Manual de Estudo Dirigido em Biotecnologia Molecular- Prof ª Msc Cristiane Alves da Fonseca

PRINCIPAIS TECNOLOGIAS E SUAS APLICAÇÕES

Tecnologia de anticorpos monoclonais (AM)

- Produzidos há mais de 4 décadas.
- A biotecnologia possibilitou sua produção em ↑ qtdades e custo mais baixo.
instrumentos de detecção, quantificação e localização (diagnóstico e
terapêutica)
medidas rápidas, precisas e extremamente sensíveis.

Tipos de Anticorpos Monoclonais:

- Murinos;
- Quiméricos;
- Humanizados;
- 100% humanos.

*São, geralmente, das subclasses IgG ou IgM e podem ser utilizados isoladamente (não
conjugados) ou em combinação (conjugados) com outros agentes terapêuticos.

*Principais utilidades:
- Testes de gravidez
- Diagnóstico de várias doenças infecciosas
- Detecção e acompanhamento da evolução do câncer
- Transporte de agentes antitumorais
- Neutralização de venenos (cobras, escorpiões etc).

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Exemplo:
* Avastin® é o nome comercial para bevacizumabe, um anticorpo monoclonal
humanizado recombinante que reduz a vascularização de tumores, inibindo assim o
crescimento tumoral.

*Herceptin® nome comercial para Trastuzumabe é considerado uma das drogas mais
avançadas na terapia contra o câncer de mama.

Tecnologia de Bioprocessamento

utiliza células vivas (microorganismos unicelulares, células de mamíferos, bactérias

e leveduras) ou componentes de sua maquinaria bioquímica para sintetizar produtos,
degradar substâncias e produzir energia.

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Os componentes celulares mais utilizados são as enzimas.

È muito empregada na produção de produtos químicos para gerar energia e degradar

compostos poluentes.

- Fermentação microbiana processo de obtenção de energia utilizado por

algumas bactérias e outros organismos. Ocorre com a quebra da glicose (ou outros
substratos como o amido) em piruvato, que depois é transformado em algum outro
produto, como o álcool etílico e lactato, definindo fermentação alcoólica e láctica (a
fermentação também pode ser butírica, oxálica, acética, etc.)

- Ex: antibióticos, aminoácidos, hormônios, vitaminas, solventes industriais, pesticidas,

pigmentos, fármacos etc.

☻Biodegradação microorganismos e enzimas utilizadas para degradação de

moléculas orgânicas e que estão ajudando a resolver problemas ambientais como:
derramamento de óleo, locais com lixo tóxico e vazamentos de tanques subterrâneos.

- A utilização de populações de microorganismos para combater a poluição é

conhecida como biorremediação.

- O processo de biorremediação se dá pelo fato de microrganismos, como as

bactérias, utilizarem substratos orgânicos e inorgânicos (ex: carbono como fonte de
alimentação). Desta forma, convertendo os contaminantes em CO 2 (dióxido de
carbono) e H2O (água).

- Vantagens:
- Por ser um processo natural promove um tratamento adequado ao meio,
- seu custo é relativamente baixo quando comparado à outras alternativas
convencionais de tratamento de resíduos sólidos.

*Para se obter elevado rendimento no processo, é necessário se determinar quais são

as condições que favorecem a atividade microbiana, como por exemplo: meio anóxico,
teor de nutrientes elevado, tempo de retenção, atividade enzimática, temperatura, pH, e
inóculo aclimatado ao meio tóxico, sendo assim capaz de tratá-lo adequadamente.

☻Fitorremediação utilização de determinadas plantas para remover, destruir ou

absorver contaminantes (veremos em biotecnologia ambiental).

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Tecnologia de cultura de células

- consiste no crescimento de células com nutrientes apropriados em erlenmeyers ou

em grandes biorreatores.

-Biorreatores → equipamentos para cultivo sob imersão temporária ou permanente

de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado
na micropropagação.
*utilizam meio de cultura líquido, permitem a renovação do ar durante o cultivo, bem
como o monitoramento de alguns parâmetros essenciais ao crescimento do
propágulo (pH, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de íons, etc.)

*Biorreator vegetal: utilizado na multiplicação de mudas de plantas, principalmente

nas fases de indução de multibrotação e alongamento.
-É constituído de frascos de cultivo e de controles necessários ao seu
funcionamento automático, podendo utilizar diferentes tipos de frascos, que variam
em tamanho, formato, constituição, tipo de tampa, transparência, etc.

*Biorreator animal: animais transgênicos biorreatores, que são aqueles que

produzem alguma proteína de origem animal, vegetal ou bacteriana nas secreções,
tais como leite, urina e saliva.

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1. Cultura de células vegetais (Micropropagação)

- Aspecto essencial na biotecnologia vegetal graças à propriedade única das

células vegetais de totipotência (capacidade de gerar planta multicelular completa
a partir de uma única célula diferenciada).
- Uma única célula geneticamente modificada (Ex: aumentar a resistência a pestes
causadas por insetos) pode ser cultivada e originar uma planta com características
melhoradas.
Explantes
Meristemáticos ou
maduros

Desinfecção
ou desinfestação

Meios de cultura
(vit.+fitohormônios+
Agar)

1 - Tecido Diferenciado 2 - Massa de Células ou Calo 3 - Órgão, Tecido, Organismo

PONTOS FORTES:
- Reduz custo no processo produtivo;
- Simplicidade de montagem, operação e manutenção dos equipamentos;
- Versatilidade para uso com inúmeras espécies vegetais;
- Garantia de produção uniforme (clones), isenção de patógenos;
- Aumenta a taxa de crescimento;
- Ambiente de cultivo in vitro otimizado.

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2- Cultura de célula animal

- Visa estudar eficiência e segurança de certos compostos farmacêuticos,
mecanismo molecular da infecção e replicação viral, toxicidade de compostos e
bioquímica básica da célula.
Tipos de cultura celular:

√ cultura primária→ preparada diretamente de tecidos de um organismo, com ou

sem um passo inicial de fracionamento de células.
√ cultura secundária → as células da cultura primária são retiradas da placa e
usadas para a cultura secundária. Podem assim ser repetidamente subcultivadas,
por semanas ou meses.

-
3- Cultura de células – tronco embrionárias (podem originar qualquer tipo de
célula)

Célula tronco totipotente ou embrionárias (embrião 16-32 células) -216 tecidos + placenta
e anexos embrionários

Célula tronco pluripotente ( 32 a 64 células) – quase todos os tecidos exceto placenta e

anexos embrionários

Oligopotentes (diferenciam-se em poucos tecidos

Unipotentes (diferenciadas) pele, ossos, sangue, músculos etc

* uma vez diferenciadas todas as células filhas são diferenciadas

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Tecnologia de engenharia de tecidos

união entre biologia celular e ciência dos materiais, permite produzir tecidos
semi-sintéticos no laboratório. Estes tecidos são formados de uma estrutura de
material biodegradável e células vivas.

Método básico: utilização de materiais biológicos naturais, como colágeno para

dar estrutura ao tecido. Ex.: tecido com 2 camadas é feito infiltrando-se fibroblastos
em um gel de colágeno. Os fibroblastos crescem e se multiplicam, formando a
derme; então, uma camada de queratinócitos é adicionada para servir como
epiderme.

-Pele e cartilagens: primeiros tecidos sintetizados com sucesso

-Perspectiva: criar órgãos mais complexos.

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Tecnologia de biossensores

→dispositivos capazes de fornecer informações analíticas específicas quantitativas ou

semi-quantitativas através do uso de um elemento de reconhecimento biológico em
contato direto com um sistema transdutor.

→São instrumentos seletivos, versáteis e relativamente econômicos que fornecem

informação em tempo real, sendo crucial no controle de bioprocessos com ampla
aplicação na indústria de alimentos, na saúde, na área petroquímica e no controle do
meio ambiente.

→Permitem detectar e medir substâncias que ocorrem em concentrações extremamente

pequenas.

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Tecnologia de engenharia genética ou do DNA recombinante (rDNA)

- Engenharia Genética é o termo usado para descrever algumas técnicas modernas em

biologia molecular que vêm revolucionado o antigo processo da biotecnologia.
*O rDNA é feito pela ligação ou recombinação de material genético de 2 origens
diferentes.

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-envolve a manipulação dos genes e a consequente criação de inúmeras combinações

entre genes de organismos diferentes.

-Produtos que primariamente eram obtidos em pequenas quantidades originados de

animais plantas, hoje podem ser produzidos em grande escala através desses organismos
recombinantes.

Exemplos da utilização da engenharia genética podem ser dados na produção de :

o Melhora da qualidade das vacinas contra as doenças;

o Produtos humanos puros e em quantidades comerciais como a insulina e o hormônio
de crescimento;
o Produção de antibióticos por meios mais econômicos ou outrora não existentes;
o Plantas mais resitentes a pesticidas, doenças e a insetos;
o Plantas com melhora em sua qualidade nutricional, plantas transgênicas etc

Cruzamento seletivo x Engenharia Genética semelhantes, mas muito

diferentes!

Tabela - Diferenças entre cruzamento seletivo e engenharia genética

Cruzamento Engenharia genética
PARÂMETROS Seletivo
Nível Todo organismo. Célula ou molécula.
Precisão Conjunto de genes. Um único gene.
Certeza Mudança genética Gene bem caracterizado.
fracamente caracterizada.
limitação Possível apenas dentro ou Sem limitação
taxonômica entre espécies, algumas
vezes entre gêneros.

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Com que extensão a seleção imposta pelo homem (artificial) alterou as

características genéticas dos organismos?

Teosinte (ancestral do milho) X milho “moderno”

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Tecnologia da engenharia de proteínas

usada em conjunto com a engenharia genética para a melhoria das proteínas
já existentes e para criar novas proteínas não encontradas na natureza.

→ Pesquisas estão direcionadas para modificação das proteínas existentes.

-Engenharia de enzimas enzimas mais estáveis sob condições industriais

drásticas, aumento da especificidade pelo substrato e melhoria do poder
catalítico.

-Engenharia de Abenzimas anticorpos com habilidades catalíticas.

Desenvolvidos para catalisar reações que não possuem enzimas conhecidas.

Ex.: Anticorpos com função de proteases (degradam proteínas).

Tecnologia do anti-senso

usada para bloquear ou diminuir a produção de certas proteínas utilizando

oligonucleotídeos que evitam a tradução da informação contida no DNA, em
proteína.
-Utilidade: qualquer situação onde o bloqueio do gene seja benéfico.
-Ex.: controle de doenças virais, inibição de respostas inflamatórias, tratamento da asma,
câncer e talassemia.
-Engenharia Metabólica bloqueio de enzimas de certas vias metabólicas.

☻ Observar nos anexos atividade e trabalho relacionado a este assunto.

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Tecnologia do chip de DNA (Microarrays)

união da indústria de semicondutores e biologia molecular, permitindo que dezenas de
milhares de genes sejam analisados em um único microchip (sondas de DNA em uma
lâmina de vidro).

Técnica: DNA é removido das células→ ligação a marcadores Fluorescentes→ Chip →

Sequências hibridizadas → leitor a laser, computador e microscópio alta potência.

O uso de microarrays permite conhecer que genes (mRNA) são usados (e com que
intensidade) em uma infinidade de situações.

Principais utilizações dos Microarrays:

-Análise da expressão gênica dos genes do genoma em larga escala
–Expressão diferencial entre dois ou mais tipos de amostras
– Respostas a fatores ambientais
– Processamento de doenças (ex: câncer)
– Efeito de drogas
– Identificação de genes associados com resultados clínicos (ex: sobrevida)

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☺TISSUE MICROARRAY:
Produção de um bloco de parafina com múltiplas amostras teciduais (até 1000), de 0,6 a
2mm.

Comparação : cDNA microrray x tissue microarray

Diagnóstico em Câncer de Mama: Tissue-Microarray (TMA)- Avalia um único gene,

porém em grandes quantidades de amostras tumorais.
- A partir de uma secção histológica - avaliação da heterogeneidade tumoral.

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Tecnologia de bioinformática:

→ uma nova disciplina científica com raízes nas ciências da computação, na

estatística e na biologia molecular.
→ é responsável por armazenar e relacionar dados biológicos, com o auxílio de
métodos computacionais e algoritmos matemáticos.

►Usos:
-análise de genomas.
-Prever estruturas e resultados, estudar e simular o metabolismo de células,
-construir árvores evolutivas,
-estudar estruturas tridimensionais de moléculas,
-analisar imagens e sinais biológicos,
-desvendar a função biológica de determinada sequência de DNA.

→Um bioinformata, além de dominar conhecimentos específicos da Biologia,

como a Biologia Molecular, deve ser capaz de desenvolver programas e também
utilizar aqueles que não foram feitos por ele. A linguagem de programação
amplamente adotada por esses profissionais é a PERL (Practical Extract and
Report Language).
→O armazenamento de informações em um banco de dados permite que
pesquisadores de todo o mundo compartilhem informações, sendo o GenBank um
dos mais conhecidos e completos.

Contribuição que a informática trouxe ao desenvolvimento da genômica:

-um novo gene, com cerca de 12 mil bases pode ter sua seqüência decifrada em 1
minuto, há 3 anos atrás a mesma tarefa levaria 20 minutos e há 20 anos, mais ou
menos 1 ano.

►Bancos de dados públicos em bioinformática:

Genbank - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Banco de dados americano de seqüências de DNA e proteínas.

EBI http://www.ebi.ac.uk/
Banco de dados europeu de seqüências de DNA.

PDB http://www.rcsb.org/pdb
Armazena estruturas tridimensionais resolvidas de proteínas.

GDB http://gdbwww.gdb.org/
Banco de dados oficial do projeto genoma humano.

KEGG http://www.genome.ad.jp/kegg/
Banco com dados de seqüências de genomas de vários organismos diferen-
tes e informações relacionadas às suas vias metabólicas.

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AS APLICAÇÕES DA BIOTECNOLOGIA:

-Aplicações comerciais em três mercados: cuidados de saúde humana, agricultura

e gerenciamento ambiental.
1- Biotecnologia médica fornece testes diagnósticos mais rápidos e precisos,
compostos terapêuticos com poucos efeitos colaterais e vacinas mais seguras.
 Diagnóstico: ácidos monoclonais, biossensores, sondas de DNA, chips de DNA,
RFLP e PCR.
 Terapêutica: produtos naturais como fármacos (cultura celular)
Ex.: 2.400 kg de esponjas 1mg de uma droga anticâncer! Economicamente inviável
e desastre ecológico.

- Agentes terapêuticos endógenos:

* interleucina – 2 (ativa as células T)
* eritropoictina (regula a produção dos eritrócitos)
* ativados de plasminogênio do tecido (dissolve coágulos sanguíneos)

-Biopolímeros como recursos médicos:

*Carboidrato hialuronato (substância solúvel em água, viscosa, elástica, semelhante ao

plástico): usado no tratamento da artrite, prevenção de cicatrizes pós-cirúrgicas, cirurgias
de catarata e na embalagem de fármacos.

*Polímeros de proteínas adesivas derivadas de organismos vivos e que estão

substituindo suturas e grampos na cicatrização de feridas.

*Quitina combinada com uma fibra natural cria um material que limita o crescimento de
bactérias e fungos.

-Desenho de drogas utiliza princípios da engenharia de proteínas e modelagem

molecular computacional.

-Terapia de substituição – substituir produtos de genes defeituosos:

EX:
a) FATOR VIII coagulação, a falta leva a hemofilia.

b) INSULINA

-Uso de plantas (tabaco, milho e soja) e animais transgênicos (cabras e ovelhas) na

produção de medicamentos.

-Terapia gênica administração de genes funcionais aos pacientes para substituição de

seus genes defeituosos.
Ex: deficiência de Adenosina desaminase (ADA).

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-Terapia celular – substituição de células que estão funcionando mal por versões
saudáveis das mesmas.
Ex: Diabetes tipo I (destruição das ilhotas de Langerhans), pacientes com distrofia
muscular.

-Terapias imunossupressivas com Ac monoclonais que inativam proteínas na

superfície do LT. Usos: evitar rejeição de órgãos transplantados, doenças auto-imunes
(artrite reumatóide e esclerose múltipla)

-Terapias contra o câncer agentes quimioterapêuticos derivados de plantas e Ac

monoclonais que liberam seletivamente toxinas para combater os tumores. Bloqueio de
oncogenes (tecnologia antisenso), vacinas anticâncer, proteínas endógenas interleucinas
e Fator de necrose tumoral (estimula o ataque do S.I) e peptídeos antiangiogênicos
(endostatinas).

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-Desenho e produção de Vacinas vacinas de DNA.

- Vacinas atuais (varíola, pólio, difteria, tétano, sarampo): vírus mortos ou atenuados.
-Problemas: reações alérgicas, dores febre e até a própria doença, produção em larga
escala.
-Solução: engenharia genética:

Vacinas desenvolvidas pela técnica: hepatite B e meningite.

Perspectivas: utilização de plantas e animais geneticamente modificados para a
produção de antígenos a serem utilizados em vacinas via oral.
Ex: cabras geneticamente modificadas para produzir um antígeno de malária no leite,
bananas contendo vacinas contra hepatite e batatas contendo vacina para E. coli e cólera.

-Ferramentas para a Pesquisa Médica: proporciona um profundo conhecimento dos

sistemas biológicos.
Ex: mutações direcionadas ou nocaute de genes.

Identificação Humana por DNA

•Exames de paternidade e maternidade

•Casos Forenses
•Identificação de Múmias
•Descendência Familiar
•Sexagem de animais e bebês humanos

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Polimorfismos mais utilizados: variable number of tandem repeats (VNTRs) e

restriction fragment length polymorphism (RFLPs) → São hereditários como
nossos genes!!!

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BIOLOGIA MOLECULAR MÉTODOS TRADICIONAIS E

ANÁLISES CLÍNICAS

ETAPAS DO DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Coleta de Amostras para obtenção do DNA:

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