DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y

BIOQUÍMICA

MICROBIOLOGÍA GENERAL

M.C. MIGUEL ÁNGEL DÍAZ ALDAY

PRÁCTICA 2
TÉCNICAS DE TINCIÓN. TINCIÓN DE GRAM,
TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN, TINCIÓN SCHAEFFER
FULTON Y TINCIÓN NEGATIVA.

INTEGRANTES DEL EQUIPO #5

Camacho Miranda Emilia Estefanía 10320446

De los santos Irra José Alexis 11320087
Rendón Robles Gustavo German 10320482
Rivera Ramos Patricia Gabriela 10320453

FECHA DE REALIZACIÓN: 9 DE SEPTIEMBRE DE 2014

FECHA DE ENTREGA: 17 DE SEPTIEMBRE DE 2014

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 INDICE

Introducción…….……………………………………………………………….2-6

Objetivos general….…………………….…………………………………….…..6

Objetivos específicos……………………………………………………………...6

Equipo, material, reactivos y muestras………………………….………..……..7

Metodología………………………………………………………………….........8-9

Resultados…………………………………………………………………….…10-11

Discusión de resultados…………………………………………………………...12

Conclusiones………………………………………………………………………12

Bibliografía...………………………………………………………………………...12

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INTRODUCCIÓN

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan

difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la
falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio
más simple de aumentar el contraste entre la célula y el medio que la
rodea es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse también
para localizar estructuras específicas en la célula o para distinguir entre
tipos diferentes de células.

Para las bacterias la fijación por el calor es lo más corriente, aunque

también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehído,
ácidos y alcoholes. Después de la fijación se realiza habitualmente en
células que han sido secadas sobre un portaobjetos, tratando después
éste con el agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de
tinción. La fijación produce generalmente el encogimiento de las
células, la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan
mayores que lo que es realmente, de manera que las medidas de las
células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha
precisión.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen

alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos
colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los
ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes
catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros
colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se
combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente,
tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la
fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias
liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinan con los
materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la
localización de las gotas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante
liposoluble es el negro Sudán.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya

sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí
mismo. Esta sustancia se denomina mordiente. Un mordiente habitual es
el ácido tánico. El mordiente se combina con un constituyente celular y
lo altera de modo que ahora sí podrá atacar el colorante.

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Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la
microscopia son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul
de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las
células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso
que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar
la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor
parte del material no celular no se tiñe.

TINCIÓN DE GRAM

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes

en el laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante debe estar
perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible y en el
trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las
referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos,
negativos, etc) se basan justamente en la
tinción de GRAM.

Descripta en forma breve, la secuencia de la

tinción es la siguiente: el Frotis fijado con
calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava
con agua, se cubre con solución Yodada
durante 1 min y se lava de nuevo con agua,
decolorar con mezcla alcohol
etílico/acetona. Escurrir y cubrir con
Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar.

Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian

Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la
tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos,
grampositivas y gramnegativas (en este caso, los términos positivo y
negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente
designan dos grupos morfologicos distintos de bacterias).

Las bacterias gram-positivas y gram-

negativas tiñen de forma distinta debido a
las diferencias constitutivas en la estructura
de sus paredes celulares. La pared de la
célula bacteriana sirve para dar su tamaño
y forma al organismo así como para
prevenir la lisis osmótica. El material de la
pared celular bacteriana que confiere
rigidez es el peptidoglicano. La pared de la

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célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico.
Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es
peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado,
contiene una capa mucho más delgada, únicamente de
peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta
de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la
pared de la célula Gram-negativa es peptidoglicano.

TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos

grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono)
que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-
ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se
denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M.
tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como
Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol
resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere
calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que
contiene ceras.

Se ha desarrollado una coloración de

ácido-alcohol resistencia modificada
que diferencia las especies de
Nocardia (bacterias ramificadas
filamentosas cuyas paredes celulares
contienen ácidos-grasos de unos 50
átomos de carbono), de los
actinomiceos (muy semejantes pero no
ácido-alcohol resistentes). Nocardia spp
son decoloradas por la mezcla ácido-alcohol estándar pero no por un
tratamiento más suave con ácido sulfúrico 0,5 a 1%. Estos
microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes parciales o
débiles.

El frotis se tiñe durante unos 5 min con Carbol-fucsina aplicando calor

suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de
ClH concentrado. Lavar y teñir durante 30-60 seg con Azul de Metileno
(color de contraste). Lavar y secar.

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TINCIÓN DE SCHAEFFER Y FULTON

La esporulación no es un mecanismo de multiplicación en bacterias,

pues usualmente por cada célula se produce sólo una endospora. En
algunos casos excepcionales se puede producir más de una espora, por
ejemplo, Metanobacterium polyspora una arqueobacteria no cultivable
actualmente y Anaerobacter polyendosporus un bacilo Gram positivo
que puede presentar más de 7 endosporas por célula. Por otra parte, los
Actinomycetales, un grupo especial de bacterias, forman numerosas
exosporas como forma de multiplicación.

Las endosporas son formas de resistencia, altamente deshidratadas y

con una serie de cubiertas muy poco permeables, esto hace que sean
difíciles de teñir, excepto si se calienta la preparación para
permeabilizarlas; sin embargo, pueden evidenciarse en preparaciones a
fresco o con diversas tinciones, pues las esporas aparecen como
estructuras refrigerantes no coloreadas. Las esporas son producidas por
Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Sporolactobacillus y
Desulfotomaculum, géneros de bacterias Gram positivas; aunque
recientemente han sido descritas en algunas bacterias Gram negativas.

Las endosporas son más resistentes a

condiciones adversas, entre ellas calor,
radiaciones, desinfectantes y otras, que
las células vegetativas y las exosporas.
Se producen en condiciones
nutricionales que favorecen el proceso
de esporulación.

La endospora ocupa una posición

característica dentro de la célula,
puede ser terminal, subterminal o central. La localización y el tamaño de
la espora varía con la especie bacteriana y generalmente estas
características son de valor para su identificación. Conforme el
desarrollo de la espora se completa, la célula vegetativa se desintegra y
libera la espora.

Las endosporas bacterianas son muy resistentes a los procedimientos

tintoriales usuales. La aplicación de un solo colorante a una célula
bacteriana que contiene una endospora, sólo tiñe la célula, pero la
espora se mantiene incolora, para lograr introducir el colorante dentro
de la espora es necesario aplicar calor. La tinción de Schaeffer y Fulton
emplea verde de malaquita como colorante primario, el cual es

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eliminado posteriormente del resto de la célula bacteriana, pero no de
la espora, mediante un enjuague con agua. Como contratinción se
emplea safranina, la cual tiñe la célula vegetativa.

TINCIÓN NEGATIVA O TÍNTA CHINA

Tinción negativa es una técnica de microscopía que

permite contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los
fotones (microscopía óptica) o a los electrones (microscopía
electrónica). En el primer caso, se emplea nigrosina o tinta china; para
el caso de bacterias que esporulan, esta técnica permite visualizar las
esporas como entes refringentes sobre un campo de fondo oscuro.

En caso de microscopía electrónica de

transmisión, se emplean sustancias de
alto número atómico que, por tanto,
resultan opacas a los electrones
transmitidos. Típicamente, estas
sustancias son acetato de uranilo,
citrato de plomo o molibdato de
amonio. Al electrónico, esta técnica
permite visualizar virus, flagelos,
bacterias y otros entes de escaso
tamaño.

OBJETIVO GENERAL
 Comprender los pasos necesarios para la realización de diferentes
tipos de tinciones para identificar el tipo de microorganismo.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Diferenciar la estructura externa de las bacterias grampositivas y
gramnegativas.
 Realizar exitosamente las tinciones para la identificación correcta
de diferentes tipos de microorganismos que son dificultosamente
observables en el microscopio óptico.

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EQUIPO
 Microscopio óptico.

MATERIAL
 Asa
 Mechero de bunsen
 Portaobjetos
 Puente de tinción
 Pipetas Pasteur

REACTIVOS
 Solución salina
 Cristal violeta
 Lugol
 Alcohol-acetona
 Safranina
 Aceite de inmersión
 Carbol Fucsina
 Alcohol-ácido
 Azúl de metileno
 Verde de malaquita

MUESTRAS
 Esmegma
 Exudado faríngeo
 Tierra de jardín
 Excremento de caballo
 Esputo

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METODOLOGÍA
Se esterilizan el área de trabajo, se prenden los mecheros, y se esterilizan
los portaobjetos.

Preparación de frotis: Se colocan 4 gotas en el portaobjetos de mayor a

menor tamaño evitando que se junten y se hagan una sola.

TINCIÓN DE GRAM (EXUDADO FARÍNGEO)

1. Con el asa esterilizada te toma una alícuota de la colonia en agar

de exudado faríngeo. Se mezcla en la gota de mayor tamaño, se
esteriliza el aza se enfría en la segunda gota, se toma muestra de
la primera y se mezcla con la segunda, se esteriliza, y se repite el
mismo paso hasta la gota de menor tamaño.
2. Se fija el frotis con calor flameándola en el mechero.
3. Colocar el portaobjetos en el puente de tinción, se cubre el frotis
con cristal violeta por diez segundos.
4. Se lava con agua de la llave.
5. Se cubre con lugol por 10 segundos.
6. Agregar alcohol-acetona hasta que se decolore y se lava con
agua corriente.
7. Cubrir el frotis con safranina durante 10 segundos.
8. Se lava con agua de la llave y se deja secar.
9. Se le adiciona una gota de aceite de inmersión y observa en el
microscopio con el objetivo de 100x.

•TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN (ESPUTO)

1. Con el asa esterilizada te toma una muestra de esputo. Se mezcla

en la gota de mayor tamaño, se esteriliza el aza se enfría en la
segunda gota, se toma muestra de la primera y se mezcla con la
segunda, se esteriliza, y se repite el mismo paso hasta la gota de
menor tamaño.
2. Se fija el frotis con calor flameándola en el mechero.
3. Cubrir el frotis con carbol fucsina hasta emisión de vapores por
cinco a siete minutos.
4. Se lava con agua de la llave.
5. Se agrega alcohol-ácido hasta decolorar.
6. Anegar la preparación con azul de metileno durante 1 minutos.

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 7. Lavar con agua de la llave y dejar secar.
8. Se le adiciona una gota de aceite de inmersión y observa en el
microscopio con el objetivo de 100x.

•TINCIÓN DE SCHAEFFER Y FULTON (EXCREMENTO DE CABALLO Y TIERRA)

1. Con el asa esterilizada te toma una alícuota de excremento

de caballo o tierra. Se mezcla en la gota de mayor tamaño, se
esteriliza el aza se enfría en la segunda gota, se toma muestra
de la primera y se mezcla con la segunda, se esteriliza, y se
repite el mismo paso hasta la gota de menor tamaño.
2. Se fija el frotis con calor flameándola en el mechero.
3. Cubrir la preparación con verde de malaquita, calentar hasta
emisión de vapores durante 1 minuto.
4. Lavar con agua de la llave.
5. Cubrir la preparación con el colorante de contraste Safranina
y dejar actuar durante 30 minutos.
6. Lavar con agua de la llave y dejar secar.
7. Se le adiciona una gota de aceite de inmersión y observa en el
microscopio con el objetivo de 100x.

TINCIÓN NEGATIVA O TINTA CHINA (ESMEGMA)

1. Lave y flamee el portaobjetos y colóquelo en el puente de

lavado de la tinta.
2. Cliente el asa para eliminar cualquier contaminante.
3. Coloque una gota de tinta china en el centro del portaobjetos.
4. Seleccione una colonia y obtenga una muestra pequeña.
5. Colóquela en el portaobjetos, disolviéndola en la gota de tinta
china.
6. Disuelva y disperse uniformemente en la superficie del
portaobjetos para obtener una capa muy delgada.
7. Deje secar muy bien.
8. Cubra con azul de metileno por un minuto.
9. Enjuague por un segundo y escurra. Deje secar y observe al
microscopio con aceite de inmersión.

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RESULTADOS
TINCIÓN DE GRAM (MUESTRA DE EXUDADO FARÍNGEO)

Se logró observar bacterias de Gram positivas en forma circular, de

color morado, quiere decir que poseen varias capas gruesas
interconectadas de peptidoglicano.

TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN (ESPUTO)

Se pudo observar unos microorganismos en forma de cadena, así como

otras en racimos sin distribución y con una coloración rojiza por lo tanto
son resistentes y la coloración arrojando un dato positivo.

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TINCIÓN DE SCHAEFFER Y FULTON (EXCREMENTO DE CABALLO Y TIERRA DE
JARDÍN)

Se logró observar esporas en forma circular un poco juntas sin

distribución y con un color verdoso.

Excremento Tierra de jardín

En esta tinción se puede observar esporas en forma fibrosas.

TINCIÓN NEGATIVA O TINTA CHINA (ESMEGMA)

En ésta muestra de esmegma se toma como positiva debido a que se

encontraron organismos encapsulados ya que solo se tiñe en la parte
exterior de las células.

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DISCUSIÓN
A la hora de realizar la práctica pudimos observar en la tinción de
Schaeffer y Fulton en el excremento de caballo como se veían algunos
bacilos, en la tinción de Ziehl Neelsen en el esputo observamos
bacterias en forma de cadena y racimos de una coloración rojiza por lo
tanto son resistentes a la coloración arrojando un dato positivo.

Logramos distinguir las bacterias Gram- positivas y de una forma circular

de una capa gruesa de peptidoglicano.

Al colocar la solución salina en el portaobjetos, la colocamos con una

hipodérmica, y así podíamos colocar mejor los diferentes tamaños de
gotas en él.

La técnica de tinción tiene como objetivo crear un contraste entre la

célula y el medio en el que esta, el estudio de estos diferentes tipos de
técnicas nos ayuda a tener un preámbulo para poder diferenciar frente
al microscopio los diferentes tipos de microorganismo.

CONCLUCIÓN
La técnica de tinción tiene como objetivo crear un contraste entre la
célula y el medio en el que esta, el estudio de estos diferentes tipos de
técnicas nos ayuda a tener un preámbulo para poder diferenciar frente
al microscopio los diferentes tipos de microorganismo.

BIBLIOGRAFÍA
 Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual
de Métodos Generales (segunda edición). Facultad de Farmacia.
Universidad Central de Venezuela.
 Seely. H; Van Demark, P. 1962. Microbios en acción. Manual de
Laboratorio para
 Microbiología. Editorial Blume. Madrid-España.
 http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.ht
 http://www.danival.org/notasmicro/tincion/_madre_tincion.html
 Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio.
Evelyn Rodríguez Cavallini.

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