extracción de la caseina y determinación del punto isoelectrico

camargo soto andrea sofia, mercado ortega karen milena, teheran enciso maria
angelica

facultad de ioquímic y ciencias, departamento de ioquími y ioquím, programa de

ioquími, laboratorio de ioquímica i.

INTRODUCCIÓN

Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en

agua, una característica que presentan las proteínas es que la carga total que ellas adquieren
depende del pH del medio, entonces, ellas al presentar un pH característico el cual la carga
su neta es cero, a este pH se le denomina punto isoelectico.

La caseína es una fosfoproteína (un tipo de heteroproteína) presente en la leche y en

algunos de sus derivados. En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada
al calcio (fosfato de calcio), en un complejo que se ha denominado caseinógeno; La leche,
al coagularse, se separa en una parte semi-sólida, llamada caseína y otra líquida, donde
podemos encontrar el suero de leche. Sabiendo esto la caseína contiene aproximadamente
el 80% de las proteínas de la leche mientras que el suero posee el 20% restante. [1]

OBJETIVOS

HIPOTESIS

FUNDAMENTO

PROCEDIMIENTO

(CUADERNO)

RESULTADOS
  Aislamiento de la caseína:

Figura 1. Leche con ácido acético (sedimento)

Figura 2. Resultado de la filtración (caseína)

 Preparacion de la solución de caseína

Figura 3. Solución de caseína

 Determinacion de pH de la caseína
 Con la preparación previa de las siguientes soluciones se prepararon la solución para medir su
correspondiente absorbancia:
´{jo phhhhhh

pH
Acetato Acetico
Tubo Acético 0.01N aprox
0.1N 0.1N
.
1 0.5 9.5 - 3.2
2 1 9 - 3.6
3 1.5 8.5 - 3.8
4 2 8 - 4
5 3 7 - 4.2
g6 4 6 - 4.5
7 6 4 - 5
8 8 2 - 5.1
9 6 - 4 5.5
10 8 - 2 6.1
phhh
Tabla No. 1. Fracción para preparación de soluciones según sus componentes a pH aproximado.

Figura 4. Tubos con las distintas soluciones para medir el Ph aproximado

Tabla 2. Se obtuvieron los siguientes resultados correspondientes a la medición de la absorbancia

de la muestra de caseína a diferentes pH en diferentes tubos de ensayo (10) a 640 nm:

Tubo pH Absorbancia
Experimenta
 l
1 3,46 -0,015
2 3,64 -0,018
3 3,88 0,007
4 4,0 0,068
5 4,33 0,1395
6 4,43 0,201
7 4,77 0,080
8 5,1 0,0175
9 5,59 -0,011
10 6,06 -0,0165
Tabla No. 2 Medidas de las absorbancias de la caseína a diferentes pH en solución.

Con los anteriores datos se realizó una gráfica pH Vs Absorbancia, en la que se muestra el
comportamiento de las soluciones:
0.25

0.2 0.2

0.15
Absorbancia

0.14

0.1
0.08
0.07
0.05

0.02 0.02 0.02 0.02

0.01 0.01
0
3.46 3.64 3.88 4 4.33 4.43 4.77 5.1 5.59 6.06
pH

ANALISIS DE RESULTADO

Extracción de la caseína:

Al adicionar el ácido acético a la leche se observa un cambio en su composición, evidenciándose

una precipitación completa, esto se puede explicar por el cambio de pH experimentado por la
leche, inicialmente entre 6,5 y 6,7, allí la proteína (caseína) se encuentra cargada negativamente
solubilizada con sal cálcica, al acidificarse el pH se acerca al punto isoeléctrico de la proteína, al
llegar a pH aproximado a 4,2 y 4,7 se neutraliza la caseína (los grupos fosfatos se protonan), así se
precipita debido a que hay menos repulsiones intermoleculares, [6] evidenciándose la separación
de estos compuestos por medio de densidad ya que la densidad del agua es 1 g/ml quedando arriba
por tener densidad más baja que la caseína que es de 1.3g/ml, esta separación se da debido a que
cuando las proteínas en este caso la caseína se encuentra a pH de punto isoeléctrico son menos
solubles en agua y se da la separación de la proteína y el agua. [8]

Ca2 + Caseinato + CH3COOH Caseína + CaCOOH

Después de precipitada la caseína, se procede a lavado para eliminar el suero y grasas forzando a la
parte soluble de la caseína con la lactosa a cristalizar.

Determinación del punto isoeléctrico:

Según la gráfica el punto isoeléctrico se encuentra en (5,2), ya que se puede observar un aumento de
la absorbancia por respecto al pH.

Al utilizar un porcentaje de error tenemos que:

teorico−experimental
de error=
teorico

4,2−4.33
de error= × 100=−3,09
4,2

La prueba para determinar el punto isoeléctrico de la caseína es aceptable, ya que el porcentaje

indica que se realizan bien el proceso, ya que están cerca del rango en que precipita la caseína. las
soluciones de acetato de sodio y ácido acético al 0.1 y 0.01 se usaron como soluciones
amortiguadoras que permitieron identificar la proteína ya que la caseína se solubiliza fácilmente en
valores de pH alejados a su punto isoeléctrico, en el tubo que se observa una ligera precipitación
está indicando que la proteína se ha insolubilizado. [3]

Se observa la disminución de la actividad de la proteína (caseína) con referencia a su pH debido a

que cuanto está a pH alejados de su punto isoeléctrico se comporta diferente, igual se puede notar
en su inestabilidad después de pasar por el punto en que sus cargas son neutras.

CONCLUSIÓN
La caseína es una fosfoproteína presente en la leche, se logró una exitosa separación ya
que al añadir ácido acético se coagula y se separa en una parte semi-sólida, llamada
caseína y otra líquida, donde podemos encontrar el suero de leche, esto con ayuda de la
filtración se separa y queda finalmente la caseína, Se determinó el punto isoeléctrico de la
caseína con la interpretación de la gráfica pH vs absorbancia y Se evidenció que no hubo error
en el procedimiento de medición de las absorbancias ya que el porcentaje de error fue menor al 1%.

Preguntas
1. Fundamento de purificación de la proteína
Una purificación de proteínas es una serie de procesos que permiten aislar un sólo
tipo de proteína de una mezcla compleja. La purificación de proteínas es vital para la
caracterización de la función, estructura en interacciones de la proteína de interés, El
material inicial es generalmente un tejido biológico o un cultivo microbiano. Hay varios
pasos en el proceso de purificación; puede liberar a la proteína de la matriz que lo
confina, separar las partes proteica y no proteica de la mezcla, y finalmente separar la
proteína deseada de todas las demás. Este último paso puede ser el aspecto más
laborioso de la purificación de proteínas. [7]
2. Etapas de la purificación de las proteínas

[8]
3. Composición de las proteínas de la leche

[9]
4. Caracteristicas de la estructura primaria de las proteínas

11]
5. Ley de lambervil

En óptica, la ley de Beer-Lambert, también conocida como ley de Beer o ley de

Beer-Lambert-Bouguer es una relación empírica que relaciona
la absorción de luz con las propiedades del material atravesado.
6. Espectofotometria
 La espectrofotometría es un método científico utilizado para medir cuanta luz
absorbe una sustancia química, midiendo la intensidad de la luz cuando un haz
luminoso pasa a través de la solución muestra, basándose en la Ley de Beer-
Lambert.
Principios:; En la espectrofotometría se aprovecha la absorción de radiación electromagnética
en la zona del ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la radiación
incidente en este espectro y promueve la transición del analito hacia un estado excitado,
transmitiendo un haz de menor energía radiante. En esta técnica se mide la cantidad de luz
absorbida como función de la longitud de onda utilizada. La absorción de las
radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es
característica de cada sustancia química.

El espectrofotómetro1 es un instrumento con el que se apoya

la espectrofotometría para medir la cantidad de intensidad de luz absorbida después
de pasar a través de una solución muestra.

Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de

una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al
operador realizar dos funciones:

1. dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra,

2. indicar indirectamente qué cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en
la muestra.

Partes de un espectrofotómetro
El espectrofotómetro, en general, consta de dos dispositivos; un espectrómetro y un fotómetro.
Un espectrómetro es un dispositivo que produce, dispersa y mide la luz. Un fotómetro tiene un
detector fotoeléctrico que mide la intensidad de la luz.

 Espectrómetro: Produce un rango deseado de longitud de onda de luz. Primero un

colimador (lente) transmite un haz recto de luz (fotones) que pasa a través de un
monocromador (prisma) para dividirlo en varias componentes de longitudes de onda
(espectro). Entonces un selector de longitud de onda (ranura) transmite sólo las longitudes
de onda deseadas.
 Fotómetro: Después de que el rango deseado de longitud de onda de luz pasa a
través de la solución muestra en la cubeta, el fotómetro detecta la cantidad de fotones que
se absorbe y luego envía una señal a un galvanómetro o una pantalla digital. [10]

BIBLIOGRAFIA

[1]Fernandez, M. (2016, 11). Caseína. Myprotein. Obtenido 04, 2018, de

https://www.myprotein.es/thezone/suplementos/cuando-tomar-caseina/

[2]Calvo, M. (2015, 05). Caseinas. Bioquimica. Obtenido 04, 2018, de

http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/proteins/caseina.html

[3]Fernández, M. (2014, 07). Carga eléctrica de las biomoléculas, en función de su punto

isoeléctrico y del pH. Biomodel. Obtenido 04, 2018, de
http://biomodel.uah.es/tecnicas/carga/carga_pI_pH.htm

[4]Sosa, A. (2017, 11). Keyword - Phosphoprotein. Uniprot. Obtenido 04, 2018, de

http://www.uniprot.org/keywords/KW-0597

[5]Tejión Rivera, José María; Garrido Pertierra, Amando (2006). Fundamentos de bioquímica
estructural (2ª edición). Tébar. p. 72

[6]Paris, R. (2017, 10). Productos lacteos. Unybook. Obtenido 04, 2018, de

https://unybook.com/apuntes/file-1b5d7c958444ceb330a87b69bacbd73c/bromatologia/343-
productes-lactics

[7]Lebendiker, M. (2006, 09). The Protein Purification Facility. The Wolfson Centre for Applied
Structural Biology. Obtenido 04, 2018, de http://wolfson.huji.ac.il/purification/

[8]Herrera, J. (2016, 07). AISLAMIENTO DE CASEINA Y LACTOSA. Academia. Obtenido 04,

2018, de https://www.academia.edu/16218184/AISLAMIENTO_DE_CASEINA_Y_LACTOSA

[9]Hochwallner, H., Schulmeister, U., Swoboda, I., Spitzauer, S., & Valenta, R. (2014). Cow’s milk
allergy: From allergens to new forms of diagnosis, therapy and prevention. Methods, 66(1), 22-33.

[10] Acosta, J. (2016, 10). espectrofotometro. El espectrofotómetro . Obtenido 04, 2018, de

https://elespectrofotometro.com/

[11] Proparam. Expasy. Obtenido 04, 2018, de https://web.expasy.org/protparam/