Informe 1: Extracción del ADN y visualización del ADN

Laura Daniela Agualimpia Calvache1, María José Castillo Silva2

Laboratorio de Bioquímica

Química Farmacéutica1,2

Facultad de Ciencias Naturales1,2

Universidad ICESI

Santiago de cali, 27 de agosto del 2019

OBJETIVOS

GENERALES

1. Extraer la mayor cantidad posible del ADN proveniente de la mucosa bucal de

un estudiante, haciendo uso de una metodología correcta.

2. Cuantificar y visualizar la extracción de ADN obtenida con anterioridad.

ESPECÍFICOS

1. Identificar el botón de ADN aislado por el uso de sustancias adecuadas para

realizar una buena extracción.

2. Homogeneizar en lo máximo el ADN con el buffer TE para hacer posible su

cuantificación.

3. Hacer uso preciso del instrumento designado para inyectar el ADN disuelto en el
pozo de la cámara con gel agarosa.
 RESULTADOS

Tabla 1. Resultados de la absorción de luz UV del ADN en el espectrofotómetro de

acuerdo a los dos tipos de longitud de onda.

Factor de Densidad óptica (D.O) a 260 Densidad óptica (D.O) a 280

dilución nm nm

1:100 0.052 A 0.057 A

1:10 0.162 A 0.157 A

- Concentración de la muestra de ADN usando el valor de D.O a 260 nm para el

factor de dilución 1:100.

[ADN]= 50𝜇𝑔. 𝑚𝐿−1 𝑥𝐷. 𝑂260 𝑛𝑚 𝑥𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 (1)

1
[ADN]= 50𝜇𝑔. 𝑚𝐿−1 𝑥0.052𝑥 100 = 0.026𝜇𝑔. 𝑚𝐿−1

-Concentración de la muestra de ADN con el factor de dilución 1:10.

Haciendo uso de la ecuación (1)

1
[ADN]= 50𝜇𝑔. 𝑚𝐿−1 𝑥0.162𝑥 10 = 0.81𝜇𝑔. 𝑚𝐿−1

-Relación 260/280 con el D.O del factor de dilución 1:100.

𝐷.𝑂260 𝑛𝑚
(2)
𝐷.𝑂280 𝑛𝑚

0.052
= 0.91
0.057

-Relación 260/280 con el D.O del factor de dilución 1:10.

Haciendo uso de la ecuación (2)

0.162
= 1.06
0.153

Imagen 1. En esta imagen se puede observar el desplazamiento que tuvo la

molécula de ADN (segundo pozo de abajo hacia arriba) por la separación de sus
componentes en el gel de agarosa. No se pudo visualizar un rastro definido, debido
a el daño en el pozo en el que se encuentra.

DISCUSIONES

Esta práctica se inició depositando 2.5 mL de una muestra de saliva en una probeta,
la cual fue traspasada a un tubo falcón y agitada mediante el método de inversión
de manera conjunta con 2.5 mL de solución SDS (sodio dedecil sulfato) al 10%, este
actúa como detergente anicónico que desnaturaliza las proteínas, membranas y
tejidos (Mosquera, 2005); además, elimina sus estructuras secundarias y terciarias
evitando así que una valiosa cantidad de ADN quede apresada en los restos
celulares y/o desechos. Después, se le agregó a la mezcla anterior 50 μL de NaCl
5 M para evitar la unión de las proteínas al ADN gracias a su poder icónico en la
solución; asimismo, la alta concentración utilizada (5M) se utiliza para prevenir la
contaminación en la muestra con polisacáridos que afectan de manera directa la
pureza del ADN, siendo capaz de abstener la actividad de ciertas enzimas como
ligasas, polimerasas, y endonucleasas de restricción, pues los cimientos para la
separación de los polisacáridos precipitan bajo la acción de fuerzas centrífugas
(Alejos, L; Aragon, M & Romero, A; s.f). De manera seguida, se añaden 10 mL de
etanol al 96% a 20Cque cumplirá la función de ayudar a separar el ADN de distintos
componentes celulares, puesto que al no mezclarse con el ADN lo precipita, dando
paso a la observación del llamado botón de ADN. Dicho botón, es retirado del tubo
falcon con la ayuda de una punta doblada de micro pipeta la cual hace más fácil su
transferencia al eppendorf.

La segunda parte del laboratorio consistió en cuantificar la muestra extraída, este

procedimiento sirve para conocer la pureza de la muestra y la concentración que se
logró extraer de ella. Para esto, primero se secó el botón de ADN a 55°C durante 2
minutos para evaporar los restos de etanol que contuviera. segundo, se añadió 1
mL de buffer TE para hidratar el botón y mantenerlo en solución. Esta disolución se
debía homogenizar completamente en el agitador vortex para continuar con el
proceso de cuantificación; sin embargo, esta muestra no logró mezclarse
absolutamente, así que se utilizó una micropipeta para expulsar y absorber el
contenido varias veces y mejorar un poco más la homogeneización. Después, se
realizó una dilución de 1:100 que contenía 10Lde la muestra con buffer TE y 990Lde
buffer TE, y otra dilución de 1:10 que contenía 100Lde la muestra con buffer TE y
900Lde buffer TE. Ambas diluciones fueron introducidas en el espectrofotómetro, el
cual les radia UV a unas longitudes de onda de 260 nm y 280 nm para identificar
qué cantidad de luz puede absorber el ADN, es decir, su densidad óptica (D.O) que
es gracias a la presencia de electrones deslocalizados en los anillos aromáticos de
las bases nitrogenadas a lo largo de sus cadenas (Academia, s.f). Los valores
obtenidos de este procedimiento están registrados en la Tabla 1 y se utilizaron para
calcular la concentración de ADN en nuestra muestra para los dos casos de
diluciones, aquí podemos observar que los resultados concuerdan con la cantidad
de muestra que se adiciono en cada caso. Es importante conocer la concentración
de lo que se fue capaz de extraer para investigaciones que necesitan saber lo que
realmente tienen de ADN. Por último, se realizó una relación entre el D.O a 260 nm
con el D.O a 280 nm, tanto en la disolución 1:100 como en la disolución 1:10,
obteniendo como resultados 0.91 y 1.06 respectivamente. Esta relación nos indica
que nuestra muestra no fue lo suficientemente pura porque tenemos valores
inferiores a 1.6, por lo tanto, nuestros resultados de las concentraciones no son las
adecuadas (Universidad Nacional de Quilmes, S.f). Esto se debe a que nuestro
método para la extracción del ADN no fue lo suficientemente eficiente, ya sea por el
tiempo que se invirtió en el secado del etanol o la insuficiencia de homogeneización
de la muestra con el buffer TE.

La última parte del laboratorio se basó en poder realizar la electroforesis del ADN
en el gel agarosa. El cual es un método muy utilizado para separar franjas de ADN
por su carga y tamaño. Dicha técnica se basa en aplicar una corriente eléctrica por
medio de un gel que posee varias moléculas de interés. Teniendo en cuenta su
carga y tamaño, las moléculas se desplazan por el gel a distintas velocidades y
direcciones, con lo que se dividen unas de otras. Los geles utilizados para este
proceso, comúnmente se encuentran hechas por un polisacárido llamado agarosa,
el cual suele encontrarse en forma de ´´hojuelas secas´´ pulverizadas. Uno de los
elementos más importantes al momento de realizar la electroforesis es el buffer de
carga. Dichas sustancias son aquellas que facilitan la sedimentación y visualización
del producto proporcionado por el PCR o ácidos nucleicos en los pozos, en el cual
se emplean los distintos tipos de colorantes, y cada uno de ellos proporciona un
patrón de migración distintas. En este caso se hizo uso del TBE 1 X (Tris-Borato
EDTA) el cual es una sustancia con una gran capacidad amortiguadora y
discriminatoria en gel agarosa al 2%. Lo que significa, que mientras las geles
agarosas con una gran concentración (2% a 3%) ponen una gran resistencia a la
circulación de los ácidos nucleicos de modo que permiten lograr una mayor
resolución y por ende una observación más nítida, las geles agarosas con una
concentración baja (0.5 % a 1%) no posee la suficiente fuerza para lograr detener
de manera constante los ácidos nucleicos, ocasionando que el espectro a observar
después del recorrido del ADN sea muy opaco (Preparación de Geles de Agarosa
para Electroforesis, 2008).

La función del TBE sobre la electroforesis es hacer el papel de tampón durante la

separación del ADN, permitiendo separar ácidos nucleicos por su peso y su gran
afinidad con los compuestos (Checa, 2018); de tal forma que, si no se hiciera uso
de los buffers de carga durante la electroforesis, la visualización del recorrido
realizado por el ADN en el gel sería muy complicado, debido a que la apreciación
de dicho desplazamiento se basaría en suposiciones personales apelando a la baja
calidad de la franja de ADN a observar. En el momento en que el gel agarosa es
calentada en el buffer y se deja enfriar, se forma un gel blando. En un extremo, el
gel posee unos pozos en donde se colocan las muestras de ADN que anteriormente
han sido mezcladas con 3 μL de buffer de carga 5X que cumple la función de
conducir corriente y controlar de manera directa el pH (Fierro, s.f). En esta práctica,
el gel se agregó a una cámara donde uno de los extremos se conecta a un electrodo
positivo y el otro extremo a un electrodo negativo.

Al observar la cámara por primera vez se podía apreciar que se encontraba rodeada
completamente con el buffer. En el momento en que el gel se encuentra en la
cámara, la muestra se transfirió de manera moderada. Posteriormente, se aplica
energía durante 30 minutos a la cámara y automáticamente dicha energía comienza
a correr por medio del gel. Mientras ocurre este desplazamiento, lo que sucede es
que ´´los grupos fosfato de su esqueleto de azúcares-fosfato otorgan una carga
negativa a las moléculas de ADN, por lo que comienzan a moverse a través de la
matriz de gel hacia el polo positivo´´ (Electroforesis en gel, 2019). Al momento de
apreciar que las franjas de ADN se han separado, se puede analizar el gel y
reconocer el tamaño de caja franja. Finalmente, cuando el gel se encuentra teñido
con un pigmento que para este caso es el SYBR Green, que cumple la función de
teñir ADN en geles de agarosa. Concretamente lo que lleva a cabo es que se une
al ADN de doble cadena, y mientras ocurre la PCR, el ADN polimerasa amplifica la
secuencia diana que crean los productos proporcionados por el PCR y así, el SYBR
Green se une a cada copia nueva de ADN, lo que da como resultado un gran
aumento en la intensidad de fluorescencia (Electroforesis en gel, 2019); permitiendo
observar todo el ADN que se encuentra en todos los lugares por todo el gel.
Después de este proceso, lo que se analiza es el verdadero recorrido del ADN
comparando cada franja con el marcador de peso molecular, determinando así su
verdadero tamaño. Al registrar y analizar cada dato obtenido, se pudo concluir cómo
afectaron nuestros resultados algunos errores como el haber tocado de manera
profunda el gel agarosa en el proceso de la electroforesis afectando así el recorrido
de nuestro ADN y el conjunto común de errores de observación y/o medición.

CONCLUSIÓN

En esta práctica se puede concluir que la muestra extraída de ADN no se

encontraba pura. Esto se dedujo, gracias a la relación de los resultados D.O
260nm/280nm obtenidos en su cuantificación. Su impureza fue a causa de un
incorrecto secado del botón de ADN y una incompleta homogenización de esta
muestra con el buffer TE. En la parte de la visualización del ADN en el gel agarosa
no se pudo observar un definido desplazamiento de la separación de sus moléculas,
debido a su impureza y al uso incorrecto de la micropipeta en el momento de
depositar la muestra en el pozo del gel.
 REFERENCIAS

Academia. (s.f). Recuperado de

https://www.academia.edu/10297690/Los_%C3%A1cidos_nucleicos_son_los_component
es_fundamentales_de_la_c%C3%A9lula_viva._Estos

Fierro, F. F. (s.f). Recuperado de

https://micrositios.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/electroforesis.pdf

Khan Academy. (s.f). Recuperado de https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-

technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/gel-electrophoresis

L Alejos, L; Aragon, M & Romero, A (s.f). Recuperado de

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf

MOSQUERA, R. V. (2005, Febrero 10). Recuperado de

file:///C:/Users/Usuario/Downloads/Dialnet-
MarcadoresMolecularesYLaExtraccionDeADN-6117966.pdf
Rojas, A. C. (2018, Abril 22). Conogasi. Recuperado de
http://conogasi.org/articulos/metodo-gel-de-electroforesis-agarosa/
Standard Operating Procedures. (2008, Noviembre 11). Recuperado de
http://www.genomica.uaslp.mx/Protocolos/Mol_GelAgarosa.pdf
Universidad Nacional de Quilmes. (n.d.). Retrieved from
https://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp5.pdf