN de la misma longitud proteínas de las muestras problema,
forman una "banda" en el gel que se con los patrones de bandas de muestras
puede identificar a simple vista si el gel de referencia. A partir del ADN problema
se tiñe con un pigmento que se una al se identificó el organismo al que
ADN. pertenece, en este caso corresponde a la
vaca ya que teóricamente tiene una
Finalmente, la identificación de especies banda de 561 Pb y experimentalmente
se realiza comparando el perfil dió un resultado de 520 Pb, el cual es el
electroforético obtenido a partir de las que más se aproxima

CONCLUSIONES
La PCR y la electroforesis en gel son para determinar a qué especie
técnicas que trabajan en conjuntos, ya pertenecía el ADN problema, de acuerdo
que la PCR permite producir copias de al tamaño de los fragmentos de DNA que
DNA y la electroforesis en gel permite se obtuvieron en la electroforesis. Para
visualizar el DNA obtenido de la PCR, es determinar el tamaño de los fragmentos
decir, es el método estándar para de DNA que se obtienen en la
separar y purificar fragmentos de ADN electroforesis es importante incluir un
cuando no requerimos un alto poder de marcador de peso molecular.
resolución. Lo cual resultó de utilidad

BIBLIOGRAFÍAS

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