Laboratorio de Microbiología de Alimentos Grupo 1.

Profesores Hugo y Martha

Protocolo de extracción de DNA genómico bacteriano usando el Kit Comercial Roche TM
HIGH PURE PCR TEMPLATE PREPARATION KIT Roche

COMPONENTES DEL KIT

VIAL/TAPA ETIQUETA CONTENIDO/FUNCIÓN
1 Buffer de lisis para tejidos 20 mL
Blanca (Tissue Lysis Buffer) [urea 4M, Tris 200mM, NaCl 20 mM,
EDTA 200 mM pH 7.4 (+25ºC)]
2 Buffer de enlace 20mL
Verde (Binding Buffer) [guanidin-HCl 6M, urea 10 mM, Tris-HCl
10 mM, Tritón X100 20% (v/v), pH 4.4
(25ºC)]
3 Proteinasa K recombinante, grado PCR Liofilizado
Rosa (Proteinase K, recombinant PCR grade) Para muestras de lisis e inactivación de
DNAasas
4a Buffer de remoción de impurezas 33 mL, agrega 20 mL de etanol absoluto
Negra (Inhibitor Removal Buffer) [guanidina-HCl 5M, Tris-HCl 20 mM, pH
6.6 (25ºC)]; concentración final después
de agregar etanol
4 Buffer de lavado 20 mL, agrega 80 mL de etanol absoluto
azul (Wash buffer) [NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, pH 7.5
(25ºC); concentraciones finales después
de agregar etanol
5 Buffer de elución 40 mL
Incoloro (Elution buffer) [Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 (25ºC)]
Tubos con filtro para purificación alta Dos bolsas con 50 tubos de
(High Pure Filter Tubes) polipropileno, con dos capas de fibra de
vidrio, para uso con 700 µL de volumen
de muestra
Tubos de colecta Ocho bolsas con 50 tubos de
(Collection Tubes) polipropileno (2 mL)

METODOLOGÍA

ETAPA 1. LISIS Y ENLACE DEL DNA

Protocolo para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de 109 células de bacterias o bien 108 células
de levaduras.
Antes de iniciar la reacción de purificación, calentar el buffer de elución a 70ºC

1. A un tubo de microcentrífuga libre de nucleasas:

Agrega 200 µL de células de bacteria o levadura.
Centrifuga por 5 min a 3,000 x g
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Resuspende el pellet (paquete celular) en 200 µL de buffer PBS (buffer de fosfato de potasio 0.1
mM pH 7.0)

2. Para Bacterias: Agrega e incuba 5 µL de lisozima [10 mg/mL disuelto en 10 mM de Tris-HCl pH

8.0], e incuba a 37ºC/15 min.
Para Levaduras: Agrega e incuba 10 µL de liticasa [0.5 mg/mL], e incuba a 37ºC/30 min.

3. A la muestra:
Agrega 200 µL de buffer de enlace.
Agrega 40 µL de Proteinasa K reconstituída.
Mezcla de inmediato e incuba a 70ºC/ 10 min.

4. Agrega 100 µL de isopropanol y mezcla bien.

5. Ensambla el Tubo Filtro para Alta Purificación dentro de un Tubo de Colecta.

Pipetea el líquido de la muestra dentro de la parte superior del Tubo Filtro.
Inserta el tubo filtro ensamblado dentro de una microcentrífuga.
Centrifuga a 8,000 x g / 1 min

6. Procede a la etapa de lavado y elución.

NOTAS: Generalmente, las levaduras se lisan por incubación con liticasa, sin embargo, las siguientes
cepas de levaduras o mohos, pueden también lisarse con el tratamiento de lisozima:
• Saccharomyces cerevisiae
• Aspergillus fumigatus
• Candida albicans

ETAPA 2: PROTOCOLO PARA LAVADO Y ELUCIÓN

1. Despues de centrifugar:
Remueve el Tubo Filtro del Tubo de Colecta. Descarta el filtrado y el Tubo de Colecta
Ensambla el Tubo Filtro a un nuevo Tubo de Colecta.
Agrega a partir de la parte superior del Tubo Filtro, 500 µL de Buffer de Remoción de Inhibidores.
Centrifuga a 8,000 x g por 1 min.

2. Remueve el Tubo Filtro del Tubo de Colecta. Descarta el filtrado y el Tubo de Colecta.
Ensambla el Tubo Filtro a un nuevo Tubo de Colecta.
Agrega a partir de la parte superior del Tubo Filtro, 500 µL de Buffer de Lavado.
Centrifuga a 8,000 x g por 1 min.

3. Remueve el Tubo Filtro del Tubo de Colecta. Descarta el filtrado y el Tubo de Colecta.
Ensambla el Tubo Filtro a un nuevo Tubo de Colecta.
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Agrega a partir de la parte superior del Tubo Filtro, 500 µL de Buffer de Lavado.
Centrifuga a 8,000 x g por 1 min. Descarta el filtrado.

4. Después de descartar el filtrado:

Centrifuga de nuevo todo el Tubo de Colecta con el Tubo Filtro ensamblado a alta velocidad por 10
seg.
Descarta el filtrado.

Este paso de centrifugación adicional remueve el Buffer de Lavado residual.

5. Para eluir el DNA:

Inserta el Tubo Filtro dentro de un microtubo de centrífuga de 1.5 mL de capacidad.
Agrega a partir de la parte superior del Tubo Filtro 200 µL de Buffer de Elución pretemperado a
70ºC.
Centrifuga de nuevo todo el Tubo de Colecta con el Tubo Filtro ensamblado a 8,000 x g / 1 min.

6. El Tubo de microcentrífuga ahora contiene el DNA eluído.

Almacena el microtubo entre -15ºC a -20ºC para análisis posteriores.