ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS

FUNDAMENTO

La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y

caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan
como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su
tamaño y forma. Asi,́ moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de
forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha
electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de
tamaño conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio.
En esta práctica, se pretende que el alumno comprenda el fundamento teórico de
esta técnica y sus aplicaciones, llevando a cabo la separación electroforética en
gel de agarosa de DNA plasmid ́ ico que el mismo alumno va a aislar y purificar a
partir de un cultivo bacteriano. Se han desarrollado un gran número de métodos
para la purificación de DNA plasmid ́ ico de bacterias y todos ellos implican
invariablemente tres pasos: crecimiento de la estirpe bacteriana portadora,
recogida y lisis de las bacterias y purificación del DNA plasmid
́ ico. A continución,
el DNA aislado se puede analizar mediante electroforesis en gel de agarosa.

TÉCNICA Y PROCESO

La electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar moléculas o

fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos. Los materiales más comunes para
separar moléculas de ácidos nucleicos son polim
́ eros como la poliacrilamida o la
agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un
tampón de pH alrededor de 8. De esta forma, las moléculas de DNA o RNA
sometidas a electroforesis se desplazarán al polo positivo ya que a pH superiores
a 5 poseen carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y
permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Asi,́
moléculas de DNA de diferente tamaño, van a emigrar de forma distinta en un gel
de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser
inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la
utilización de marcadores de tamaño conocido porque nos permitirán calcular los
pesos moleculares de las muestras de DNA problema.

Se quita la cinta adhesiva con la que se ha sellado el soporte del gel y se coloca
en la cubeta de electroforesis. ¡¡OJO!!: Los pocillos deben de estar cerca del
cátodo (polo negativo, color negro).

 Se añade tampón de electroforesis TBE, de forma que cubra bien el gel de

agarosa.
 Se aplican 10 μl de la muestra preparada en el apartado anterior en dos de
los pocillos.
 Se aplican 10 μl de marcadores de peso molecular en dos de los pocillos.
  Se tapa la cubeta de electroforesis y se conectan los electrodos a la fuente
de alimentación. Se comprueba que está bien conectada.
 Se programa la fuente a unos 100 voltios y se comienza a correr la
electroforesis que durará unos 30-45 minutos.
 Una vez acabada la electroforesis se visualizan los fragmentos de DNA
́ de la imagen.
mediante luz UV y se realiza una fotografia

APLICACIONES
Como se ha indicado, se puede obtener una estimación de la masa molecular (en
kDa) de proteínas empleando SDS-PAGE, y de fragmentos de DNA (en pb)
empleando electroforesis en agarosa. En ambos casos, en uno de los pocillos del
gel se carga una mezcla de moléculas patrón de tamaño conocido, con el fin de
poder trazar la curva de calibrado. Para las proteínas, la validez del dato obtenido
depende de que la desnaturalización con SDS haya sido completa y de que se
hayan separado las subunidades gracias a la reducción con mercaptoetanol;
además, la presencia de oligosacáridos en las glicoproteínas altera la movilidad,
que ya no proporciona valores de masa molecular fiables.

Ejemplo 1:
Se aplica en uno de los pocillos del gel una mezcla de fragmentos de DNA de
tamaño conocido, denominados “patrones”, “marcadores de masa molecular” o
“escalera de DNA” (DNA ladder). Tras su separación en la electroforesis, se
revelan y se representa para todas las bandas la movilidad (distancia avanzada o,
mejor, cociente entre ésta y el avance del frente de electroforesis) frente al
logaritmo del tamaño (longitud en pb). Sobre la línea de regresión se interpolan las
distancias de avance de las muestras problema, calculando así su tamaño en pb.
En este ejemplo, los patrones empleados son fragmentos bien conocidos, aquellos
obtenidos a partir del DNA del virus λ por la acción de las endonucleasas de
restricción Eco RI e Hin dIII.

Ejemplo 2:
Se aplica en uno de los pocillos de un gel SDS-PAGE una mezcla de proteínas de
una sola subunidad, de tamaño conocido, denominadas “patrones” o “marcadores
de masa molecular”. Tras su separación en la electroforesis, se revelan y se
representa para todas las bandas la movilidad (distancia avanzada o, mejor,
cociente entre ésta y el avance del frente de electroforesis) frente al logaritmo del
tamaño (masa molecular relativa, Mr). Sobre la línea de regresión se interpolan las
distancias de avance de las muestras problema, calculando así su masa molecular
aparente.
RESTRICCIONES DE ENZIMAS
Las enzimas de restricción son una herramienta primordial para la ejecución de
diversos ensayos útiles en investigación clínica, desde la determinación de
polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (restriction fragment length
polymorphism, RFLP), así como en la construcción de vectores con ADN
recombinante y clonación de secuencias de ADN provenientes de humano, virus,
bacterias y demás microorganismos de interés para la generación de conocimiento
o para su aplicación en el área de la medicina. Entre las enzimas que modifican
los ácidos nucleicos se encuentran las nucleasas, es decir, aquellas capaces de
cortar los enlaces fosfodiéster que unen los nucleótidos de una cadena de ácidos
nucleicos. Las nucleasas se denominan endonucleasas si son capaces de cortar
el enlace fosfodiéster en nucleótidos localizados dentro de la cadena del ácido
nucleico, y reciben el nombre de exonucleasas si cortan los enlaces fosfodiéster
de los nucleótidos en los extremos de las cadenas. Así, existen 3’exonucleasas las
que escinden enlaces en el extremo 3’ de la cadena, y 5’exonucleasas que
rompen enlaces fosfodiéster en el extremo 5’ de la cadena.
Las enzimas de restricción presentan actividad endonucleasa, son de origen
bacteriano y cortan los enlaces fosfodiéster del ADN en una secuencia específica
denominada secuencia diana. El uso de estas enzimas como herramienta
biotecnológica surgió de la necesidad de cortar las largas cadenas de ADN
genómico para manipularse y analizarse en fragmentos más pequeños. El empleo
de las enzimas de restricción y otras enzimas que modifican ácidos nucleicos,
como la ligasa, permitió desarrollar la metodología del ADN recombinante.

TECNICAS Y APLICACION

 La secuencia que reconocen es una secuencia palindrómica

(secuencia que se lee igual en ambas direcciones).

 Son extraid́ as de bacterias, donde actuan como mecanismo de defensa

para degradar material genético extraño que entre en la célula.
 Las enzimas de restricción, como las que se van a usar en este laboratorio -
HindIII y EcoRI, toman el nombre de las bacterias que la producen:

• EcoRI: E = género Escherichia. co = especie coli

R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Las enzimas de restricción al cortar ADN pueden producir dos tipos de cortes:

• Cohesivos o pegajosos: cortan a manera escalonada en dos puntos diferentes.

• Abruptos: cortan en un sólo punto.

APLICACIONES

LINKS
https://www.studocu.com/sv/document/instituto-politecnico-
nacional/laboratorio-de-biotecnologia-
molecular/foerelaesningsanteckningar/enzimas-de-restriccion/1713260/view

http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/pacopp/8-APLICACIONES_PCR.pdf

https://accessmedicina.mhmedical.com/Content.aspx?bookid=1473&sectioni
d=102743841

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/UNIDAD_9_4X_23622.pdf

https://www.u-
cursos.cl/faciqyf/2010/2/FBQI4210/1/material_docente/bajar?id_material=5662
77

http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm

https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1473&sectioni
d=102743771

https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-
sequencing-pcr-electrophoresis/a/gel-electrophoresis